Name: 맞춤형 전달 시스템을 사용한 자성 나노입자 온열요법의 체외 및 생체 내 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 학습하세요 자성 나노입자 온열요법의 정확한 체외 및 생체 내 전달 방법을. 맞춤형 전달 시스템을 활용하여 표적 조직에 열을 집중시키고, 적절한 온도계측으로 재현성과 안전성을 확보하는 이 프로토콜은 전임상 모델에서 강력하고 일관된 치료 결과를 제공합니다.

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이 연구는 NCI P30 CA023108 및 NCI U54 CA151662의 보조금 번호로 자금을 지원받았습니다.

다트머스 대학 동물 관리 및 사용 프로그램은 미국 실험실 동물 관리 인증 협회 (iAAALAC)의 인증을 받았으며 모든 UDSA 및 NIH (실험 동물 복지 사무소) 지침 및 규정을 준수합니다. 모든 생체 내 연구는 다트머스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 안락사 절차는 동물 안락사에 대한 2020 AVMA 지침을 준수합니다.
1. 시스템의 계측/설계
<ol><li>맞춤형 AMF 안테나(코일)를 폐쇄 루프로 설계하고 원하는 자기장을 생성하기 위해 모양을 선택합니다. 발전기 선택의 인덕턴스 공식과 특성을 사용하여 원하는 필드를 생성하는 호환 가능한 코일을 설계합니다. 시험관 내 및 생체 내 실험에 다양한 디자인을 사용하십시오.</li>
	<li>AMF 안테나 인덕턴스가 발전기의 허용 범위 내에 있는지 확인합니다. 커패시터를 더하거나 빼서 안테나를 발전기에 일치(조정)합니다.</li>
	<li>체외 실험의 경우 1.5mL 튜브를 포함할 수 있는 내경 2cm, 길이 14cm의 14회전 헬리컬 코일을 설계하여 여러 샘플을 동시에 처리할 수 있습니다. 코일을 비닐 폴리머로 절연하고 폴리스티렌 스페이서를 사용하여 튜브에서 코일을 분리하십시오. 설계 사양 및 고려 사항에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1에 있습니다.</li>
	<li>생체 내 실험의 경우 독점 설계 정보가 있는 제조업체로부터 맞춤형 전신 헬리컬 코일을 구입하십시오. 8mm 사각 튜브(코일 보어 내에 보다 균일한 필드를 생성하므로)와 대상 처리 영역에 집중기를 사용하십시오. 농축기를 5.0cm 길이로 만들고 총 5회 돌려 내경 3.6cm, 외경 5.2cm를 만들고 표적 치료 부위에 위치합니다. 코일을 폴리 카보네이트 쉘로 둘러싸십시오.</li>
	<li>정격 전력이 10kW 이상인 조정 가능한 전력 및 주파수가 있는 AMF 발전기를 전원으로 사용하십시오. 인덕턴스는 전원과 안테나/코일을 0.62에서 1.18μHenries(μH) 범위로 일치시켜 30-300kHz 범위의 주파수를 허용합니다. 50psi로 조절된 원심 부스트 펌프를 통해 재활용된 물을 사용하여 발전기를 냉각합니다.</li>
	<li>AMF 안테나를 통해 물로 희석된 25% 에틸렌 글리콜 기반 열전달 유체를 펌핑하는 5.6톤 냉각 용량 냉각기로 코일을 냉각합니다. 안테나가 샘플을 가열하거나 냉각하지 않도록 냉각기의 온도를 설정하십시오.</li>
	<li>동물 격리의 경우 홀더와 코일 표면 사이에 0.5cm의 에어 갭이 있는 코일 중앙에 매달릴 수 있는 관형 홀더를 구성합니다. 코일 주위의 쉘을 통해 공기를 순환시키는 조정 가능한 조절 식 공기 펌프를 연결하고 정상적인 동물 코어 온도를 유지하도록 설정하십시오. 마취 기계를 동물의 머리 근처의 관형 동물 홀더에 연결하여 적절한 마취 전달을 보장합니다.</li>
	<li>세포 봉쇄를 위해 튜브가 놓인 스페이서를 통해 수조에서 물을 순환시키는 장치를 만드십시오. 튜브가 37 ° C에서 물로 둘러싸이도록이 수조의 온도를 설정하십시오.</li>
	<li>광섬유 프로브를 사용하여 종양, 동물의 핵심 및 동물 환경 내의 온도를 모니터링하거나 시험관 내 연구를 위해 세포 펠릿의 온도와 튜브를 둘러싼 물을 모니터링합니다.</li>
	<li>모든 실험에 100nm 크기의 자성 산화철 나노 입자를 사용하십시오. 참고 : 농도와 전자파 흡수율 (SAR)은 가능한 가열 및 열 선량18에 직접적인 영향을 미치기 때문에 나노 입자를 선택할 때 고려해야 할 두 가지 특성입니다.</li>
</ol>2. 시험관 내 온열요법
<ol><li>B16F10 뮤린 흑색종 세포를 10% FBS 및 1% Pen/연쇄상 구균이 있는 RPMI 배지에서 배양합니다. 6웰 플레이트에 150, 000개의 세포/웰을 플레이트하고 2mL의 완전 배지를 사용합니다.</li>
	<li>각각의 웰, 즉 mNP가 없고 AMF가 없는 세포, mNP가 있고 AMF가 없는 세포, mNP가 없는 세포 및 AMF가 없는 세포, mNP 및 AMF가 있는 세포에 대한 적절한 처리를 결정한다. 알림: 또한 온열요법과 다른 요법을 병용하는 경우 적절한 대조군이 있는지 확인하십시오. AMF는 필요한 전력 및 냉각 기능을 갖춘 표준 연구 벤치 실험실에서 수행됩니다.</li>
	<li>도금 후 24시간 후, 이전 단계에서 결정된 대로 적절한 웰에 mNP를 추가합니다. 3 mg 철 / mL의 농도에 mNP를 추가하십시오. 스톡 미디어/mNP 솔루션을 생성하거나(오래된 미디어 제거, 이 솔루션 추가) 균일한 분배를 위해 mNP를 직접 부드럽게 소용돌이치는 플레이트를 추가하여 mNP가 웰 전체에 분포되도록 합니다.</li>
	<li>mNP 첨가 후 48시간 후, 웰이 ~80% 합류할 때 배지를 제거하고 새로운 배지로 웰을 세척하여 처리를 시작합니다. 미디어를 제거합니다.</li>
	<li>치료중인 각 웰에 0.5mL의 트립신을 넣고 부드럽게 소용돌이 치십시오. 현미경을 사용하여 세포가 분리되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>각 웰에 1mL의 배지를 추가하여 세포를 1.5mL 튜브에 수집합니다. 웰에서 모든 세포를 수집합니다 (~ 1 x 106 세포). 각 웰에 대해 명확하게 표시된 별도의 튜브를 사용하십시오.</li>
	<li>세포가 펠릿이 될 수 있도록 60 x g 에서 2-3분 동안 튜브를 회전시킵니다. 미디어에 펠릿을 보관하십시오.</li>
	<li>코일 안에 물이 가득 찬 스페이서에 튜브를 놓습니다. 배지 및 셀 펠릿이 37°C로 유지되도록 수조의 온도를 설정한다. 별도의 광섬유 온도 프로브를 사용하여 튜브와 수조 내부의 온도를 모니터링합니다.</li>
	<li>냉각기를 켜고 냉각수가 코일을 통해 흐르고 있는지 확인하십시오. 전원을 켜고 최대 백분율을 원하는 필드로 조정합니다. 10kW 발전기로 구동되는 14회전 솔레노이드 코일을 165kHz 및 23.87kA/m(300Oe)에서 작동합니다.</li>
	<li>별도의 광섬유 온도 프로브를 튜브 중 하나에 놓습니다. 이전에 결정된 프로토콜 열 투여량까지 세포를 처리한다. 예는 43°C에서 30분(30/CEM43)입니다.</li>
	<li>튜브에 있는 배지에 세포를 재현탁하고 새 6웰 플레이트에 다시 플레이팅합니다. 새 번호판에 명확하게 라벨을 붙입니다. 목표는 수집된 모든 세포를 다시 플레이팅하는 것입니다(~1 x 106 셀). 알림: 배양되는 세포가 치료를 받았는지 확인하기 위해 새로운 6웰 플레이트를 사용해야 합니다. 오래된 플레이트를 사용하면 성공적으로 트립신 화되지 않은 플레이트에 여전히 세포가 남아있을 수 있습니다.</li>
	<li>필요한 경우 다음 실험 절차를 위해 RNA 또는 단백질 발현 분석을 위해 세포를 용해시킵니다.</li>
</ol>3. 생체 내 온열요법
<ol><li>세포 배양 및 접종<ol><li>B16F10 뮤린 흑색종 세포를 10% FBS 및 1% Pen/연쇄상 구균이 있는 RPMI 배지에서 배양합니다. 원하는 수의 동물을 접종하기에 충분한 세포를 제공하는 접시 / 접시를 사용하십시오. 예를 들어, 100, 000 개의 세포로 도금 된 10, 100 mm 접시는 48 시간 이내에 20 마리의 마우스 주사를위한 충분한 세포와 합류합니다.</li>
		<li>세포를 트립신화하고 순수 RPMI 배지(FBS 또는 펜/스트렙 없음)를 사용하여 수집합니다.</li>
		<li>세포를 계수하고 접종량과 마우스 수를 기반으로 원하는 세포 농도에 대한 용액을 만듭니다.</li>
		<li>기화된 이소플루란과 산소를 사용하여 6주 된 암컷 C57Bl/6 마우스를 마취합니다. 유도 될 때까지 5 % 이소 플루 란과 95 % 산소가 함유 된 플렉시 유리 상자에 동물을 넣습니다. 일단 유도되면, 동물을 제거하고 2% 이소플루란에서 페이스 콘을 사용하여 3.1.5-3.1.7 및 3.3.3-3.3.6단계를 완료하십시오. 알림: 치료 중 마취를 위해 내장 마취 봉쇄를 사용하십시오. 마우스 마취에 대한 표준 기관 프로토콜을 따르십시오. 동물 실험 전에 적절한 IACUC 승인을 확인하십시오. 마취 후 동물을 새장으로 되돌리고 회복을 모니터링하여 합병증이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>올바른 반사에 대한 반응이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>전기 면도기를 사용하여 오른쪽 측면을 면도하십시오.</li>
		<li>알코올 닦음으로 주사 부위를 청소하십시오. 1-2 x 106 세포를 주사하고, 28 G 바늘을 갖는 100 μL 유리 주사기를 사용하여, 50 μL의 배지에 분산시키고, 면도된 마취의 우측 옆구리에 피내로 분산시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>종양 성장/나노입자 주입<ol><li>캘리퍼스(길이, 너비 및 깊이)를 사용하여 종양을 3차원으로 측정하고 (길이 x 너비 x 깊이 x π)/6으로 부피를 계산합니다.</li>
		<li>종양 부피가 120 mm 3 (+/- 20 mm3)에 도달하면 동물을 연구에 두십시오. 조합 요법 코호트(즉, 대조군, mNPH, 방사선 및 조합)를 포함한 적절한 대조군 및 치료 그룹이 있는지 확인하여 연구를 설계합니다.</li>
		<li>3.1.4에 설명된 대로 mNP를 받을 마우스를 마취합니다.</li>
		<li>알코올 물티슈로 해당 부위를 청소하십시오. AMF 치료 3시간 전에 종양에 mNP를 주입합니다. 복용량이 종양의 철 / cm3 7.5mg이되도록 부피를 주사하십시오. 참고 : 실험실의 미공개 데이터에 따르면 최대 mNP 흡수는 3-6 시간에 발생합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>암프 치료<ol><li>마우스를 마취시키고 가열 패드에 올려 코어 온도를 유지하십시오.</li>
		<li>올바른 반사에 대한 반응이 없는지 확인하십시오. 마우스에서 귀 태그 또는 기타 금속 물체를 제거합니다.</li>
		<li>윤활된 광섬유 온도 프로브를 마우스의 직장에 부드럽게 놓습니다.</li>
		<li>카테터를 종양에 넣고 바늘을 제거하십시오. 카테터가 종양에서 너무 많이 튀어 나오지 않도록 자릅니다. 참고: 광섬유 온도 카테터는 마우스가 전신 마취 하에 있는 동안, 즉 카테터가 종양 가열 절차 동안에만 제자리에 있는 동안 배치 및 제거됩니다. 마우스는 시술시 NSAID 진통제 인 케토 프로 펜 (5mg / kg)을 단일 피하 투여받습니다. 카테터 배치와 관련된 단기 또는 장기간의 불편함이나 이환율을 관찰하지 못했습니다.</li>
		<li>3센서 광섬유 온도 프로브를 카테터에 삽입합니다. 카테터는 광섬유 온도 프로브 센서를 보호합니다.</li>
		<li>직장과 종양 내 프로브를 동물의 꼬리에 테이프로 붙여서 제자리에 유지되도록합니다.</li>
		<li>마우스를 50mL 튜브에 넣고 머리를 바닥으로 향하게 합니다. 튜브는 마취가 연결되고 전달 될 머리 근처에 구멍이 있어야합니다.</li>
		<li>설정된 코일 안에 튜브를 놓고 마취를 다시 연결합니다.</li>
		<li>광섬유 온도 프로브를 튜브에 느슨하게 배치하여 환경 온도를 측정합니다.</li>
		<li>냉각기를 켜고 냉각수가 순환되고 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>컴퓨터 소프트웨어가 다양한 온도를 표시하고 있는지 확인하고 CEM43 계산을 실시간으로 표시할 수 있도록 기록을 시작합니다. 필요한 CEM43은 이전에 결정된 용량입니다. 알림: 자석을 켜기 전에 빠르게 가열되므로 동물에 금속 물체가 부착되어 있지 않은지 확인하십시오. 또한 방에 있는 모든 사람에게 심박 조율기가 없고 안전하게 있어야 하는지 확인하십시오.</li>
		<li>낮은 전력 비율로 자석을 켭니다.</li>
		<li>광섬유 온도 프로브가 온도 변화를 기록하고 있는지 확인하십시오. 필드가 증가함에 따라 AMF가 활성화되면 온도가 증가합니다. 동물의 중심 온도가 38 ° C로 유지되도록하십시오. 조절된 에어 재킷을 사용하여 코어 온도를 조절하십시오.</li>
		<li>내장 된 제어 다이얼을 사용하여 발전기의 전원을 변경하여 자기장의 강도를 조정하면 종양의 온도 수준을 제어합니다.</li>
		<li>일단 AMF를 차단하면 원하는 투여량(예를 들어 CEM43 40)이 종양 내에서 달성된다.</li>
		<li>AMF가 종료되면 코일에서 튜브를 제거합니다.</li>
		<li>튜브에서 마우스를 제거하고 다양한 프로브 및 카테터를 추출합니다. 필요한 경우 새 금속 귀 태그로 동물에 태그를 지정하십시오.</li>
		<li>처리가 완료되면 냉각기를 종료하십시오.</li>
		<li>합병증이 없는지 마취에서 동물을 회복하십시오. 정상으로 돌아갈 수 있도록 행동을 모니터링하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

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이 시스템의 설계 및 구현은 정확하고 재현 가능한 in vitro 및 in vivo 자성 나노입자 온열요법 실험을 수행할 수 있는 기능을 제공합니다. AMF 주파수 및 전계 강도가 자성 나노입자 유형, 농도, 원하는 조직 위치 및 온도와 적절하게 일치하도록 시스템을 설계하는 것이 중요합니다. 또한 실시간으로 온도를 정확하게 모니터링하는 것은 안전과 정확한 열 선량(43°C/CEM에서 누적 등가 시간)을 계산하는 데 매우 중요합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 프로브를 배치하면 그림 2에서 볼 수 있듯이 열량과 심부 체온을 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다.
자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달을 위한 첫 번째 단계는 동물과 작업자를 위한 안전한 시스템을 구축하는 것입니다. 시스템의 모든 구성 요소는 운영 및 제공 관점에서도 잘 이해되어야합니다. 이 상황에서 이는 AMF 와...

온열요법은 역사적으로 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 암 치료에 사용되어 왔습니다. 오랜 사용 역사를 가지고 있지만이 치료법을 제공하는 가장 유리한 방법은 여전히 논의 중이며 질병 부위와 위치에 따라 다릅니다. 온열요법 전달 방법에는 마이크로파, 고주파, 집속 초음파, 레이저 및 금속 나노입자(예: 금 또는 산화철)1,2,3,4가 포함됩니다. 이러한 전달 방법은 발열 수준에서 수백 °C까지 다양한 치료 온도로 이어질 수 있습니다. 온열요법의 생물학적 효과는 주로 사용되는 온도와 치료 기간에 따라 달라집니다5. 이 원고와 목적을 위해 우리는 자성 나노 입자 온열요법(mNPH)에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법은 무독성, FDA 승인 산화철 나노 입자를 사용하여 집중되고 국소화되고 잘 모니터링되고 제어 된 온도 변화를 허용합니다.
다른 온열요법 양식의 한 가지 함정은 정확한 세포 표적화가 부족하다는 것입니다. 온열요법은 본질적으로 높은 치료율을 갖지 않으므로, 신중한 체온 측정 및 표적화가 필요하다6. mNPH는 mNP의 전신 또는 종양내 주사를 허용하며, mNP가 위치한 곳에서만 열이 발생하므로 종양에 대한 치료를 직접 표적으로 합니다. mNPH는 자성 나노입자가 세포의 내부 또는 외부에 위치할 때 효과적일 수 있다. 암 치료의 경우, mNPH의 일반적인 개요는 자성 나노 입자가 주입 (종양 내 또는 정맥 내)되고, 그런 다음 교류 자기장이 적용되어 나노 입자 자극이 지속적으로 재정렬되어 나노 입자와 관련된 세포 및 조직의 국부적 인 가열을 유도한다는 것입니다 7,8 . 나노 입자의 부피와 교류 자기장 (AMF)의 주파수 / 강도를 조정함으로써 조직 내에서 발생하는 온도를 신중하게 제어 할 수 있습니다.
이 치료법은 더 깊은 종양이 더 강한 AMF를 필요로하므로 와전류 가열의 위험이 증가하기 때문에 신체 표면 근처에있는 종양에서 잘 작동합니다9. 온열요법이 단독 요법으로 임상적으로 사용된다는 증거가 있지만, 종종 온열요법은 방사선 요법 또는 화학 요법과 결합되어 보다 표적화된 항암 효과를 유발합니다10,11,12. 방사선 요법과 함께 작동하는 온열요법의 임상 증거는 이전 간행물13에서 검토되었습니다. 우리 실험실은 mNPH 방법12,14,15를 사용하여 생쥐에서 돼지 및 자발적인 송곳니 암에 이르기까지 다양한 동물을 성공적으로 치료했습니다. 이 프로토콜은 국소 온열요법 치료의 효과를 단독으로 또는 다른 치료법과 함께 조사하는 데 관심이 있는 사람들을 위해 설계되었습니다.
온열요법에서 가장 중요한 요소 중 하나는 표적/종양 조직에 전달되는 열량을 실시간으로 측정하고 이해할 수 있다는 것입니다. 선량을 계산하고 비교하는 표준 방법은 43 ° C에서 가열의 누적 등가 분을 입증하는 것입니다. 이 알고리즘을 사용하면 전달 시스템, 최대 및 최소 온도(특정 범위 내) 및 가열/냉각 매개변수(5,16)와 무관한 용량을 비교할 수 있습니다. CEM 계산은 39-57 ° C 사이의 온도에서 가장 잘 작동합니다5. 예를 들어, 우리가 수행 한 일부 연구에서 CEM43 30 (즉, 43 ° C에서 30 분)의 열 용량을 선택했습니다. 이 선량을 선택하면 시험관 내에서 안전하고 효과적인 면역 유전 효과를 단독으로 또는 단일 방사선 량과 함께 볼 수있었습니다17.
자성 나노입자 온열요법의 경우 적절한 전달 시스템을 구축할 때 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. 계측 설계에는 고전력으로 작동하는 경우에도 자기장 전달 장비가 냉각 상태를 유지하도록 하는 냉각기 사용과 모든 온도, 전력 평가 및 제어 시스템이 활성화되지 않은 경우 시스템이 켜지지 않도록 하는 페일 세이프 절차와 같은 중요한 안전 요소가 포함됩니다. 또한 생체 내 및 시험관 내 상황 모두에서 고려해야 할 중요한 생물학적 요인이 있습니다. 배양된 세포를 사용할 때는 결과에 영향을 미칠 수 있는 생리학적 변화를 피하기 위해 성장 배지에서 처리하고 일관된 실행 가능한 온도를 유지해야 합니다. 개별 나노입자 유형의 경우 AMF 기반 가열 매개변수를 계산할 때 전자파 흡수율(SAR)을 아는 것이 중요합니다. 유사하게, 원하는 가열을 달성하는 데 필요한 세포와 조직의 mNP/Fe 농도를 아는 것이 중요합니다. In vivo 방법은 치료 중 동물을 마취 상태로 유지해야하며 치료 내내 동물의 핵심 체온을 정상 수준으로 유지해야하기 때문에 세부 사항에 더 많은주의가 필요합니다. 마취 상태에서 발생하는 것처럼 동물의 체온이 떨어지도록 허용하면 치료되는 조직의 열 선량과 관련하여 전반적인 결과에 영향을 줄 수 있습니다.
이 원고에서는 다목적 자성 나노입자 온열요법 시스템을 설계하고 구성하는 데 사용되는 방법과 고려해야 할 중요한 사용 요소에 대해 논의합니다. 설명된 시스템은 자성 나노입자 온열요법의 견고하고 일관되며 생물학적으로 적절하고 안전하며 잘 제어된 전달을 가능하게 합니다. 마지막으로, 우리가 수행하는 mNPH 연구에는 종종 방사선, 화학 요법 및 면역 요법과 같은 다른 치료법이 포함된다는 점에 유의해야합니다. 이러한 결과가 의미가 있으려면 전달 된 열이 다른 양식의 효능 및 / 또는 안전성 독성 (또는 그 반대)과 동물의 웰빙에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 결정하는 것이 중요합니다. 이러한 이유와 앞서 언급한 선량 측정 및 치료 상황 때문에, 자성 나노입자 온열요법 투여 정확도와 연속 코어 및 목표 온도 측정에 엄격한 주의를 기울이는 것이 필수적이다. 이 프로토콜의 목표는 안전하고 효과적인 자성 나노입자 온열요법을 전달하기 위한 간단하고 일관된 방법과 설명을 제공하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>.25% Trypsin</td><td>Corning</td><td>45000-664</td><td>많은 회사에서 사용 가능</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf 22363204</td><td>많은 회사에서 사용 가능</td></tr><tr><td>B16F10 쥐 흑색종 세포</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>C57/Bl6 마우스</td><td>Charles river</td><td>027C57BL/6</td><td>6주 된 암컷 마우스</td></tr><tr><td>냉각기</td><td></td><td>코일을 냉각시키는</td>열 관리 <td>NQ 5 시리즈</td> 냉각기</tr><tr><td>냉각수 유체</td><td>Dow Chemical Company</td><td>Dowtherm SR-1</td><td>안테나 냉각 유체</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Hyclone</td><td></td><td>SH30071 많은 회사에서 구할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>광섬유 프로브, 소프트웨어 및 섀시</td><td>FISO</td><td></td><td>FISO 진화 소프트웨어는 온도를 읽는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>IR 카메라</td><td>Flir</td><td></td><td>의도하지 않은 가열을 모니터링하는 적외선 카메라</td></tr><tr>산화<td>철 나노 입자</td><td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td><td>Bionized NanoFerrite</td><td>덱스트란 코팅 산화철 나노 입자</td></tr><tr><td>마우스 코일, 솔레노이드</td><td>Fluxtrol</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Corning</td><td>45000-652</td><td>많은 회사에서 사용 가능</td></tr><tr><td>RF 발생기</td><td>Huttinger</td><td>TIG 10/300</td><td>전원</td></tr><tr><td>RPMI 미디어</td><td>Corning</td><td>45000-396</td>은 <td>많은 회사에서 사용할 수 있습니다</td></tr></tbody></table>.

맞춤형 전달 시스템을 사용한 자성 나노입자 온열요법의 체외 및 생체 내 전달

In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

고열은 오랫동안 암 치료에 사용되어 왔습니다. 기술은 뜨거운 철봉의 종양 내 삽입에서 39 ° C (발열 수준)에서 1,000 ° C (전기 소작)까지의 온도에서 전신적으로 전달되는 종양 항체 표적 자성 나노 입자에 이르기까지 다양하며 치료 시간은 몇 초에서 몇 시간까지 다양합니다. 온도-시간 관계(열 선량)는 높은 열 선량으로 인해 조직 절제를 일으키고 열 선량을 낮추면 혈류 증가, 약물 축적 및 면역 자극과 같은 치사 효과가 발생합니다. 현재 가장 유망한 의료 요법 중 하나는 자성 나노입자 온열요법(mNPH)입니다. 이 기술은 비 침습적, 무독성 교류 자기장으로 전신 또는 종양 내로 전달 될 수있는 자성 나노 입자를 활성화하는 것을 포함합니다. 자성 나노 입자의 크기, 구성 및 결합과 자기장의 주파수 및 전계 강도는 주요 가열 결정 요인입니다. 당사는 크고 작은 동물 모델과 배양된 세포에서 재현 가능한 자성 나노입자 온열요법을 전달하기 위한 정교한 기기와 기술을 개발했습니다. 여러 위치에서 연속적인 실시간 온도 모니터링을 사용하는 이 접근 방식은 비표적 조직 가열을 제한하면서 표적 조직(종양) 또는 세포에 잘 정의된 열 투여량을 전달할 수 있습니다. 여러 현장에서 온도를 정밀하게 제어 및 모니터링하고 산업 표준 알고리즘(43°C/CEM43에서 누적 등가 시간)을 사용하여 열 선량을 정확하게 결정하고 정량화할 수 있습니다. 다양한 온도, 열 선량 및 생물학적 효과를 허용하는 당사의 시스템은 상업적 인수와 사내 엔지니어링 및 생물학 개발의 조합을 통해 개발되었습니다. 이 시스템은 생체외, 시험관내 및 생체내 기술 간의 신속한 전환을 허용하는 방식으로 최적화되었다. 이 프로토콜의 목표는 재현 가능하고 정확한 자성 나노입자 치료(mNP) 온열요법을 제공하기 위한 효과적인 기술과 시스템을 설계, 개발 및 구현하는 방법을 입증하는 것입니다.

시험관 내 연구 세포는 자성 나노 입자 / 철과 AMF의 양과 농도가 적절하게 일치하는 경우에만 원하는 온도와 열 선량을 달성하고 유지합니다. 자성 나노입자를 사용하여 체외(및 생체 내)에서 세포를 가열할 때, 내재화된 자성 나노입자가 있는 세포에서 온열요법을 달성하려면 특정 수준의 세포 내 mNP/Fe가 필요하며 mNP 로딩 세포의 수와 근접성이 서로 필요하다는 점에 유의해야 합니다. 표적 세포/조직의 mNP/Fe 수준이 가열 효과를 달성하기에 충분하면 자기장 주파수와 강도를 조정하여 원하는 온도와 효과를 얻을 수 있습니다. 적절하게 도금되면 다른 용량과시기 간의 유전 적 및 분자 적 차이를 조사하는 추가 연구를 추구 할 수 있습니다17. 도 1 은 시험관내 방법의 개략도를 나타낸다.
이러한 시험관내 방법은 세포 mRNA 및 단백질 발현 변화를 조...

이 프로토콜은 정교한 전달 및 모니터링 시스템을 사용하여 자성 나노입자 온열요법의 정확한 전달에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다.

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

이 방법은 전임상 모델에서 자기 나노입자 온열요법 치료를 제공하는 가장 강력하고 재현 가능한 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술은 지역 환경, 동물 생리학 및 열량을 정확하게 모니터링하고 제어하여 나노 입자 온열요법을 정확하고 일관되게 전달할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 나노 입자 가열은 표적 조직에 국한되어야 한다는 점을 명심하십시오.재현성과 안전성을 보장하기 위해 풍부하고 적절한 온도 측정을 사용하는 것이 필수적입니다.도금 후 24시간 후 B16 F10 쥐 흑색종 세포는 자성 나노 입자를 밀리리터당 3mg 이온의 최종 농도로 추가합니다. 나노 입자가 매체와 자성 나노 입자의 저장 용액을 미리 생성하여 우물 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.나노 입자를 첨가 한 후 48 시간이 지나면 처리되는 각 웰에 0.5 밀리리터의 트립신을 첨가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 현미경을 사용하여 세포가 분리되었는지 확인합니다. 그런 다음 각 웰에 1ml의 배지를 추가하고 각 웰에 대해 명확하게 라벨링된 별도의 튜브를 사용하여 모든 세포를 1.5ml 튜브에 수집합니다.60G에서 튜브를 2-3분 동안 돌려 세포를 펠릿화합니다. 그런 다음 코일 내의 물이 가득 찬 스페이서에 튜브를 놓습니다. 매체와 셀 팔레트를 섭씨 37도로 유지하기 위해 수조의 온도를 설정합니다.튜브와 수조 내부의 온도를 모니터링하기 위해 별도의 광섬유 온도 프로브를 설정합니다. 냉각기를 켜고 냉각수가 코일을 통해 흐르고 있는지 확인하십시오. 그런 다음 전원을 켜고 최대 백분율을 원하는 필드로 조정합니다.10kW 발전기로 구동되는 14회전 솔레노이드 코일을 미터당 165kHz 및 23.87kW로 작동합니다. 이전에 결정된 프로토콜 열 선량에 도달할 때까지 세포를 처리합니다. 처리 후, 튜브 내의 배지에 펠릿화된 세포를 다시 현탁시키고 명확하게 라벨링된 새로운 6웰 플레이트로 다시 플레이팅합니다.마우스를 마취한 후 알코올 물티슈로 종양을 청소합니다. AMF 치료 3시간 전에 자성 나노 입자를 종양에 주입합니다. 3시간 후, 마우스를 다시 마취하고 오른쪽 반사 신경에 반응이 없는지 확인합니다.귀 제거 tag 마우스의 기타 금속 물체를 제거하고 윤활된 광섬유 온도 프로브를 직장에 부드럽게 놓습니다. 종양에 카테터를 삽입합니다. 바늘을 제거합니다.그런 다음 카테터가 종양에서 너무 많이 튀어나오지 않도록 자릅니다. 3개의 센서 광섬유 온도 프로브를 카테터에 삽입하면 센서를 보호할 수 있습니다. 직장 및 종양 내 프로브를 동물의 꼬리에 테이프로 붙입니다.마취제를 연결하고 전달할 수 있는 머리 근처에 구멍이 있는 50ml 튜브에 마우스를 넣습니다. 코일 설정 내에 튜브를 놓고 마취제를 다시 연결합니다. 광섬유 온도 프로브를 튜브에 느슨하게 배치하여 환경 온도를 측정합니다.그런 다음 냉각기를 켜고 냉각수가 순환되고 있는지 확인하십시오. 컴퓨터 소프트웨어가 다양한 온도를 표시하고 있는지 확인하고 필요한 CEM43 선량이 이전에 결정되었어야 하는 위치에 CEM43 계산이 실시간으로 표시될 수 있도록 기록을 시작합니다. 낮은 전력 비율로 자석을 켜고 광섬유 온도 프로브가 온도 변화를 기록하고 있는지 확인하십시오.요컨대, 동물의 중심 온도는 섭씨 38도로 유지되어 조절된 에어 재킷으로 조절됩니다. 종양의 온도 수준을 제어하는 전력을 변경하여 자기장의 강도를 조정합니다. 원하는 용량에 도달하면 AMF를 차단합니다.코일에서 튜브를 제거하고 튜브에서 마우스를 제거합니다. 그런 다음 냉각기를 끕니다. 프로브와 카테터를 추출하고 필요한 경우 동물에게 새 금속 귀 태그를 부착합니다.마취에서 회복하는 동안 마우스를 모니터링하여 정상적인 행동을 재개하고 합병증이 없는지 확인합니다. 생체 내 저체온증의 경우 실시간 효능 및 안전성 평가를 위해 전략적 사이트에 가능한 한 많은 광섬유 온도 프로브를 배치하는 것이 필수적입니다. 이 프로브를 사용하면 실험 전반에 걸쳐 온도를 기록할 수 있으므로 정확한 선량 측정 및 열 이력이 가능합니다.생체 내 실험 중에 생성된 곡선이 여기에 표시되어 온도를 면밀히 모니터링하고 종양 온도를 원하는 범위 내로 유지하기 위해 시스템을 조정할 수 있는 기능을 강조합니다. 화산 플롯은 in vitro 및 in vivo 자기 나노입자 온열요법 처리 후 차등 발현 유전자를 보여주며, 분자 기술을 사용하여 온열요법 효과를 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 종양 온도, 동물 심부 온도 및 열 선량의 정확한 모니터링은 지속적인 치료 전달을 위해 필요합니다.온열요법 후에는 치료의 효과와 메커니즘을 이해하기 위해 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 그리고 더 큰 치료 효과를 위해 다른 치료법을 시행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

부착된 쥐 미세아교세포를 멀티웰 플레이트에 담습니다.폴리아크릴산 코팅 자성 나노입자(MNP)를 테스트 웰에 추가하고 다른 웰은 대조군으로 처리되지 않은 상태로 둡니다.세포를 배양하여 엔도사이토시스를 통해 MNP 흡수를 허용하여 내재화를 가능하게 합니다.결합되지 않은 MNP를 제거하기 위해 완충액으로 세척합니다.세포를 분리하기 위해 효소 용액을 첨가하십시오.분리된 세포를 튜브로 옮기고 원심분리하여 펠릿화합니다.상청액을 버리고 펠릿을 기저 배지에 재현탁한 다음 현탁액을 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.마그네틱 어플리케이터 장치 내의 구리 코일 중앙에 튜브를 놓습니다.코일은 교류 자기장 (AMF) 을 생성하는 반면 어플리케이터는 일정한 목표 온도를 유지합니다.AMF는 MNP와 상호 작용하여 열을 발생시켜 세포 구조를 파괴하고 세포 사멸 경로를 유발합니다. 대조적으로, MNP가 없는 대조군 셀은 열 손상을 나타내지 않습니다.MNP 처리된 세포의 생존력 감소는 자기 온열요법으로 인한 열...

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MRI 호환 주문 설계된 레이저 기반의 가열 장치는 특히 종양 영역에서 감온 리포좀 제제로부터의 방출을 활성화하기 위해 피하 종양 국소 가열을 제공하기 위해 개발되었다.

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자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블

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