Name: 성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: 배우세요 쌀 종자의 횡단 단면을 파이펫 팁으로 제작하여 주사전자현미경으로 전분 과립 형태를 관찰하는 방법을. 이 기술은 식물 육종 프로그램에서 저항성 전분 연구와 품종 개량에 활용됩니다.

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저자는 그들의 페넘 ProX 데스크탑 SEM 악기의 사용에 대한 연구 시스템 (SFR Corp.)뿐만 아니라 마리아 필라리노스 (연구 시스템 (SFR) 주식 회사)와 클로이 반 Oostende-Triplet (세포 생물학 및 이미지 수집 핵심 시설, 오타와 대학) 기금은 온타리오 경제 개발부, 일자리 창출 및 무역 부, 단백질 이지 코퍼레이션의 저탄소 혁신 기금 (국제재단)에 의해 제공되었습니다.

1. 횡가 쌀 섹션의 준비
<ol><li>그림 1A에도시된 바와 같이 건조하고 그대로 커널을 드-껍질.<ol>
<li>두 개의 평평한 고무 스토퍼 사이에 커널을 연삭하여 껍질과 쌀 커널을 풀어 놓습니다. 필요한 경우 공황에서 껍질이 있는 쌀 커널을 제거합니다.</li>
		<li>작업벤치(그림 1B)에플랫 고무 스토퍼에 커널 한 개를 놓습니다. 이 스토퍼가 고정되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>제1 고무 스토퍼에 반하여 커널을 비틀어 충분한압력(도 1D)을사용하여 제2 플랫 고무 스토퍼(도1C)를사용한다. 내정자를 산산조각내지 않도록 주의하여 커널에서 껍질을 제거하십시오. 미세 한 집게를 사용 하 여 나머지 껍질을 제거 합니다. 탈 껍질 커널은 도 1E에표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미세 한 집게를 사용 하 여, 플라스틱 파이펫 팁에 개별 껍질 커널을 삽입 (250 μL 크기, 하나의 씨앗/팁)(그림 1F). 커널의 배아 끝이 파이펫팁(도 1G)의(원추형) 끝을 향하고 있는지 확인한다. 참고: 이 방법으로 커널을 삽입하면 커널이 근접 끝으로 좁아지면 커널이 피펫 팁에 가능한 한 잘 맞을 수 있습니다.</li>
	<li>두 번째 250 μL 파이펫 팁을 삽입하여 커널을 파이펫 팁에 강제로 넣고 절개 중에 커널을 움직이지 않도록 하여 커널을 손상시키거나 두 번째 파이펫 팁을 구부리지 않도록 주의하십시오(도1H). 적절한 '망원경' 조립체는 도 1I로표시됩니다.</li>
	<li>파이펫 팁 조립체를 작업 벤치에 평평하게 놓고 손으로 제자리에 고정하십시오(그림1J). 한편, 날카로운 메스 블레이드(20번)를 사용하여 커널의 중앙을 슬라이스하고 파이펫 팁의 끝을 잘라냅니다(도1K). 메스를 사용 하 여 쌀 커널의 1 mm 두께 의 섹션을 잘라(그림 1L). 참고: 커널 섹션은 플라스틱 의 무효화 내로 단단히 둘러싸여있습니다(그림 1M). 3개의 모범 유전자형에 대한 평균 단면 두께는 표 1에서찾아냅니다. 1mm보다 현저히 얇은 단면은 부서지거나 무너질 것입니다. 전분 형태학이내정자(11)에걸쳐 다르기 때문에 이 실험이 비교를 위해 여러 종류의 쌀에서 수행되고 있는 경우 각 섹션의 커널의 어떤 부분에서 유래하는지 주목하는 것이 중요합니다.</li>
</ol>2. 횡조쌀 섹션의 반사된 빛 현미경 검사법
<ol><li>미세한 집게를 사용하여 중간 게이지 검은 종이의 검은 조각에 가로 쌀 섹션 (섹션 1에 준비)을 배치합니다.</li>
	<li>그림 1N-S에도시된 바와 같이 경사 조명을 위해 구스넥을 장착한 스테레오현미경을 사용하여 닛폰베어의 횡방향 섹션의 가벼운 이미지를 얻을 수 있다.</li>
	<li>적어도 10배 배율 하에서 내정자 형태를 관찰한다. 참고: 이 기술을 사용하여 얻은 섹션이 빛이 통과할 만큼 충분히 얇지 않기 때문에 모든 에피라이트 소스는 밝은 필드 현미경 검사법을 사용하는 것이 바람직합니다.</li>
</ol>3. 횡조미 섹션의 전자 현미경 검사
<ol><li>샘플을 알루미늄 스텁에 달라붙은 탄소 디스크에 놓고 충전 감소 샘플 홀더에 놓습니다. 플라스틱이 SEM의 진공 장치에 유입되는 것을 방지하기 위해 미세 한 집게를 사용하여 파이펫 팁 마운트에서 플라스틱 링을 제거합니다. 참고: 내정자 세포, SGs 및 하위 과립의 이미지는 스퍼터 코팅할 견본을 요구하지 않는 데스크탑 SEM 기계를 사용하여 얻어진다.</li>
	<li>10kV에서 고감도 멀티 모드 백스캐터 전자(BSE) 검출기를 사용하여 이미지를 가져옵니다.</li>
</ol>

<ol><li>James, M. G., Denyer, K., Myers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+synthesis+in+the+cereal+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Starch synthesis in the cereal endosperm.</a> Current Opinion in Plant Biology. 6 (3), 215-222 (2003).</li>
<li>Shapter, F. M., Henry, R. J., Lee, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosperm+and+starch+granule+morphology+in+wild+cereal+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Genetic+Resources%22%5BJournal%5D)">Endosperm and starch granule morphology in wild cereal relatives.</a> Plant Genetic Resources. 6 (2), 85-97 (2008).</li>
<li>Ashida, K., Iida, S., Yasui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+physical%2C+and+chemical+properties+of+grain+and+flour+from+chalky+rice+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Morphological, physical, and chemical properties of grain and flour from chalky rice mutants.</a> Cereal Chemistry. 86 (2), 225-231 (2009).</li>
<li>Matsushima, R., Maekawa, M., Fujita, N., Sakamoto, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+direct+observation+method+to+isolate+mutants+with+defects+in+starch+grain+morphology+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid, direct observation method to isolate mutants with defects in starch grain morphology in rice.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (5), 728-741 (2010).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stable+QTLs+causing+chalk+in+rice+grains+in+nine+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Theoretical+and+Applied+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of stable QTLs causing chalk in rice grains in nine environments.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (1), 141-153 (2016).</li>
<li>Nagato, K., Ebata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+temperature+during+ripening+period+on+the+development+and+the+quality+of+rice+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of high temperature during ripening period on the development and the quality of rice kernels.</a> Japanese Journal of Crop Science. 34 (1), 59-66 (1965).</li>
<li>Zhao, X., Fitzgerald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change%3A+implications+for+the+yield+of+edible+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Climate change: implications for the yield of edible rice.</a> PLoS One. 8 (6), 66218(2013).</li>
<li>Zhao, Z. K., Mu, T. H., Zhang, M., Richel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high+hydrostatic+pressure+and+microbial+transglutaminase+treatment+on+structure+and+gelation+properties+of+sweet+potato+protein%5BTitle%5D)+AND+%22LWT+-+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of high hydrostatic pressure and microbial transglutaminase treatment on structure and gelation properties of sweet potato protein.</a> LWT - Food Science and Technology. 115, 108436(2019).</li>
<li>Feiz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puroindolines+co-localize+to+the+starch+granule+surface+and+increase+seed+bound+polar+lipid+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Puroindolines co-localize to the starch granule surface and increase seed bound polar lipid content.</a> Journal of Cereal Science. 50 (1), 91-98 (2009).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Guo, D., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+preparing+the+whole+section+of+starchy+seed+to+investigate+the+morphology+and+distribution+of+starch+in+different+regions+of+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for preparing the whole section of starchy seed to investigate the morphology and distribution of starch in different regions of seed.</a> Plant Methods. 14 (1), 16(2018).</li>
<li>Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+whole+sections+of+mature+cereal+seeds+to+visualize+the+morphology+of+endosperm+cell+and+starch+and+the+distribution+of+storage+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein.</a> Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).</li>
<li>Li, C., Dong, S., Li, G., Yuan, G., Dong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+and+application+of+the+new+combination+of+hybrid+rice+%22Xieyou+7954%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+%28Agriculture+and+Life+Sciences%29%22%5BJournal%5D)">Breeding and application of the new combination of hybrid rice "Xieyou 7954".</a> Journal of Zhejiang University (Agriculture and Life Sciences). 19 (3), 179-181 (2002).</li>
<li>Shu, X., Jia, L., Ye, H., Li, C., Wu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+digestion+properties+of+rice+different+in+resistant+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Slow digestion properties of rice different in resistant starch.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (16), 7552-7559 (2009).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+soluble+starch+synthase+SSIIIa+and+granule-bound+starch+synthase+Waxy+in+synthesizing+resistant+starch+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of soluble starch synthase SSIIIa and granule-bound starch synthase Waxy in synthesizing resistant starch in rice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (45), 12844-12849 (2016).</li>
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<li>Zhou, Y., Zou, Y., Jiang, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+methods+for+resistance+starch+content+of+Yi-Tang+rice+and+optimization+of+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Detection methods for resistance starch content of Yi-Tang rice and optimization of pretreatment.</a> Food Science and Biotechnology. 36, 416-419 (2017).</li>
<li>Cheng, X., Sardana, R., Kaplan, H., Altosaar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-transformed+rice+plants+expressing+synthetic+cryIA%28b%29+and+cryIA%28c%29+genes+are+highly+toxic+to+striped+stem+borer+and+yellow+stem+borer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2767-2772 (1998).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+P-35S+and+T-nos+in+genetically+modified+organisms+by+recombinase+polymerase+amplification+combined+with+a+lateral+flow+strip%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of P-35S and T-nos in genetically modified organisms by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow strip.</a> Food Control. 107, 106775(2020).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+with+a+synthetic+cry1Ab+gene+from+Bacillus+thuringiensis+were+highly+resistant+to+eight+lepidopteran+rice+pest+species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Breeding%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants with a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis were highly resistant to eight lepidopteran rice pest species.</a> Molecular Breeding. 6 (4), 433-439 (2000).</li>
<li>Lisle, A. J., Martin, M., Fitzgerald, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalky+and+translucent+rice+grains+differ+in+starch+composition+and+structure+and+cooking+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cereal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chalky and translucent rice grains differ in starch composition and structure and cooking properties.</a> Cereal Chemistry. 77 (5), 627-632 (2000).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+development+of+starch+granules+and+the+regulation+of+starch+biosynthesis+in+Brachypodium+distachyon%3A+comparison+with+common+wheat+and+Aegilops+peregrina%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic development of starch granules and the regulation of starch biosynthesis in Brachypodium distachyon: comparison with common wheat and Aegilops peregrina.</a> BMC Plant Biology. 14 (1), 198(2014).</li>
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<li>Matsushima, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloplast-localized+SUBSTANDARD+STARCH+GRAIN4+protein+influences+the+size+of+starch+grains+in+rice+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Amyloplast-localized SUBSTANDARD STARCH GRAIN4 protein influences the size of starch grains in rice endosperm.</a> Plant Physiology. 164 (2), 623-636 (2014).</li>
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<li>Liu, Q. H., Zhou, X. B., Yang, L. Q., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chalkiness+on+cooking%2C+eating+and+nutritional+qualities+of+rice+in+two+indica+varieties%5BTitle%5D)+AND+%22Rice+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of chalkiness on cooking, eating and nutritional qualities of rice in two indica varieties.</a> Rice Science. 16 (2), 161-164 (2009).</li>
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</ol>

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여기에 제시된 기술은 데스크톱 SEM 시각화를 위한 횡가 쌀 단면을 준비하는 데 있어 빠르고 간단하며 예리한 접근 방식을 나타냅니다. 이 단면 기술은 내정자 구조, 내정자 세포 모양, 크기 및 패턴, 화합물 과립 및 전분 형태의 신속한 관찰을 허용합니다. 내정자 페노티핑 및 세균 성 스크리닝의 목적을 위해, 쌀 커널4,23,24의전체 단면을 얻는 것이 중요하다. 메스 블레이드의 압력이 자궁 내정자를 강제로 무너지거나 산산조각내는 것을 방지하기 위해 파이펫 팁 내에 커널을 완전히 삽입하는 것이 가장 중요합니다. '망원경' 조립이 제대로 구성되면, 샘플은 15초 이내에 시각화를 위해 제조될 수있다(표 2)일반적인 실험실 환경에서 이미 수작업으로 재료를 채용. 이 기술은 가장 넓은 지점에서 직경 약 4mm의 타원 성자의 단면화에 적용됩니다. 모델 잔디 의 씨앗 Brachypodium distachyon (도면 S2A)유사 하게 단면 될 수 있지만 무효 내에서 동봉 유지 하지 않습니다. 밀과 같은 큰 씨앗은 쉽게 골절하고 단면(그림 S2B)을할 때주의가 필요합니다.
그러나 여기에 제시된 기술에는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 기술을 사용하여 얻은 단면은 밝은 필드(쌀커널 섹션25의최대 샘플 두께 500 μm) 및 투과 전자 현미경(TEM) (500 nm 최대 샘플 두께26)와 같은 전송광 기반 현미경 접근법에 대한 이 기술의 사용을 금지하는 빛이 통과하기에 충분히 얇지 않습니다. ). 피펫 팁을 '매트릭스'로 사용하면 이 기술을 사용하여 단면화할 수 있는 시드 크기도 제한됩니다. 쌀과 매우 유사한 종에 대해이 기술을 적응하기 위해 추가 문제 해결이 필요하며, '매트릭스'의 크기는 구매 가능한 파이펫 팁의 크기에 의해 제한됩니다.
이 기술이 제공하는 또 다른 뚜렷한 장점은 백악악형 쌀 커널에서 생성될 수 있는 샘플의 품질입니다. 마쓰시마 연구조차도 비교를 목적으로 본 연구에서 복제된 바와 같이, 백악악현상4에대한 특정 방법을 사용하여 단면을 얻기 어렵다는 것을 인정할 필요가있다(도 1S). 그들의 경우, 화학적으로 그들의 백악쌀 견본을 고치고 단면에 대한 수지에 포함시키는 것이 필요하게 되었습니다. 새로운 기술은 데스크톱 SEM 이미징과 함께, 연구원은 쉽게 고정 지원없이보다 더 일관성현미경 검사에 대한 쌀 커널의 횡단 섹션을 준비 할 수 있습니다(표 3).
현상전증과 메타볼로믹스의 새로운 시대에, 돌연변이 선과 트랜스포손 태그 라이브러리를 모니터링하여 씨앗에서 전분의 기능과 중요성을 더 잘 이해하는 것이 중요합니다. 또한, 국제 쌀 제네뱅크는 130 000 개 이상의 쌀 접근27을보유하고 있습니다. 여기에 제시 된 것과 같은 빠른 종자 phenotyping 기술은 영양 품질28에대한 분류 및 샘플링을 가속화 할 것이다. 마지막으로, 이 기술은 기후 변화 영향을 잠식하는 데 유용할 수 있습니다. 곡물 충진 중 계절고온 스트레스는 이미 분필6의주요 원인으로 확인되었지만, 최근 연구에 따르면 쌀 수확량7,29의분필 증가로 지구 온도가 상승하는 것을 암시하고 있습니다. 이러한 신속한 내정자 phenotyping은 지구 온도 상승의 효과의 광범위한 농업 이미지를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

전분 과립 (SGs)은 식물 종, 특히 푸아세아 가족의내정자1,2에따라 다른 형태를 나타낸다. 내정자 표현표는 스캐닝 전자 현미경 분석을 사용하여 SG 표현형에 기초하여 유전자형을 분류하는 데 사용될 수 있다. SGs는 커널을 잘라내고 내정자 세포벽2를멀리 캐고 서 스캔 전자 현미경 검사법 (SEM)을 사용하여 시각화 할 수 있습니다.
이 기술의 목적은 빠른 SEM 분석을 위해서만 횡단 쌀 커널 섹션을 쉽게 준비하는 것입니다. 이 기술의 개발은 최소한의 장비를 사용하여 시각화 직전에 시료가 SEM 현미경 검사법을 위해 준비되는 신속한 단면 분리 접근법의 필요성에 의해 동기를 부여받았습니다.
이 기술은 완전한 고정을 위해 파이펫 팁에 껍질 쌀 커널을 삽입하는 것을 포함한다. 이것은 특히 간면분면 백악질 쌀 커널 표현형, 이는 friable 쉽게 압력3에서무너질 수 있습니다. 분필은 커널의 모양에 영향을 미치고 커널을 연마하고 밀링 하는 동안 쉽게 부러지게 하기 때문에 쌀에서 바람직하지 않은품질입니다 3. 분악함은 육안으로 관찰할 수 있는 커널의 단면에 불투명한 영역으로 제시한다. 현미경 수준에서, 분필은 작고 느슨하게 포장 된 전분 과립이 특징입니다. 분악의 원인은유전적 4,5 또는 환경6,7일수 있다.
시리얼 종자 단면은 전통적으로 파라핀 왁스 또는 다른 고체 매트릭스4,8,9,10에포함 시료에 따라 화학 적 고정 방법 및 단면을 사용하여 제조되었습니다. 2010년에는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 쌀 커널 시료 준비4를피하기 위한 방법으로 마쓰시마 방법이 도입되었다. 이 방법은 잘린 파이펫 팁에 껍질 쌀 커널의 삽입을 포함. 팁은 블록 트리머에 의해 고정되어 있으며, 얇고 부분적인 내정자 섹션은 휴대용 면도날을 사용하여 수확됩니다. 2016년에 개발된 또 다른 급속한 기술은백악악품종(10)을포함한 다양한 건조종의 얇은 전체 단면을 허용했다. 이러한 방법은 여기에 제시 된 빠른 기술의 개발을 동기를 부여.
이 새로운 기술은 SEM을 사용하여 내정자 phenotyping 및 전분 형태학 분석을 위한 쌀 커널의 그대로 횡단 단면을 얻고자 하는 연구자에게 적합합니다.
이 프로토콜은 마쓰시마 잘린 파이펫 팁 방법4의적응을 나타내며, 몇 가지 주목할 만한 수정 사항: (1) 커널은 기술의 어느 시점에서도 imbibed되지 않습니다. (2) 단면을 준비하기 위해 블록 트리머나 초미세토메가 필요하지 않습니다. 야생형 '반투명'품종(Oryza sativa L. ssp. japonbare cv. Nipponbare) 및 일본판베어의 돌연변이 '백악질'라인(ssg1, substandard 전분 곡물1)4가 이 연구에서 조사되었다. 이 두 품종은 반투명 및 백악악형 쌀 섹션 처리의 기술적, 시각적 차이를 보여주기 위해 여기에서 분석을 위해 선택되었다.

<table><tbody><tr><td>JMP 15</td><td>SAS</td><td>N/A</td> N<td>/A</td></tr><tr><td>Leit 접착제 탄소 탭 12 mm (100개 팩)</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3347N</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Phenom Pro 데스크탑 SEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>PHENOM-PRO</td><td>N/</td></tr><tr><td>A 피펫 팁 RC UNV 250 &micro; L</td><td>Rainin</td><td>17001116</td><td>해당 없음</td></tr><tr><td>SEM 핀 스텁 &오슬래시; 12.7 직경 상단, 표준 핀, 알루미늄</td><td>마이크로 to 나노</td><td>10-002012-50</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon 미세 해부 미세 팁 엄지 손가락 집게, 미세 팁, 12.7cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120019</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon 메스 블레이드 No. 20, 멸균, 4.5cm</td><td>Thermo Scientific</td><td>28618256</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Shandon 스테인리스 스틸 메스 블레이드 핸들</td><td>Thermo Scientific</td><td>5334</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Zeiss V20 Discovery 실체현미경</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 l.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

전분 과립 (SGs)은 식물 종, 특히 푸아세아 가족의 내정자에 따라 다른 형태를 나타낸다. 내정자 표현은 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석을 사용하여 SG 형태형에 기초하여 유전자형을 분류하는 데 사용할 수 있습니다. SGs는 커널(pericarp, aleurone 층 및 내정자)을 잘라내고 유기체 함량을 노출시킴으로써 SEM을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 현재의 방법은 쌀 커널을 플라스틱 수지에 내장하고 마이크로톤또는 잘린 파이펫 팁에 내장되어 면도날을 사용하여 손으로 단면되어야 합니다. 이전 방법은 특수 장비를 필요로하고 시간이 많이 소요되는 반면, 후자는 쌀 유전자형에 따라 새로운 문제를 소개합니다. 백악질 쌀 품종, 특히, 그들의 내정자 조직의 friable 특성으로 인해 단면의이 유형에 대한 문제를 제기. 여기에 제시된 것은 피펫 팁과 메스 블레이드만 필요한 현미경 검사법을 위한 반투명 및 백악질 쌀 커널 섹션을 준비하는 기술입니다. 파이펫 팁의 경계 내에서 섹션을 준비하면 쌀 커널 내정자가 산산조각나는 것을 방지합니다 (반투명 또는 '유리체' 표현형용) 및 무너져 (백악악표현형용). 이 기술을 사용하여, 내정자 세포 패터닝 및 손상되지 않은 SGs의 구조를 관찰할 수 있다.

야생형 닛폰베어(그림2A)및 ssg1 섹션(그림2B)은260x, 920x, 4200x의 세 배율하에서 검사하였다. 이 기술은 전체 내정자 세포(도 3A),화합물 전분 과립(도 3B)및 개별 하위 과립(도 3C)을관찰하기에 충분한 품질의 섹션의 준비를 허용합니다. 껍질이 깔려 있는 커널은 단면화 전에 마모에 의해 건조한 선체를 제거해야 하기 때문에 연마된 커널보다 처리하는 데 시간이 더 오래 걸린다. 분필 커널은 또한 연마 된 반투명 커널보다 처리하는 데 시간이 오래 걸리며, 단면 중에 커널을 산산조각내지 않도록주의를 기울여야합니다. 제대로 준비된 쌀 부분은 약 0.9mm두께(표 1)여야하며, 내정자(도1N)와그대로 침구 및 알뢰론 층(도1O)을산산조각낼 수 없다. 단면이 '갈라진'섹션(그림 1P)으로이어질 수 있을 때 피펫 팁에 메스를 부적절하게 배치할 수 있습니다. 유사하게, ssg1(그림 1Q)의최적의 횡방향 섹션의 밝은 필드 이미지는 그대로 내정자, pericarp 및 알뢰론 층을 입증하고 시각화에 사용할 수 있다(도1R). 깨진 백악삭커널섹션(도 1S)은SGs를 관찰하는 것이 유일한 목적이지만 내정자 세포 패턴이 보이지 않는 경우 시각화에 여전히 사용할 수 있습니다. 깨진 섹션은 분석을 위해 처리하기 어려울 수 있습니다. 내정자 세포벽의 더 많은 전단은 세포가 ssg1 커널보다 더 단단히 포장되고 덜 friable로 야생 형 Nipponbare에서 관찰되었습니다. ssg1 섹션에서 내정자 세포의 전단이 관찰되지 않았으며 화합물 전분 과립은 그대로 유지된다.
도S1은 '망원경' 기술을 사용하여 쌀 커널을 절에 대는 결과의 신뢰성을 보여줍니다. 반투명 커널 생산업체로 확인된 쌀선 – 야생형 내성 전분(RS) 하이브리드 라인 Xieyou 7954(Oryzasativa L. ssp. indica)12,13,14(도피 S1A)및 코발트 생성 돌연변이 RS11113,15(도면 S1B) 구간을 통해 생성된 피규어를 통해 생성된피규어(도S1B) 해당 SEM 이미지는 이러한 라인이 '정상' 쌀 내정자 표현형을 생성하는 것으로 나타났습니다: 단단히 포장된 다각형 전분 과립. 초악커넬 생산업체, 상용 버라이어티 이탕(16) 및 RS413,RS11115(피겨 S1D)의돌연변이, 흰색 불투명커널 섹션이 전시되었다. 해당 SEM 이미지는 야생 형 반투명 RS 배경 라인에 비해 현저하게 다른 형태를 표시 : 전분 과립은 둥글고 느슨하게 포장되었다. 야생형 Xiushui(11)(오리자사티바이 L. ssp. japonica)(도면 S1E)및 그 돌연변이, KMD1(Kemingdaoo1), 이는 크라이1Ab 유전자를 발현하여 곤충 포식17,18,19(도면 S1F)는반투명 대사와 유사한 섹션을 나타내고 내정자 모포형을 나타냈다.
여기에 제시된 기술은 표현성 분석을 위해 백악기형 쌀커널 샘플을 준비하는 데 최적이지만, 반투명 쌀 커널표현형(20)을절제하는 장점이 있다: 위에서 압력을 사용하여 샘플을 슬라이스하면 내시경과 탈구의 위험이 줄어듭니다. 샘플은 몇 초 이내에 쉽게 준비 할 수 있습니다(표 2). 다중 유전자형은 효능을 시험하기 위해 이 기술을 사용하여 분석하였다(표3). 도서 S2에도시된 바와 같이,이 기술은 다른 종의 씨앗에 적용 될 수있다. 모델 모노코트 브라키포디포디움 디스타시현은 전분과22에 부드러움을 부여하는 단백질인 푸오인돌린 A가 부족한 B-과립전분(21)만함유된 매우 단단한 씨앗을 생산한다. 그대로 횡단섹션(그림 S2A)을얻을 수 있었습니다. 부드러운 백색 겨울 밀 (SWWW)에서 그대로 횡단 섹션을 얻는 것은 도전적이지만 수행 할 수 있습니다(그림 S2B). SWWW 씨앗은 푸오인돌린 A가 높고 B. 디스타현 씨와 쌀 커널에 비해 크다. 이 씨앗은 망원경 조립을 사용하여 단면 할 때 자주 무너져.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자 형</td>
			<td>망원경 조립을 이용한 평균 단면 폭(μm)</td>
			<td>평균 단면 폭(μm) 절제 프리핸드</td>
		</tr>
<tr>
<td>닛폰바레 (껍질)</td>
			<td>971.7 ± 152.4ab
</td>
			<td>1059.571 ± 394.2ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td>시유 7954</td>
			<td>825.1 ± 128.3b
</td>
			<td>1306.187 ± 179.1a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>910.6 ± 165.0ab
</td>
			<td>1126.694 ± 395.3ab
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">동일한 문자가 뒤따르는 수단은 분산(ANOVA) 및 Tukey의 테스트(n = 10)의 단방향 분석을 사용하여 P &lt; 0.01에서 크게 다르지 않습니다. JMP 15 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 평균 커널 단면 두께입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자 형</td>
			<td>평균 시간 (들)*</td>
		</tr>
<tr>
<td>닛폰바레 (껍질)</td>
			<td>14.7 ± 1.36a
</td>
		</tr>
<tr>
<td>시유 7954</td>
			<td>9.81 ± 0.98b
</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>11.9 ± 1.28c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">*망원경 조립을 사용 하 여.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">동일한 문자가 뒤따르는 수단은 분산(ANOVA) 및 Tukey의 테스트(n = 10)의 단방향 분석을 사용하여 P &lt; 0.01에서 크게 다르지 않습니다. JMP 15 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 평균 샘플 준비 시간입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자 형</td>
			<td>배경</td>
			<td>질</td>
		</tr>
<tr>
<td>닛폰베어</td>
			<td>와일드 타입</td>
			<td>반투명</td>
		</tr>
<tr>
<td>
표준 이하 전분 곡물1 (ssg1)</td>
			<td>닛폰베어</td>
			<td>백악한</td>
		</tr>
<tr>
<td>내성 전분 (RS) 시유 7954</td>
			<td>와일드 타입</td>
			<td>반투명</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS111</td>
			<td>시유 7954</td>
			<td>반투명</td>
		</tr>
<tr>
<td>RS4</td>
			<td>RS111</td>
			<td>백악한</td>
		</tr>
<tr>
<td>이탕, '뉴라이프', 루주렌 브랜드</td>
			<td>시유 7954</td>
			<td>백악한</td>
		</tr>
<tr>
<td>시우수이 11</td>
			<td>와일드 타입</td>
			<td>반투명</td>
		</tr>
<tr>
<td>케밍다오1 (KMD1)</td>
			<td>시우수이 11</td>
			<td>반투명</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 이 연구에서 검사된 쌀 유전자형.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig01.jpg"> 그림 1: 횡조쌀 섹션의 준비. (A)그대로 껍질이있는 야생 형 닛폰 베어 커널. (B).커널은 평평한 4 인치 직경의 고무 스토퍼에 놓습니다. (C)껍질은 두 개의 고무 스토퍼 사이에 커널을 연삭하여 제거하였다. (D)껍질은 쌀 커널에서 분리되었습니다. (E)껍질이 있는 쌀 커널을 클로즈업합니다. 배아 끝이 표시됩니다. (F)미세 포셉을 사용하여 파이펫 팁에 커널을 삽입합니다. (G)커널은 파이펫 팁의 단부 끝에 박혀 있었다. (H)제2 파이펫 팁의 삽입을 통해 절개('망원경' 조립)에 대한 커널을 고정한다. (I)쌀커널은 파이펫 팁의 말단 끝에 아늑하게 장착되었습니다. (J)조립 내의 쌀 커널의 단면. (K)절제된 부분 의 클로즈업. (L)플라스틱 무효화에 의해 동봉된 커널의 섹션. (M)횡단 구간의 클로즈업. (N)야생형 닛폰베어의 횡단 구간. (O)야생형 닛폰베어 섹션 내의 내의 내정자를 클로즈업한다. (P)야생형 닛폰베어 커널의 불쌍하고 최적이 아닌 섹션. (Q)일본판베어 돌연변이 ssg14의횡단 구간 . (R) ssg1 섹션 내의 내의 내정자의 클로즈업. (S) Ssg1의불량, 최적이 아닌 섹션 . 바 (패널 A, N-S)= 1mm. 전체 쌀 커널과 섹션은 디지털 줌 카메라와 구스넥 조명이 있는 스테레오현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig02.jpg"> 그림 2: 횡방향 커널 섹션의 SEM 이미지입니다. (A)야생형 닛폰베어, 반투명 품종. 화합물 전분 과립은 서로 단단히 시멘트되었다; (B)닛폰베어 돌연변이 ssg14,백악질 표현형. 화합물 전분 과립느슨하게 포장되었고 야생 형 닛폰 베어 전분 형태의 시멘트 특성이 부족했습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 배율: 260x, 920x, 4200x. 막대 길이는 패널에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61407/61407fig03.jpg"> 그림 3: Xiushui 11의 횡권 커널 섹션의 SEM 현미경 해부학. (A)단일 내정자 세포가 빨간색으로 설명되어 있습니다. 260x 배율. (B)화합물 전분 과립은 빨간색으로 설명되어 있습니다. 920x 배율. (C)여러 전분 하위와가 빨간색으로 윤곽을 비우고 있습니다. 2250x 배율. 막대 길이는 패널에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S1: 이 기술을 사용하여 SEM을 위해 준비된 다른 쌀 유전자형의 횡단 섹션. (A)내성 전분 (RS) 시유 795412. (B)RS111, 795413의고RS 투명 돌연변이. (C) RS4, RS11115의백악악 돌연변이 . (D)이탕, 높은 아밀로오스 쌀16의상업적 다양성. (E)시우수이 11. (F) KMD1 (케밍다오1)17,18,19. 밝은 필드 이미지에 대한 10배 배율. 화이트 바 = SEM 이미지용 2250x 배율 1mm. 막대 길이는 패널에 표시됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 S2: 기술은 다른 씨앗에 유용합니다. (A)거짓 보라색 브롬의 횡단 구간(브라키포디움 디스타시온 L. 가입 Bd21) 씨앗. (B)부드러운 흰 겨울 밀(트리티툼 아예티움 L. cv. 오거스타) 씨앗의 횡단 섹션. 밝은 필드, 20 배율. 바 = 1mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61407/61407supfig02.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 주사 전자 현미경 을 사용하여 내시경 및 전분 과립 형태의 분석을 위해 시리얼 씨앗 (예를 들어, 쌀)의 횡단 섹션의 준비를 허용합니다.

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

이 프로토콜을 사용하면 씨앗을 그대로 슬라이스하여 무너지지 않도록 피펫 팁에 들어갈 수있는 모든 씨앗에서 전분 과립을 시각화 할 수 있습니다. 가단성 플라스틱 콘은 건조 조직과 장기의 기본 구조를 지원하므로 이 저렴하고 쉬운 매니폴드를 통해 짧은 시간에 많은 샘플을 처리할 수 있습니다. 여기에 법의학 현미경 이점, 내성 전분, 우리 모두가 찾고있는 무언가, 그 원시 전분, 아밀로리시스, 혈당 지수 및 포도당 스파이크에 효소의 접근성에서 계속하기 위해, 이들은 오늘날 전 세계 타입-2 당뇨병을 싸우기 위해 더 나은 쌀 품종을 사육하기위한 핵심 매개 변수입니다.그리고 지금 당신에게 박사 키아 바튼을 소개하는 것은 큰 기쁨입니다. 바튼 박사는 우리 연구실에서 온 이며 그녀는 교수 코어 이미징 시설을 사용 하 여이 기술이 배포 하는 방법을 보여줄 것 이다. 마른 커널을 탈수하는 것으로 시작합니다.작업 벤치에 평평한 고무 스토퍼에 하나의 커널을 놓고이 스토퍼가 고정 되어 있는지 확인합니다. 두 번째 플랫 고무 스토퍼를 사용하여 첫 번째 고무 스토퍼에 비틀어 커널에서 껍질을 제거하여 내정자를 산산조각내거나 두 고무 번사이에 씨앗을 너무 적극적으로 연마하지 않도록주의하십시오. 미세 한 집게를 사용하여 나머지 껍질을 제거하고 플라스틱 250 마이크로 리터 파이펫 팁에 개별 껍질 커널을 삽입합니다.커널의 배아 끝이 파이펫 팁의 원추형 끝을 향하고 있는지 확인하십시오. 두 번째 250 마이크로리터 파이펫 팁을 삽입하여 커널을 첫 번째 파이펫 팁에 넣고 커널을 손상시키거나 두 번째 파이펫 팁을 구부리지 않도록 주의하십시오. 파이펫 팁 어셈블을 작업대위에 평평하게 놓고 손으로 제자리에 고정합니다.반면에 날카로운 메스 블레이드를 사용하여 커널 중앙을 슬라이스하여 파이펫 팁의 끝을 잘라내면 됩니다. 어셈블리를 통해 아래쪽으로 슬라이스한 다음 메스 블레이드를 수직으로 방향을 지정하여 손 섹션의 두 개의 새 노출된 면이 평행합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 쌀 커널의 1mm 두께 부분을 자른다.반사된 빛 현미경 검사를 수행하려면, 무거운 게이지 검은 종이 조각에 가로 쌀 섹션을 배치합니다. 경사 조명을 위해 구스넥을 장착한 스테레오 현미경을 사용하여 횡단 면의 가벼운 이미지를 획득하여 최소 10배 배율을 사용한다. 야생형 닛폰베어 및 ssg1 구간은 260배, 920배, 4배, 200배 이하로 조사되었다.제대로 준비했을 때, 쌀 부분은 내시경과 그대로 두근거림과 알뢰론 층의 최소한의 산산조각으로 약 0.9 밀리미터 두께였다. 이 기술은 전체 내정자 세포, 화합물 전분 과립 및 개별 하위 과립을 관찰하기에 충분한 품질의 섹션의 준비를 허용합니다. 야생식 내성 전분 하이브리드 라인, Zhehui 7954 및 코발트 생성 돌연변이 RS111과 같은 반투명 커널 생산업체는 일반 쌀 내정자 표현형인 단단히 포장된 다이히드랄 전분 과립을 생산합니다.백악삭한 커널 프로듀서, 상업적 버라이어티 예탕과 RS4의 SEM 이미지는 둥글고 느슨하게 포장 된 전분 과립을 표시했습니다. 곤충 포식을 억제하기 위해 Cry1Ab 유전자를 발현한 야생형 Xiushiu 11 및 돌연변이 KMD1은 반투명 내성 전분 선과 유사한 단면및 내정자 형태를 가졌다. 이 기술은 다른 종의 씨앗에 적용 할 수 있습니다.모델 모노코트인 브라키포디포디움 디스타시현은 매우 단단한 씨앗을 생산하지만, 그대로 횡단구간을 얻을 수 있었다. 온전한 횡방향 섹션은 부드럽고 하얀 겨울 밀로 생산되었습니다. 생물학적 구조 내부를 조사하는 이 신속하고 저렴한 스크리닝 방법은 곤충 다리, 궤나무 나무 스파이크, 산사나무, 생선 척추 또는 이 샘플 지원 설정에서 이익을 얻을 수있는 법의학 현미경 검사의 모든 분야에 적용 할 수 있습니다.이 프로토콜을 수행 한 후, 전자 현미경 검사법을 위한 스퍼터 코팅, 특정 형광염으로 염색, 돌연변이 귀리와 보리 라인에서 베타 글루칸 세포 벽 두께에 대한 얼룩에 칼카플루어를 적용하는 것은 신속한 표현형 스크리닝을 통해 식물 사육에 접근하는 몇 가지 빠른 방법입니다.

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연구

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클리어링 기술을 통한 라이스 싹의 깊은 형광 관찰

이것은 최소한의 시약과 일반적인 실험실 장비(기본 스마트폰 포함)를 사용하는 보리 잎 덮개 분석의 간단한 프로토콜입니다. 그 목적은 첨단 현미경 장비를 사용하지 않고 실험실에서 모세포 질환의 초기 감염 과정을 시각화하는 것입니다.

기본 현미경과 스마트폰을 사용하여 보리(Hordeum vulgare)에 벼 돌풍병(Magnaporthe oryzae)의 초기 감염 부위 시각화

배우세요 쌀 종자의 횡단 단면을 파이펫 팁으로 제작하여 주사전자현미경으로 전분 과립 형태를 관찰하는 방법을. 이 기술은 식물 육종 프로그램에서 저항성 전분 연구와 품종 개량에 활용됩니다.

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

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