Name: 기능성 및 편광 담즙 상피 낭종의 생성 및 정량적 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 배우세요 하이드로겔 기반 담즙 상피 낭종 생성 및 정량적 특성화 방법을 통해 3D 세포 시스템에서 기관형성을 연구하는 기법입니다. 이 프로토콜은 담즙 질환의 치료 표적 발굴과 질병 메커니즘 이해에 활용됩니다.

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NRC 세포주를 친절하게 제공한 니콜라스 라루소 박사(미국 미네소타 주 로체스터 클리닉)에게 감사드립니다.
이 작품은 iLite RHU 프로그램 (ANR-16-RHUS-0005 부여)과 DHU 간염노프 모두의 재정 지원을 받았습니다.
이사벨 가르신과 레소 디오 디스토리 셀룰레르 파리 사클레이가 이미징에 대한 지원을 해준 것에 감사드립니다.

<ol><li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
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<li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li>
<li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417(2019).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. 0 (0), (2019).</li>
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<li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Molecular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Annexin+V%2FPropidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597(2011).</li>
<li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+Cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li>
<li>Spirlì, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polarity+of+Na%2B%2FH%2B+and+Cl-%2FHCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li>
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3D 세포 구조의 유기 발생 및 유지를 연구하기 위해 다양한 조직을 모델링하여 서로 다른 세포 기원뿐만 아니라 합성 하이드로겔8,9,10,21을포함한 다른 유형의 세포 행렬을 사용하여 모델링되었습니다. 그러나, 3D 정량분석의 부족으로 인해 오르가노이드 형성또는 기능성7,8,9,10,15,18,하이드로겔 또는 약물 스크리닝을 위한 추가 표준화의 관점에서...

지난 3년 동안 체외 연구 분야는 3D 문화 시스템으로 발전했습니다. 스캐폴드/매트릭스의 존재 또는 부재에서 스페로이드 또는 응집체로서, 낙하, 동요, 미세유체 장치 또는 부동1으로3D로 세포를 배양하기 위한 다수의 프로토콜이 등장하였다. 3D 배양 방법의 사용은 2차원 (2D) 배양, 특히 낭종 또는 아시니에게 불린 3D 구조물에서 자기 조직하는 것을 보여주었다 상피 세포에 대한 그것의 이점을 입증했습니다. 이 경우, 세포는 루멘을 둘러싸고 있는 단층층을 형성하며, 여기서 세포는 생리학적 특이적 기능2를개선하여 완전한 상피 표현형을 획득한다.
수많은 연구는 자연 행렬에서 이러한 상피 오르가노이드를 형성하기위한 방법의 개발에 기여했다. 이는 생체 내 세포 세포 및 세포-미세 환경 상호 작용에서 회수할 수 있게 하여 상피 표현형3,4,5,6,7의확립 및 안정성을 얻을 수 있다. 최근에는 이식 가능한 오르가노이드를 개발하고 상피 프로그램을 조율하기 위한 미세 환경의 요구 사항을 해독하는 것을 목표로, 합성 하이드로겔은 상피 아시니8,9,10의형성을 향상시키기 위해 개발되었다. 안타깝게도, 이러한 연구는 질적 데이터를 보고하거나, 2D 평면8,9,10에서비낭종에 대한 낭종의 비율과 같은 내부 참조를 사용하여 계산 방법을 제시한다. 이것은 상피 오르가노이드의 효율성, 안정성, 또는 형태학적 및 생리적 특성의 관점에서 다른 연구 사이의 비교를 배제합니다.
미세 유체 장치를 사용하여 구슬에 있는 상피 세포의 미크로캡슐화는 보다 현실적인 정량적 및 비교 결과를 허용했습니다. 이 기술을 이용하여, 다양한 세포 유형으로부터의 오르가노이드가 형성되고 상이한 3D 세포구조(11,12)의형태에 기초하여 분화되었다. 그러나 이 기술은 작업하기 쉽지 않으며 미세 유체 장치를 생산하기 위해 클린 룸을 사용해야 합니다. 이 기술은 몇 가지 유형의 하이드로겔에 대해 확립되었지만 다른 하이드로겔에 기술적 적응을 적용하여 다재다능함을 제한해야 합니다. 따라서 상피 오르가노이드를 개발하기위한 대부분의 연구는 하이드로 겔 벌크에 상피 세포의 포함에 의존합니다. 이러한 방법에서, 겔 구조화 및 세포 분포의 높은 이질성은 전체 3D 배양 내부의 종종 소홀히 한다. 따라서 대부분의 분석은 전체 3D 볼륨에서 다양한 셀룰러 개체의 분포만 극히 대략적인 단일 2D 이미지와 관련이 있습니다.
담관에 영향을 미치는 질병, 이러한 담관 아크라키종 등, 담즙 atresia, 1 차 경화 담관염, 다른 사람의 사이에서, 사망률과 이환율의 주요 원인입니다. 간 이식을 제외하고, 이러한 조건에 대한 효과적인 치료법은없다(13). 담관 형성, 질병 원인 및 진행을 조사하는 노력은 새로운 치료법14의개발을 허용할 것입니다.
낭종, 스페로이드 또는 튜브와 같은 구조의 담즙 조직 모델-일반 또는 환자 유래, 분화, 또는 선조 유래 담랑고이오시테 세포주15,16,17,18,19,20이개발되었다. 다양한 연구는 cholangiocyte 극성을 recapitud, cholangiocyte 마커의 표현, 섬모의 존재, cholangiocyte 분비 및 재봉 능력, 루멘 형성 및 방해; 이 모든 것은 cholangiocyte 표현형, 형태학 및기능(15,17,19)의중요한특성을나타낸다. 그 외는시간 20의장기간 동안 환자 유래 담즙 유기체의 유지 보수를 보고했습니다. 최근에는 담즙 낭종 유기발생에 대한 생화학적 및 생물리학적 단서의 역할을조사했다. 중요하게도, 담즙 아레시아의 병기 발생은 담즙 스페로이드 및 튜브7,22에서공부되었다. 또한, 담랑고이테 노화, 프로 염증성 사이토카인의 분비, 대식세포 모집 등 1차 경화질담염의 주요 특징은 담즙 구형 구형15,20을사용하여 성공적으로 연구되었다. 그러나, 이러한 질문을 해결할 수 있는 생리학적으로 콜린고이트 표현형, 생리학 및 미세 환경을 조절하는 체외 3D 정량적 모델에서 재현가능한 것은 여전히 필요하다. 더욱이, 낭종 형성효율(21,23)을보고한 간행물은 극소수에 불과하다. 이것은 특히 조직발생, 질병 원인 및 cholangiocyte 기능 및 편광을 가진 약물 반응의 상관 관계를 조사할 때 확립하는 중요한 포인트입니다. 또한 프로토콜에서 프로토콜로 사용되는 스캐폴드/매트릭스의 차이로 시스템 간에 비교하기가 어렵습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 루멘 형성, 담랑고이트 편광 및 cholangiocyte 분비 기능을 모방한 담즙 낭종을 생성하는 정량적이고 신뢰할 수 있으며 보편적인 방법을 제안합니다. 중요한 것은 시간이 지남에 따라 평가할 때 3D 젤을 통해 Z축을 따라 수행되는 체계적인 분석, 낭종 형성 효율, 크기, 생존가능성, 편광 및 기능을 제시합니다. 더욱이, 우리는 자연 하이드로겔 및 일반 쥐 cholangiocytes (NRC)s를 프로토콜에 대한 예로 사용하지만, 다른 천연 또는 합성 하이드로겔뿐만 아니라 상피 세포는 3D 낭포성 구조의 형성에 사용될 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>10 & 마이크로; l- Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; l - 피펫 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; l - 피펫 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l - 피펫 Eppendorf Research Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>VWR</td><td>20104-298</td><td>0.02N 최종</td></tr><tr><td>에어로졸 장벽 피펫 팁 10 &마이크로; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707439</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 배리어 피펫 팁 1000 &마이크로; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707404</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 차단 피펫 팁 200 &마이크로; l (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2707430</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진충 용액 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td>NRC 완전 배지 최종 농도 = 1:100 희석</td></tr><tr><td>소 뇌하수체 추출물</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13028-014</td><td>NRC 완전 배지 최종 농도 = 30 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>1:1000 희석</td></tr><tr><td>화학적으로 정의된 지질 농축액(100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11905-031</td><td>NRC 완전 중간 최종 농도 = 1:100 희석</td></tr><tr><td>콜라겐 고농도, 쥐</td>꼬리 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>354249</td><td>50 &micro; g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 0.393 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331-020</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 1X</td></tr><tr><td>E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32178</td><td>1:400 희석</td></tr><tr><td>Eclipse TE300 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미징</td></tr><tr><td>에탄올 아민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 0.32 mM</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 5:100 희석</td></tr><tr><td>DAPI가 있는 Fluoroshield (장착 매체)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 16% (W/V)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28906</td><td>4% (W/V)</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210-064</td><td>1:10 희석</td></tr><tr><td>Hamamatsu 카메라 (디지털 카메라 C11440 ORCA - 플래시 4.OLT)</td> <td>Hamamatsu</td><td></td><td>이미징</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155</td><td>5 &micro; g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 염소 안티 토끼, Alexa Fluor Plus 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32733</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>ImageJ 버전 2.0.0-rc-69/1.52n</td><td></td><td></td><td>오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어</td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51300-044</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 1:100 희석</td></tr><tr><td>L-글루타민 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 1:100 희석</td></tr><tr><td>Matrigel GFR (스톡 농도 9.7 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>356231 4:10 희석</td></tr><tr><td>NIS Elements 소프트웨어 버전 4.50.00</td><td>Nikon</td><td></td><td>이미지 획득 및 디스플레이</td></tr><tr><td>Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-035</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 1:100 희석</td></tr><tr><td>Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&infin;/1.2 WD 15.2)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>20 &micro; g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>16.2 nM 최종 농도</td></tr><tr><td>Sir-Actin/Verapamil kit</td><td>Spirochrome</td><td>SC001</td><td>10 &micro; M 최종 농도</td></tr><tr><td>대두 트립신 억제제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td>NRC 완전 매체 최종 농도 = 50 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>멸균 세포 스트레이너 40 &micro; m (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 10 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫 5 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>멸균 튜브 1.5 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11926955</td><td></td></tr><tr><td>멸균 튜브 15 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7200886</td><td></td></tr><tr><td>멸균 튜브 50 mL (Fisherbrand)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>553913</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>5:100 dilution</td></tr><tr><td>조직 배양 처리 플라스크 25cm2 (Falcon)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>5:1000 희석</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%) 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>1X</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>5:10000 희석</td></tr><tr><td>비타민 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-037</td><td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td><td>Clinisciences</td><td>80826</td><td></td></tr></tbody></table>

기능성 및 편광 담즙 상피 낭종의 생성 및 정량적 특성화

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

간에서 담관을 정렬하는 상피 세포인 Cholangiocytes는 담즙 형성 및 수정을 감독합니다. 지난 20년 동안 간 질환의 맥락에서, 통기성, 스페로이드 또는 튜브와 같은 구조에 기초한 3차원(3D) 모델이 조직발생, 질병 모델링 및 약물 선별 연구를 위한 조직 토폴로지를 모방하였다. 이러한 구조는 주로 하이드로겔에 담고치오시테를 포함시킴으로써 얻어졌다. 주요 목적은 상피 극성, 기능 및 형태학적 특성을 해결하여 자기 조직을 연구하는 것이었습니다. 그러나, 아주 몇몇 연구 결과는 낭종 형성 효율성에 집중합니다. 이 경우 효율성은 종종 단일 평면의 이미지에서 정량화됩니다. 기능적 분석 및 구조적 분석은 하이드로겔 중합이질 및 부작용으로 인해 발생하는 낭종 분포의 잠재적 이질성을 나타내지 않고 수행된다. 따라서 정량적 분석이 완료되면 한 문서에서 다른 아티클으로 비교하는 데 사용할 수 없습니다. 더욱이, 이 방법론은 다른 행렬 및 세포 모형의 3D 성장 잠재력의 비교를 허용하지 않습니다. 추가적으로, 면역 염색 낭종에 대한 실험 적인 문제 해결의 아무 언급도 없습니다. 본 문서에서는, 우리는 초기 세포 분포가 낭종 형성의 이기종 수직 분포와 관련이 있음을 보여주기 위해 신뢰할 수 있고 보편적인 방법을 제공한다. 하이드로겔에 내장된 Cholangiocyte 세포는 10일 의 시간 과정을 통해 하이드로겔 깊이를 따라 Z 스택 분석을 따릅니다. 이 방법을 통해 낭종 형성 효율및 성장의 견고한 운동학이 얻어진다. 우리는 또한 낭종 극성 및 분비 기능을 평가하는 방법을 제시합니다. 마지막으로 이미징용 낭종 붕괴를 제한하기 위해 면역 염색 프로토콜을 최적화하기 위한 추가 팁이 제공됩니다. 이 접근법은 다른 3D 세포 배양 연구에 적용될 수 있으므로 한 시스템을 다른 시스템과 비교할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

낭종의 형성 과 특성화 3D 세포 배양 시스템은 유기 발생 및 질병모델링(25)을연구하는 중요한 도구이다. 불행하게도, 이들 방법의 대부분은 다양한연구7,8,9,10,15,18,23사이의 낭종 형성 효율의 관점에서 비교를 방지, 가변적이고 종종 불특정 볼륨, 비 낭종 대 낭종의 수를 비교하여 단일 평면에서 수행 된 정량화 또는 내부 정량화를 사용합니다. 본 프로토콜에서 제안된 방법은 실험 시동안 낭종과 각각의 크기의 전체 수를 기록함으로써 ...

3차원(3D) 셀룰러 시스템은 유기발생을 조사하기 위한 관련 모델이다. 담즙 낭종 생산 및 특성화를 위한 하이드로겔 기반 방법이 제안됩니다. 이 프로토콜은 낭종 형성 효율, 크기를 평가하고 기능을 테스트하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법으로 3D 특성화의 장벽을 해명합니다.

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

이것은 담즙 낭종을 생성하기위한 첫 번째 프로토콜로 시간이 지남에 따라 낭종 형성, 효율성 및 크기를 평가 할 수있는 체계적인 분석을 제공합니다. 이 방법은 상피 낭종 형성의 정량적 평가를 허용하고 상피 세포 또는 하이드로겔의 유형의 함수로서이 과정을 평가 할 수 있게합니다. 담즙 무질서를 위한 치료 선택권이 제한되기 때문에, 이 프로토콜은 약 연구 표준화를 위한 문을 열고, 일반적인 치료 표적을 확인하고, 질병 기계장치를 이해하기 위한 문을 엽니다.간단한 방법은 관 구조 필드의 생물 공학 내에서 새로운 정보의 메커니즘에 대한 중요한 질문을 해결할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 섭씨 4도에서 적절한 하이드로겔 용액을 해동하고 시원한 파이펫 팁과 하룻밤 사이에 영하 20도의 8개의 우물 챔버 슬라이드를 해동하십시오. 다음 날에는 하이드로겔과 8개의 웰 챔버 슬라이드를 얼음 위에 놓고 차가운 일반 쥐 cholangiocyte 에 적절한 양의 하이드로겔을 추가하여 40% 하이드로겔 용액 500 마이크로리터를 획득합니다.그런 다음 차가운 파이펫 팁을 사용하여 챔버 슬라이드의 각 웰의 중앙에 50 마이크로 리터의 하이드로겔 용액을 추가하고 파이펫 팁을 사용하여 거품없이 가능한 한 우물 바닥의 전체 표면에 용액을 균등하게 분산시다. 실험을 위해 세포를 준비하기 위해 하이드로겔이 중합화되는 동안, 70%의 컨플루우블 일반 쥐 담랭고이트 배양으로부터 세포를 미리 따뜻하게 한 PBS로 세척하고 세포 배양인에서 20분 동안 신선한 사전 따뜻해진 PBS5밀리리터로 세포를 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS를 미리 따뜻하게 한 트립신-EDTA의 1밀리리터로 교체하고 플라스크를 세포 배양 인큐베이터로 5~10분 동안 되돌려 보세요.세포가 분리되면, 미리 따뜻워진 완전한 정상 쥐 cholangiocyte 배지의 4 밀리리터로 반응을 중화시키고 원심분리를 위해 15 밀리리터 튜브로 세포를 이송한다. 그런 다음 미리 데운 배지의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 40 미크론 여과기를 통해 셀을 50 밀리리터 튜브로 필터링하여 계산합니다. 낭종을 생성하기 위해, 차가운 완전한 정상 쥐 cholangiocyte 배지에 하이드로겔의 적절한 부피를 추가하여 얼음에 80% 하이드로겔 용액의 1, 600 마이크로리터를 획득하고 1, 600 마이크로리터의 밀리리터당 5배 내지 10내지 세포를 희석시키는 중간 크기의 1, 600 마이크로리터를 한다.즉시 셀과 하이드로겔 세포 솔루션을 혼합하고 거품을 피하기 위해 주의를 기울여 하이드로겔 코팅 챔버 슬라이드의 각 웰에 400 마이크로 리터의 셀을 추가합니다. 재현 가능하고 중요한 결과의 획득을 보장하기 위해 하이드로겔을 신중하게 처리하고 초기 셀 수소 용액을 철저히 혼합하여 균일한 용액을 확보해야 합니다. 모든 세포가 시드되면 셀 배양 배양 인큐베이터에 슬라이드를 놓습니다.문화가 이틀 후, 각 우물의 한 구석에서 250 마이크로리터를 제거하고 하이드로겔을 씻어내지 않도록 주의하고, 버려진 상체를 250 마이크로리터의 신선한 배양 배지로 천천히 교체한다. 낭종 이미징의 경우 적절한 문화의 날에 이미지 수집 소프트웨어가 장착된 위상 대비 현미경에서 10 X 목표를 선택하고 흰색 램프를 켜고 밝은 필드 이미징 옵션을 선택합니다. 재생을 선택하여 카메라를 켜고 낭종 필드에 집중합니다.노출 시간을 설정하고 자동 캡처 폴더 창을 열어 이미지를 자동으로 절약할 수 있습니다. 캡처 Z 시리즈 창을 열고 기본 위치를 재설정하고 Z-나사를 사용하여 Z 스택의 상단 및 하단 평원을 정의하고 목표와 해상도 수준에 따라 Z 단계를 조정합니다. 그런 다음 지금 실행을 클릭하여 인수를 시작합니다.이미징 후 피지에서 Z 스택을 엽니다. 스택을 복제하려면 이미지, 중복 및 중복 스택을 클릭합니다. 중복된 스택에서 최소 강도 투영을 만들려면 이미지 메뉴 에서 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다.프로젝션 유형에 대한 최소 강도를 선택하고 확인을 클릭합니다. 프로젝션에서 배경을 빼려면 프로세스 메뉴 에서 배경을 빼고 500픽셀의 롤링 볼 반지름과 라이트 배경을 선택하여 낭종을 배경보다 더 대조하게 합니다. 대략적인 낭종 직경을 측정하려면 대상 낭종을 확대/축소하고 직선 도구를 선택하고 키보드의 T 버튼을 누릅니다.최종 투영에 각 낭종의 직경에 선을 그립니다. 각 낭종에 대해 생성된 다음 관심 영역이 관심 영역 관리자 영역에 추가됩니다. 모든 낭종이 계산되면 Z 스택 창을 클릭하여 선택하고 모두 표시하여 계산된 낭종을 확인합니다.Z 스택을 따라 커서를 이동하여 각 이미지에 모든 낭종이 계산되었는지 확인하고 필요에 따라 관심 관리자 영역에 새 낭종을 추가합니다. 모든 낭종이 계산되면 관심 영역 집합을 선택하고 더 많이 클릭하고 저장하여 데이터를 저장합니다. 관심 영역이 여전히 선택된 각 낭종의 크기를 확인하려면 측정값을 클릭합니다.각 낭종을 나열하는 창과 예상 크기가 나타납니다. 그런 다음 CSV 형식으로 데이터를 저장합니다. 입증 된 바와 같이, 시간이 지남에 따라 낭종의 수와 각각의 크기를 기록하면 낭종 형성과 성장의 진화를 분석 할 수 있습니다.시작 세포 인구와 10 일 된 낭종의 생존능력은 라이브 / 죽은 염색에 의해 평가 될 수있다. 죽은 세포는 10 일에 세포 인구의 3% 미만을 나타내고 일부 괴사 세포 파편이 일부 큰 낭종 내에서 관찰되지만, 일부 괴사 세포 파편이 관찰되지만, 주로 격리 된 세포 또는 작은 골재의 일부로 낭종 외부에 위치하고 있습니다. 플루오레세인 이아세테이트와 Hoechst를 가진 잠복은 기저에서 정색 발광 공간으로 플루오레세인의 형성 그리고 분비의 평가를 허용합니다.특히, 형광제의 분비는 다중 약물 내성 억제제로 전처리에 의해 억제되며, 루멘 내형형형광체가 축적되어 다중 약물 내성 수송기를 통한 분비로 인한 것이며 세포간 공간에서 누출되지 않는다는 것을 나타낸다. E-cadherin 발현에 대한 염색은 정상적인 쥐 콜린고이테스가 적어도 10 일 동안 하이드로겔에서 상피 표현형을 유지한다는 것을 밝힙니다. 면역형광 평가를 위한 낭종을 준비할 때, 소 혈청 알부민을 포화 시 0.1% 이하로 유지하는 것은 낭종 의 고결성을 유지하는 데 핵심이며, 이는 낭종 후퇴와 루멘 붕괴의 결과로 서식성 무결성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 한다.하룻밤 하이드로겔, 해동, 파이펫 팁 및 챔버 슬라이드 레코딩, 얼음 작업 및 균질세포 하이드로겔 혼합물을 배양 챔버 슬라이드에 균일하게 퍼뜨리는 것은 모두 실험적 성공에 매우 중요합니다. 이 방법은 상피 편광의 더 나은 이해를 위한 비교를 허용하는 그밖 상피 세포 또는 하이드로겔에서 낭종을 생성하는 것을 이용할 수 있습니다. 이 정량적인 방법은 담즙 기능 및 유기 발생에 약 또는 유전 돌연변이의 효력을 시험하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

신생아 생쥐의 간외 담관에서 cholangiocytes을 분리하는 기술을 설명한다. 덕트 꼼꼼하게 해부 한 다음 세포는 두꺼운 콜라겐 젤의 부산물에 의해 격리됩니다. 이 방법은 간외 담관 개발 및 병리 공부를위한 유용한 도구를 제공합니다.

신생아 간외 Cholangiocytes의 분리

신 세뇨관 상피에서 발현 이온 채널은 다낭성 신장 질환의 병리에 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 갓 쥐의 신장에서 분리 낭포 성 상피 세포에서 패치 클램프 분석 및 세포 내 칼슘 수준 측정을 수행하는 데 사용되는 실험 프로토콜을 설명합니다.

패치 클램프 및 라이브 형광 현미경을 구현 갓 고립 PKD 상피 세포의 기능적 특성을 모니터링하려면

C. 선 충 배설 운하 드 노 보 편광 막 속의 시각적 vivo에서 분석에 대 한 고유한 단일 셀 모델입니다. 이 프로토콜 표준 유전 RNAi 및 이미징 접근, 식별 및 분자 단 세포 tubulogenesis, 그리고 꼭대기 막 및 루멘 속 감독의 특성에 대 한 적응의 조합을 설명 합니다.

세포내 루멘 Morphogenesis 그리고 Vivo에서 편광 막 속 단일 셀에 대 한 모델로 선 충 C. Excretory 운하: GFP 융해, RNAi 상호 작용 화면 및 이미징 라벨

여기 우리 인간의 비 강 상피 세포의 3 차원 회전 타원 체 문화를 생성 하는 방법을 설명 합니다. Spheroids는 다음 드라이브 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR) 자극-종속 이온 및 액체 분 비, CFTR 함수에 대 한 프록시로 회전 타원 체 luminal 크기의 변화를 측정.

개별된 낭 성 섬유 증 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 연구에 대 한 인간의 비 강 상피 세포 Spheroids의 생성

이 프로토콜 마우스 extrahepatic 담 즙 덕트 3 차원 organoid 시스템의 생산을 설명합니다. 이러한 담 즙 organoids cholangiocyte 생물학 연구 문화에서 유지할 수 있습니다. 담 즙 organoids 조상 및 담 즙 셀의 마커를 표현 하 고 편광 된 상피 세포의 구성 됩니다.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

우리는 마우스 간에서 담관 밀도의 정확한 정량화를 위한 다소 간단하고 민감한 방법을 제시합니다. 이 방법은 유전 및 환경 수정자의 효과와 담즙 질환의 마우스 모델에서 잠재적 인 치료의 효과를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스 간에서 담관 밀도 결정

이 프로토콜은 마우스에서 가능한 정밀 절단 간 조각의 생산을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. ex vivo 조직 샘플은 여러 날 동안 실험실 조직 배양 조건 하에서 유지될 수 있으며, 간 병리학을 검사하는 유연한 모델을 제공합니다.

뮤린 정밀 절단 간 슬라이스 간 생물학의 Ex Vivo 모델로

쥐 신생아 담관 장애를 관찰하려면 손상되지 않은 담관과 효율적인 준비가 필요합니다. 따라서 쥐 신생아에서 전체 간외 담관 시스템을 분리하기위한 새로운 접근법이 담관의 완전성을 유지하면서 성공적으로 개발되었습니다.

9 일 된 마우스 신생아의 간외 담관 및 담낭 박리

정렬 심근 조직의 생성 임상 유용한 목적에 줄기 세포 생물학의 최근 발전을 조절하기위한 중요한 요구 사항입니다. 여기에 우리는 세포의 형태와 기능의 정확한 제어를위한 microcontact 인쇄 방법을 설명합니다. 심장 progenitors을 파생 배아 줄기 세포의 높은 정화 인구 사용하여, 우리는 비 등방성 기능 심근 조직을 생성합니다.

Microcontact 인쇄를 통해 정렬 기능 심근 조직의 생성

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

배우세요 하이드로겔 기반 담즙 상피 낭종 생성 및 정량적 특성화 방법을 통해 3D 세포 시스템에서 기관형성을 연구하는 기법입니다. 이 프로토콜은 담즙 질환의 치료 표적 발굴과 질병 메커니즘 이해에 활용됩니다.

기능성 및 편광 담즙 상피 낭종의 생성 및 정량적 특성화

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