Name: 고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 학습하세요 96웰 플레이트 로딩을 통한 고처리량 DNA 추출 방법으로 오염 위험을 효과적으로 감소시키는 기술을. 마이크로바이옴 연구에서 샘플 무결성을 확보하는 혁신적인 프로토콜입니다.

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이 연구는 NSF 상 #EPS-1655726에서 자금조달과 미생물 생태 협력에 의해 지원되었다.

1. 실험실 벤치 및 96 웰 플레이트를적재딩하기 위한 공구 준비
<ol><li>70%에탄올로 미스티로 벤치 탑을 클리어합니다. 10% 표백제로 벤치 탑을 뿌리기 전에 공기를 닦고 건조시키십시오. 벤치 탑을 말리십시오.</li>
	<li>마이크로 스쿠뮬라, 주걱 및 외과 가위 (곡선)를 95 %에탄올에 담근 다음 화염에 노출하여 살균하십시오. 각 10%의 표백제에 담그고 사용하기 전에 공기 건조를 허용합니다. 참고: 각 샘플 간에 도구를 소독해야 합니다.</li>
</ol>2. 하위 샘플링 및 샘플 준비
<ol><li>서브 샘플링 전에 에탄올을 사용하여 장갑을 살균하십시오.</li>
	<li>하위 샘플링 전에 토양 샘플을 균질화합니다.</li>
	<li>멸균 도구를 사용하여 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브를 샘플로 적재하여 약 절반까지 충전할 수 있습니다.</li>
	<li>모든 95개의 샘플이 라벨이 부착된 2mL 원심분리기 튜브로 하위 샘플링될 때까지 2.2를 반복합니다. 96th 우물추출 공백으로 사용되어야 합니다. 참고: 2.3 단계와 2.4단계는 필요한 저장 공간을 최소화하고 오버 또는 이중 샘플링을 방지하기 위해 수행됩니다.</li>
	<li>플레이트를 적재할 때까지 2mL 서브 샘플 튜브를 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>라벨 96 멸균 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브 A1\u2012A12, B1\u2012B12, .... H1\u2012H12. 이 튜브를 96웰 랙에 넣습니다.</li>
	<li>위치가 좋은 샘플 ID(A1\u2012H12)를 지정하고 기록합니다.</li>
</ol>3. 플레이트 준비
<ol><li>96웰플레이트(그림 1A-1C)에서고무 커버를 분리하여 멸균 비닐 봉지에 넣습니다(재료표참조). 오염을 방지하기 위해 비닐 봉지를 밀봉하십시오.</li>
	<li>밀봉 필름으로 96웰 플레이트를덮습니다(그림 1D-1E); 예를 들어, 사전 절단 피어싱 가능한 밀봉 필름을 사용합니다(재료표참조). 고무 롤러로 롤링하여 밀봉을 보장합니다. 참고: 피어싱 가능한 실리콘 매트는 사용 간에 적절한 세척을 제공하는 재사용 가능한 옵션을 제공할 수 있지만, 우리가 쉽게 피어싱을 따라 분할테스트한 실리콘 매트는 다음 플레이트에 동등한 보호를 제공하지 않습니다.</li>
	<li>냉장고 (4 °C)에 접시를 놓고 시원함을 유지합니다.</li>
</ol>4. 하위 샘플 의 전송
참고: 토양 샘플이 매우 작은 경우 수정을 위한 4.13 단계를 참조하십시오.
<ol><li>2mL 하위 샘플 중 24개샘플을 얼음 블록에 넣고 냉장 보관합니다.</li>
	<li>샘플 이름과 위치 시트를 사용하여 올바른 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브를 선택합니다.</li>
	<li>균질화를 보장하기 위해 ~ 5 s에 대한 2 mL 하위 샘플 튜브와 소용돌이를 가져 가라.</li>
	<li>화염 및 표백제 살균 도구를 사용하여 올바른 평면 캡 PCR 튜브(도 1F)에첫 번째 샘플의 ~ 200 μL을로드합니다.</li>
	<li>모든 24개의 샘플이 로드될 때까지 4.2\u20124.4단계를 반복합니다. 그런 다음 4.6 단계로 이동합니다.</li>
	<li>표백제 담근 종이 닦아를 사용하여 200 μL 평면 캡 PCR 튜브의 외부를 청소하십시오.</li>
	<li>튜브를 반전시키고 벤치를 탭하여 샘플을 튜브 위로 이동합니다. 표백 및 화염 멸균 가위를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 잘라 96 웰 플레이트(도 1G)에빠질 수있는 시료를 만듭니다.</li>
	<li>96웰 플레이트에서 올바른 것을 찾아 서 잘 도달할 때까지 잘라낸 끝이 있는 플레이트를 가로질러 튜브를 통과합니다. 플레이트를 약간 기울여 미리 절단된 피어싱 식 밀봉 필름의 구멍을 용이하게 하고 튜브가 올바른 바로 위에 있을 때만 잘 뒤집어 잘라낸 팁이 잘 들어갑니다. 살균 도구를 사용하여 모든 토양이 튜브에서 우물로 떨어질 때까지 PCR 튜브의 상단을 누릅니다. 뚜껑이 닫혀 있는 우물 안에 튜브를 둡니다(그림1H-1J).</li>
	<li>한 번에 하나의 평면 캡 200 μL PCR 튜브를 제거하고 잘 비드 용액750 μL을 추가(그림 1K). 200 μL 플랫 캡 PCR 튜브를 끝까지 우물로 밀어 넣고 상단을 날카로운 것으로 표시하여 이 우물이 로드되었음을 나타냅니다. 각 샘플에 대해 이 작업을 반복합니다.</li>
	<li>24개의 시료가 모두 적재되고 비드 용액이 추가되면 2mL 하위 샘플 튜브를 제거하고 24개의 비샘플링 튜브로 교체하십시오.</li>
	<li>모든 95 개의 우물이 샘플 또는 빈 및 비드 솔루션으로로드 될 때까지 4.1\u20124.10 단계를 반복하십시오. 열린 우물 위에 전달하지 않고 튜브를 제거합니다(그림1L).</li>
	<li>조심스럽게 관통 필름을 제거하고 추출(그림 1M-1O)까지플레이트를 보호하기 위해 고무 커버를 교체합니다.</li>
	<li>또한 세분화 된 토양의 매우 작은 양의 경우, 샘플 튜브에 비드 용액의 750 μL을 추가하고 적절한 우물에 모든 내용을 전송하는 넓은 보어 파이펫 팁을 사용합니다. PCR 튜브를 개구부에 배치하여 이중 로딩을 방지합니다. 참고: 파이펫 팁의 보어보다 큰 미립자 유기물 또는 작은 암석 조각으로 이 수정을 구현할 때 파이펫을 막고 시료 슬러리의 전달을 어렵게 만들 수 있습니다.</li>
	<li>필요에 따라 -20°C에서 동결하고 계획 추출될 때까지 시료및 비드 용액이 적재된 플레이트를 저장합니다.</li>
</ol>5. 플레이트 로딩 방법의 비교
참고 : 96 웰 DNA 추출 플레이트의 로딩에 대한 우리의 새로운 방법을 확인하기 위해, 우리는 세 섹션으로 하나의 96 웰 플레이트를 분할. 우리는 토양과 교차 오염의 의도하지 않은 적재 가능성을 비교하기 위해 판 로딩의 세 가지 다른 방법을 사용했다. 우리가 사용한 세 가지 방법은 McPherson 외9,Qiagen의 기본 로딩 프로토콜10및 이 출판물에서 설명하는 프로토콜에 설명된 메서드였습니다.
<ol><li>접시에 토양을 적재<ol>
<li>96웰 플레이트를 3개의 4열 블록으로 섹션화합니다. 위에서 언급한 세 가지 방법 중 하나를 사용하여 각 블록을 로드합니다.</li>
		<li>토양을 다른 모든 우물에 적재하여 샘플과 빈 우물이 비틀거리게 됩니다. 이 배열을 통해 부주의한 시료 적재 및 교차 오염에 대한 최대 기회를 허용합니다.</li>
		<li>DNA 추출될 때까지 -20°C에서 96웰 플레이트를 동결합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA 추출<ol>
<li>제조업체의 96웰 플레이트 추출프로토콜(10)에따라 DNA를 추출한다.</li>
		<li>DNA 추출물을 추가 분석할 때까지 -20°C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>빈 우물에서 DNA의 정량화<ol>
<li>실온, 소용돌이에서 DNA 추출물을 해동하고 플레이트 스피너를 사용하여 아래로 회전합니다.</li>
		<li>분광광계를 사용하여 빈 우물의 DNA 농도를 측정하고 기록합니다.</li>
		<li>ANVOA와 Tukey의 포스트 혹 후 테스트를 사용하여 빈 우물의 평균 DNA 농도의 차이를 분석하십시오. 참고: α = 0.05에서 상당한 차이가 보고되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+communal+catalogue+reveals+Earth%27s+multiscale+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li>
<li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li>
<li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li>
<li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618(2019).</li>
<li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Phytobiomes+Journal%22%5BJournal%5D)">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li>
<li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186(2019).</li>
<li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lot+on+your+plate%3F+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362(2019).</li>
<li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies%3A+issues+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li>
<li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil%2C+rhizosphere%2C+and+roots+in+perennial+grass+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932(2018).</li>
<li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQiagen%2C+DN+%22easy+PowerSoil+HTP+96+Kit+Handbook%22">easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook</a>. , Hilden, Germany. (2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 보고하지 않으며 공개할 것이 없습니다.

이 방법은 높은 처리량 샘플 추출 플레이트를 적재하는 동안 잘 교차 오염에 대한 기회를 줄이고 기존 플레이트 로딩 전략9,,10을넘어 96 웰 플레이트를 로드하는 보다 제어된 수단을 제공한다. 우물 간의 오염은 단일 튜브 추출보다 96웰 의 플레이트 추출에 더 널리 퍼질 수 있으며, 특히자동화된 6,,7의경우, 어떤 방법론에서도 구체적으로 테스트되지는 않지만, 판적 하중 기간 동안 추출 플레이트의 우물이 열려 있을 때 교차 오염의 위험이 가장 높은 것으로 가정될 수 있다. 단일 튜브 추출에 비해 플레이트 기반 추출에서 교차 오염의 기회가 증가하면 멸균 커버로 우물을 보호하는 것이 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 중요한 첫 번째 단계로 간주되어야 합니다. 이러한 필요성에도 불구하고, 높은 처리량 추출 키트에 제공된 지침은...

미생물 공동체의 고처리량 시퀀싱의 최근 발전은 비교할 수 없는 시퀀싱 깊이를 제공하고 있으며, 결과적으로 지구의 미생물군유전체1의기능과 다양성을 엿볼 수 있습니다. 단일 시퀀싱 레인에 점점 더 많은 샘플을 멀티플렉스하는 능력이 증가함에 따라 단일 튜브 DNA 추출은 생태 데이터 생성에서 속도 제한 단계가 될 가능성이 있습니다. 그러나, 고처리량 DNA 추출의 새로운 방법은 이전에 가능했던 것보다 더 큰 효율을 가진 다량의 환경 샘플을 처리하기위한 약속을보유2. 이러한 방법은 종종 단일 튜브 대신 96 웰 플레이트를 사용하여 동시에 발생할 수있는 추출 수를 증가시키는 것을 포함합니다. 이와 같이, 고처리량 추출 방법의 실용성과 효율이 분명하고 토양3,4 및 식물 조직33,5에서 인간의 배설물물질 2에이르기까지 환경 샘플의 처리를 위해 구현되었다.,
이러한 방법은 시료 처리 및 DNA 추출을 따라 극적으로 속도를 낼 수 있지만 토양 및 기타 생태 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 초기 단계는 교차 시료 오염에 취약합니다. 이러한 유형의 잘 오염은 DNA 추출6,7,7,8동안 발생할 수 있으며, 우물은 이 첫 번째 단계에서 특히 취약하여 샘플이 완충액에서 일시 중단됩니다. McPherson외. 9는 깔때기와 8 웰 PCR 스트립 커버를 사용하여 96 웰 플레이트에 뿌리 권구 토양을 적재하는 방법을 보여 주지만, 그 방법은 플레이트를 적재하는 보다 통제된 접근 방식이지만, 각 시료를 적재할 때 주변 우물의 오염을 위한 충분한 기회를 제공한다. 또한, 오픈 웰은 산만 한 연구원이 잘못된 우물에 샘플을 배치하거나 이미로드 된 우물에 샘플을 추가 할 수있는 기회를 허용합니다. 또한 다양한 샘플 유형이 이 방법으로 로딩에 적합하지 않은 것으로 판명되었습니다. 젖은 샘플은 종종 정전기로 인해 우물 사이에 깔때기와 건조 샘플 '점프'에 충실합니다.
고처리량 DNA 추출의 첫 번째 단계에서 우물 간 오염 기회를 줄이기 위해 토양 샘플을 96웰 플레이트로 적재하는 새로운 접근법을 개발했습니다. 우리의 방법은 모두 환경 노출로부터 우물을 보호하고 실수로 여러 샘플을 하나의 우물 (이중 로딩)에적재하지 못하게합니다. 우리는 아래에 보고된 방법이 오염가능성을 감소시키는 것을 약속하고 그 같은 후속 DNA 추출을 위한 96 웰 플레이트를 적재하는 더 통제된 수단을 제공한다는 것을 믿습니다.

<table><tbody><tr><td>18 oz WhirlPak</td><td>Nasco</td><td>B01065</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 원심분리기 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L micro-PCR 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB 2000</td><td></td></tr><tr><td>96-well PowerSoil DNA 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>12955-4</td><td>우리는 토양 추출 키트를 사용했지만 모든 96-well 형식 키트가 작동합니다.</td></tr><tr><td>2 mL 원심분리기 튜브용 얼음 블록</td><td>2</td><td></td><td>mL 튜브용으로 만들어진 모든 얼음 블록은</td></tr><tr><td>200 &micro를 위한 얼음 블록이 작동합니다; L 마이크로 PCR 튜브</td><td>모든</td><td>모든</td><td>얼음 블록은 200 &micro를 위해 만들어졌습니다. L 튜브는 마이크로</td></tr><tr><td>스쿠큘라</td>, <td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>프리컷, 피어싱 가능한 씰링 필름,</td><td>엑셀, 과학</td>, <td>XPS25</td><td></td></tr>, <tr><td>주걱,</td><td>모든</td><td></td><td></td></tr><tr><td>수술 가위</td>, <td>모든</td><td></td><td></td> 것</tr></tbody></table>

고처리량 dna 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

높은 처리량 DNA 염기서열 분석 기술은 미생물 지역 사회, 호스트 특성 및 광범위한 생태계 기능 간의 관계에 대한 이해의 발전에 실질적으로 기여했습니다. 이러한 급속한 폭과 시퀀싱 기능이 급격히 증가함에 따라 최대 효율로 환경 DNA를 추출, 증폭, 분석 및 해석하는 방법이 왔습니다. 불행히도, DNA 추출을 신속하게 수행하는 것은 샘플 중 오염 위험을 증가시켜야 할 수 있습니다. 특히, 96웰 플레이트에 포함된 샘플을 기반으로 하는 고처리량 추출은 단일 튜브 추출에 비해 비교적 빠른 방법을 제공하지만 잘 교차 오염을 위한 기회도 증가합니다. 시료 간 교차 오염 위험을 최소화하기 위해 고처리량 추출 기술의 이점을 유지하면서 환경 샘플을 96웰 플레이트에 적재하는 새로운 방법을 개발했습니다. 우리는 샘플을로드하는 동안 각 플레이트를 커버하기 위해 피어싱 식 PCR 밀봉 필름을 사용하고 우물로 이동하기 전에 PCR 튜브에 먼저 샘플을 추가했습니다. 이러한 관행은 함께 샘플 드리프트및 의도하지 않은 이중 유정 의 위험을 줄입니다. 이 논문에 설명된 방법은 연구원들에게 96웰 플레이트에 내재된 교차 오염 위험을 줄이면서 사용 가능한 고처리량 추출 기술을 극대화하는 방법을 제공합니다. 우리는 원치 않는 교차 오염의 위험을 최소화하면서 샘플 수집에서 DNA 추출로 이동하는 방법에 대한 자세한 단계를 제공합니다.

이 새로운 방법은 96웰 의 DNA 추출 플레이트를 로드하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 빈 우물에서 가장 낮은 DNA 농도를 갖는 우리의 방법을 보여 주었다. 빈 우물의 DNA 농도는 내 맥퍼슨 외9 (p&lt; 0.05)를 제안한 방법보다 현저히 낮았지만, 우리의 방법의 DNA 농도는 Qiagen 기본 방법(도 2)과통계적으로 다르지 않았다. 생성된 세 가지 방법 모두 2 ng/μL 미만의 DNA 농도를 의미하지만, 우리의 새로운 방법만이 측정 가능한 DNA 농도없이 우물을 생산했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61405/61405fig01.jpg"> 그림 1: 단계별 방법으로 샘플을 DNA ...

DNA 추출을 위한 96웰 플레이트를 적재하는 현재의 방법은 오염되기 쉽습니다. 우리는 우물 중 교차 오염의 위험을 감소 96 웰 플레이트를로드하기위한 새로운 방법을 자세히 설명합니다. 우리의 방법은 다른 연구자들이 고처리량 DNA 추출 기술의 효율성을 활용하고 오염 위험을 최소화하는 데 도움이 될 것입니다.

고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

이 프로토콜은 96웰 DNA 추출 플레이트 로딩의 효율성을 높이는 동시에 시료 교차 오염의 위험을 줄이는 기술을 제공합니다. 이 기술은 96웰 플레이트의 각 우물에 개별적인 샘플을 추가하여 DNA 추출의 중요한 첫 번째 단계 동안 오염 가능성을 감소시킵니다. 이 방법론은 미생물군유전체 연구의 다양한 분야에 적용될 수 있습니다.실험을 시작하기 전에 벤치 탑을 70%에탄올로 미스트합니다. 닦은 후 벤치를 10 % 표백제로 분사하기 전에 벤치를 공기 건조하게하십시오. 닦아 공기 건조 후, 현미경, 경직, 곡선 수술 가위를 95 %에탄올에 찍어 화염에 도구를 노출.그런 다음 각 도구를 10 % 표백제에 담그고 공구가 공기 건조할 수 있도록합니다. 서브 샘플링 전에 에탄올은 장갑을 살균하고 토양 샘플을 철저히 균질화합니다. 다음으로 각 튜브에 위치가 잘 되는 샘플 ID를 할당합니다.각 튜브가 약 반 가득 차날 때까지 튜브 당 하나의 샘플로 95 개의 밀리리터 원심 분리튜브를 채웁니다. 96번째 튜브는 추출 공백으로 사용되어야 합니다. 얼음에 하위 샘플 튜브를 놓고 96 웰 플레이트의 우물 라벨에 따라 96 개의 멸균 200 마이크로 리터 플랫 캡 PCR 튜브를 표시 한 다음 라벨 200 마이크로 리터 튜브를 96 웰 랙에 순서대로 배치합니다.실험을 위해 96웰 플레이트를 준비하려면 플레이트에서 덮개를 제거하고 덮개를 멸균 비닐 봉지에 넣습니다. 오염을 방지하기 위해 가방을 밀봉하고 피어싱 가능한 밀봉 필름의 사전 절단 조각으로 접시를 덮습니다. 그런 다음 고무 롤러를 사용하여 씰을 접시에 단단히 부착하고 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오.서브 샘플을 플레이트로 옮기려면 2밀리리터 서브 샘플 튜브 중 24개를 얼음 블록에 넣고 샘플 이름과 위치 시트를 사용하여 적절한 200 마이크로리터 플랫 캡 튜브를 선택합니다. 소량 샘플을 한 번에 하나씩 소용돌이치며, 샘플당 5초 동안 균질화를 보장하고 각 샘플의 약 200마이크로리터를 적절한 PCR 튜브에 적재합니다. 24개의 샘플이 모두 로드되면 표백된 담근 종이 닦기를 사용하여 하나의 PCR 튜브 의 외부를 청소하고, 반전하고 벤치의 튜브를 탭하여 샘플을 튜브 의 상단으로 이동시합니다.화염 살균 및 표백 가위를 사용하여 PCR 튜브의 바닥을 클립하여 시료에 대한 개구부를 만들고 적절한 우물에 도달 할 때까지 절단 끝이 위로 향하도록 플레이트 위에 튜브를 전달합니다. 플레이트를 약간 기울여 미리 절단가능한 피어싱 가능한 밀봉 필름의 구멍을 용이하게 하고, 튜브를 올바른 우물 바로 위에 넣고, 빠르지만 조심스럽게 플레이트를 반전하여 절단 팁이 잘 들어갑니다. 모든 토양이 튜브에서 우물로 떨어질 때까지 살균 도구를 사용하여 튜브의 상단을 누릅니다.그리고 납이 닫힌 상태로 튜브를 우물에 둡니다. 모든 샘플이 동일한 방식으로 로드된 경우 200마이크로리터 플랫 캡 PCR 튜브 를 제거하고 750 마이크로리터의 비드 용액을 샘플에 잘 추가합니다. 200 마이크로 리터 플랫 캡 PCR 튜브를 우물로 밀어 넣는 우물에 다시 놓습니다.그리고 샤피를 사용하여 튜브의 상단을 표시하여 우물이 로드되었음을 나타냅니다. 모든 우물에 구슬로 적재되면 24개의 샘플 튜브를 섭씨 20도까지 반환하고 24개의 새로운 서브 샘플 튜브를 얼음 블록에 추가하여 다음 샘플 세트를 96웰 플레이트에 적재할 수 있도록 합니다. 모든 95개의 우물에 샘플 및 비드 솔루션이 로드되면 96번째 우물에만 비드 용액을 추가합니다.모든 튜브를 제거하고 덮여 우물 위에만 전달하고 조심스럽게 접시에서 관통 필름을 제거합니다. 그런 다음 조심스럽게 접시 덮개를 비닐 봉지에서 접시로 옮기고 계획된 추출이 될 때까지 접시를 섭씨 20도로 놓습니다. 플레이트 로딩 방법의 비교는 입증된 방법이 빈 우물 내에서 가장 낮은 DNA 농도를 초래한다는 것을 보여줍니다.이 방법을 사용하여, MCPherson 등에서 제안된 방법을 사용할 때 DNA 농도가 현저히 낮았다. 이 방법에 의한 DNA 농도는 카겐 기본 방법과 통계적으로 다르지 않았다. 세 가지 방법 모두 마이크로 리터 당 2 나노 그램 의 DNA 농도를 평균합니다.이 새로운 방법만이 측정 가능한 DNA 농도없이 우물을 생산하지만. 유출 가능성을 최소화하기 위해 플레이트 위로 이동할 때 200 마이크로리터 튜브를 똑바로 세워 놓고 판을 기울여 튜브를 올바른 우물로 삽입하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 효율적으로 병렬에서 설명 및 플라스미드 DNA의 정화를위한 비용 효율적인...

Prokaryotic 문화 플라스미드 DNA의 유선형 정화

문화 미생물에 사용되는 미디어 및 시약과 함께 작업할 경우 무균 기술은 오염을 최소화하기 위해 실천해야합니다. 도금 방법의 다양한 정기적으로, 고립 전파, 또는 열거 세균 및 파지, 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함 모두의하는 데 사용됩니다.

무균 실험실 기술 : 도금 방법

TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 따라서, 샘플 준비 형식은 대부분의 액체 취급 장비와 호환되며, 높은 처리량 임상 응용 및 샘플 유형에 여러 매체에 사용할 수 있습니다.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

이 프로토콜은 음향 액적 배출 기술을 사용하여 384 웰 플레이트에서 포유류 세포의 고처리량 플라스미드 형질 감염을 설명합니다. 시간이 많이 소요되고 오류가 발생하기 쉬운 DNA 디스펜싱과 트랜스펙션 시약 디스펜싱은 나노 에스터디터 장치에 의해 소프트웨어 구동 및 수행됩니다. 세포는 다음 이 미리 채워진 우물에서 파종됩니다.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

이 프로토콜은 플라스미드 DNA 추출을 가속화하는 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 표준 스윙 버킷 플레이트 로터와 호환되는 맞춤형 3D 프린팅 랙을 활용함으로써, 연구자들은 캡이 있는 최대 48개의 스핀 컬럼 또는 캡 없이 최대 116개의 스핀 컬럼을 동시에 처리할 수 있어 수동 마이크로 원심분리기 방식에 비해 취급 시간을 크게 줄일 수 있습니다.

24웰 랙을 이용한 중간 처리량 컬럼 DNA 추출

학습하세요 96웰 플레이트 로딩을 통한 고처리량 DNA 추출 방법으로 오염 위험을 효과적으로 감소시키는 기술을. 마이크로바이옴 연구에서 샘플 무결성을 확보하는 혁신적인 프로토콜입니다.

고처리량 DNA 추출 플레이트의 로딩을 위한 수정된 방법은 오염 가능성을 감소시니다.

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