Name: 라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 Conpokal 기법을 활용한 라이브 셀의 형광 이미징과 역학적 특성 동시 분석 방법을. 공초점 현미경과 원자력 현미경을 결합하여 세포 역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 번호 P20GM130456에서 NIH COBRE 자금을 인정합니다. 우리는 이 일에 도움을 준 영국 빛 현미경 코어에 감사드립니다. 나탈리아 코로트코바 박사가 S. 뮤탄과 E. faecalis균을 제공했습니다. 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사법의 조합을 설명하기 위해 연극 에 단어, Conpokal의 첫 번째 언급은 박사 브래드 베론에 기인, 화학 및 재료 공학, 켄터키 대학에서, 박사 마사 그레이디 (해당 저자)와 논의, 누가 켄터키 대학의 화학 및 재료에 교수에 합류 기대 (해당 저자) 박사.

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

마이크로 또는 나노 규모의 기계적 평가 도구는 종종 단일 세포 또는 미생물 수준에서 변형 특성을 밝히기 위해 사용되며, 별도의 고해상도 현미경 도구는 세포 외 공정 및 구조적 특징을 시각화하는 데 사용됩니다. Conpokal은 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사법(AFM)을 단일 기악 플랫폼으로 결합한 것입니다. Conpokal 기술은 먼저 비 생물학적 폴리머 시스템에서 구현되었으며, 소프트 표면과 접촉하여 단단한 표면의 접착력, 탄성 및 표면 장력을 결정하는 것이 목표였습니다. 공초점 이미지는 폴리머가 하드 프로브1,2에서변형, 부착 및 해제하는 방법을 시각적으로 렌더링했습니다. 폴리머에서 생물학적 샘플에 이르기까지,이 기술은 거의 동시 살아있는 세포 또는 미생물 공초점 이미징 및 AFM에 대한 기회를 제공합니다.
세포 탄력의 변화는 많은 인간 질병의 병인에 연루되었습니다3 혈관 장애 포함4말라리아5,6, 겸상적혈구 빈혈7관절염8천식9, 및 암6,10,11,12,13,14,15. 세포의 역학을 측정하는 일반적인 기술은 자기 구슬의 사용을 포함16,17, 광학 핀셋18,19, 마이크로 피펫 포부8,20,21,22및 AFM11,23,24,25,26. 살아있는 세포에 AFM을 적용한 이후, 세포 지형을 특성화하기 위해 쉽게 적응되었습니다.27,28 기계적 특성뿐만 아니라11,24,29,30,31 나노 스케일 정밀도. AFM은 미세학에 더욱 적응되었습니다.32,33, 주파수 변조34,35, 및 크리프25,36,37 다양한 세포주들의 점탄성 특성을 연구하는 실험. 적절한 나노접촉 모델의 사용은 AFM에서 생산된 힘 들여쓰기 측정에서 정량적 탄성 값을 추출하는 데 매우 중요합니다.1,2. 세포 탄력에 대한 세포골격약의 영향을 조사하는 AFM 연구는 탄성 계골이 매우 영향을 받는 것으로 나타났습니다.38. 탄성 계수 측정에 근거하여, 많은 연구원은 암세포가 그들의 비 변환된 대응보다는 더 부드럽다는 것을 보여주었습니다11,38,39. 증가 기형성은 가능성이 전이 및 조직을 침투하는 암세포의 능력에 있는 중요한 역할을 합니다40. 이러한 행동은 세포의 세포 골격 조직의 수정에 의해 조절됩니다.38,41,42. 암 외에도 또 다른 종류의 기계의존성 질환은 호흡기 질환입니다. 예를 들면, 급성 호흡 긴장 증후군은 점점 더 많은 인간에게 매년 영향을 미칩니다. 환자가 기계적 환기에 넣을 때, 산소의 높은 농도와, 그들의 상태가 악화 될 수 있음을 보여 주었다43. AFM을 가진 폐포 상피 대식세포를 관찰하는 일련의 연구에서 과학자들은 산소가 풍부한 환경의 추가가 액틴 형성으로 인한 세포의 강성을 증가시키는 것을 발견했습니다. AFM이 세포 수준에서 호흡기 기능에 대한 대기 환경 영향과 궁극적으로 인간의 치유 및 건강에 미치는 영향의 대표적인 예44,45,46. 상처쪽으로 이동하는 동안 상피 세포 강성또한 AFM을 통해 평가될 수 있고 탄성 계수의 변이가 향후 세포 확산을 신호하기 위하여 생깁니다47,48. 따라서, 병들게 된 세포가 어떻게 다른지 이해하기 위해 세포 역학을 정량적으로 측정하고, 건강한 세포와 상호 작용할 수 있는 실용적인 필요성이 있다.
AFM은 또한 접착제 특성 및 표면 구조를 연구하는 데 사용됩니다. 원자력 현미경은 접촉 역학을 사용하여 샘플에 대한 정보를 수집하는 다양한 모드가 있습니다. 살아있는 생물학적 샘플의 경우, 두 가지 주요 목적은 맵 표면 높이뿐만 아니라 정량적 기계적 특성값(예:탄성 계골, 접착제 력)을 얻는 것이다. 이러한 모드에는 일정한 캔틸레버 진폭을 간헐적으로 접촉하는 일정한 캔틸레버 진폭을 유지하여 캔틸레버를 올리거나 낮추는 탭 모드(간헐적 접촉이라고도 함)가 포함되며, 이는 캔틸레버를 올리거나 낮춰 일정한편향을 유지한다(49). AFM 시스템의 힘 매핑을 사용하여 접착 맵을 수집할 수 있습니다. 캔틸레버는 샘플을 특정 힘에 들여쓰기한 다음 철회됩니다. 후퇴에 저항하는 힘은 검출기에 의해 측정되어 힘 변위 그래프를 생성합니다. 접착력은 후퇴 중에 측정된 최대 힘입니다. 표면 형태학은 마이크로 또는 나노 수준에서 샘플에 대한 자세한 뷰를 제공합니다. 캔틸레버는 각 픽셀의 캔틸레버 의 움직임에 의해 포착된 들여쓰기 및 편향을 기반으로 샘플 전반에 걸쳐 래스터 스캔을 완료하여 마이크로 및 나노 크기의 특징을 드러냅니다. AFM을 사용하면 펩티도글리칸구조(50,폴리머 체인 정렬51,플래그렐라52,라멜리포디아53,및 필리포디아(54)와 같은 작은 특징의 크기를 측정할 수 있다. AFM의 힘은 강제 변위 곡선과 비 광학 적 위상 이미지에 있지만, 공초점 현미경 검사는 형광 라벨 샘플의 상세한 이미징을 제공합니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사(CLSM)는 살아있는 세포, 고정 세포 및 조직55,56,57을이미징하기 위한 지배적인 기술이다. CLSM은 1955년부터 생물학적 이미징에 사용되어 왔으며, 창립 이래 58,59. 공초점 현미경의 작동 원리(즉,핀홀을 통해 초점 빛의 거부)는 크게 동일하게 유지되었지만, 기술 구현은 매우 다양하게되고있다56,57,58,60. 공초점 이미징은 회전 디스크시스템(61)에서와같이 다중점 스캐닝을 통해 구현될 수 있으며, 단일 레이저 빔의 점 스캐닝, 라인 스캐닝(62)과 같이, 또는 다중 요소검출기를통해 후속 픽셀 재할당을 통한 점 확산 기능을 이미징할 수 있다. 공초점 이미징의 실용성을 확장하는 최근의 발전으로는 레이저 스캐닝 기능, 고속 공명 스캐닝 및 고감도검출기(63,64,65)가 포함된다. 모든 공초점 시스템이 넓은 시야 현미경을 통해 가지고 있다는 장점은 특히 두꺼운 샘플에서 더 세밀하게 z 축에서 광학 단면을 수행하는 기능입니다. 카메라 기반 검출을 사용하는 와이드필드 현미경은 초점 평면에서 방출되는 빛을 수집하고, 동시에 조명 경로의 모든 곳에서 방출되는 빛을 수집합니다. 핀홀을 닫음으로써, 신호를 줄이는 대신, 축 및 측면 해상도를 모두 증가시킬 수있다66. CLSM에서는 엑스티클 레이저가 x-y 시야에서 스캔됨에 따라 방출 신호 수집을 통해 픽셀단위로 이미지가 픽셀단위로 구축됩니다. 샘플의 z 축을 따라 여러 x-y 평면의 컬렉션은 샘플57, 67의3차원 아키텍처를 재구성하는 데 사용할 수 있다. 형광 단백질의 도입과 함께 공초점 현미경 검사는 세포 생물학68에대한 우리의 이해에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 그것은 신경 과학69에필수적인 도구가되었다. CLSM은 정기적으로 지워진 조직을 관찰하고 면역 염색 된 뇌 및 신경 네트워크 아키텍처70의포괄적 인 이미지를 얻는 데 사용됩니다. 이 응용 프로그램은 시냅스 접촉에 새로운 통찰력과 뇌의 뉴런과 신경교 세포 사이의 통신에 새로운 통찰력을초래했다 71. 뇌세포에서 소포에 이르기까지 형광 염색 프로토콜은 치료 기술의 발전을 위한 공초점 현미경검사를 통해 세포 기능의 검사 및 캡처를지원합니다(72,73).
그들은 인상적이고 다재 다능 한 도구 개별적으로, 공초점 및 원자력 현미경 검사의 조합 (Conpokal) 연구원은 독특한 다양 한 세포 세포 세포 및 그들의 각각역학의 관찰과 지형 및 미세 기계식 세포/조직 속성을 상관 관계를 수 있습니다. 페어링된 계측기를 사용하면 사용자가 기본적으로 검색 중인 내용을 "참조"할 수 있습니다. 하나의 기술에 비해 큰 이점. Conpokal을 사용하면 AFM을 통한 힘 매핑이 공초점 이미지에 오버레이되어 세포 강성, 접착 또는 형태와 샘플 내의 세포골격 구조를 상호 연관시지정합니다( 예: Conpokal 방법의 전반적인 목표는 연구원이 간결하고 효과적인 방식으로 살아있는 샘플을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공하여 단일 플랫폼에서 이미지와 재료 특성 데이터를 모두 제공하는 것입니다. 이 작품에서는 적절한 샘플 선택 및 준비, 계측기 설정, 캔틸레버 교정 을 포함한 Conpokal의 작동을 시연하고 성공적인 문제 해결에 대한 지침을 제공합니다. 프로토콜 후, 우리는 성공적인 박테리아와 세포 AFM 높이 매핑을 포함하는 대표적인 결과를 제공, 박테리아와 세포 AFM 계수 매핑, 다중 표지 세포의 공초점 이미징, 동일한 세포 공초점 및 AFM을 통해. 우리는 Conpokal 절차 중요한 단계, 문제 해결 권장 사항, 기술 제한, 중요성 및 방법에 대한 향후 전망에 대한 논의로 마무리합니다.

<table><tbody><tr><td>Acoustic</td><td>Enclosure JPK-Bruker</td><td>Acoustic</td><td>Enclosure Chamber, 소음 완화에 사용</td></tr><tr><td>BioTracker 488 녹색 미세소관 세포골격 염료</td><td>Millipore</td><td>Sigma SCT142</td><td>포유류 세포의 미세소관 라벨링에 사용</td></tr><tr><td>CP-qp-CONT-BSG AFM 팁</td><td>NanoAndMore</td><td>CP-qp-CONT-BSG-B</td><td>Collodial AFM tips 생물학적 샘플</td></tr><tr><td>의 탄성률 측정에 적합딜 염색 (1,1'- 디옥타 데실 -3,3,3', 3'- 테트라 메틸 인도 카르 보시아닌 과염소산 염 ( 'DiI'; DiIC18(3)))</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D282</td><td>포유류 세포의 원형질막 라벨링에 사용</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>VWR</td><td>VWRL0100-0500</td><td>세포 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285601</td><td>생물학적 환경 Fetal</td></tr><tr><td>Bovine Serum</td><td>Fischer Scientific</td> <td>시뮬레이션에 사용45000-736</td><td>세포 배양 배지의 구성</td></tr><tr><td>요소 Fisher BioReagents 미생물학 배지 첨가제 : 효모 추출물</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>박테리아 배양 배지의 구성</td></tr><tr><td>요소 FluoroDish 세포 배양 접시</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td> <td>FD35-100</td> Nanowizard 4a AFM Hoechst 33342 핵산<td>의 전체 기능에 필요한 측벽이 10mm 미만인 유리 바닥 접시</td></tr><tr><td> stain</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62249</td><td>포유류 세포의 핵을 라벨링하는 데 사용되며 살아있는 세포에 대한 좋은 핵 마커</td></tr><tr><td>인간 배아 신장 293 세포</td><td>ATCC Global Bioresource Center</td><td>CRL-1573</td><td>프로토콜에 사용되는 포유류 세포</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>VWR</td><td>47743-716</td><td>세포 배양 접시의 코팅</td></tr><tr><td>모델: PFQNM-LC-A-CAL AFM 팁</td><td>Bruker</td><td>PFQNM-LC-A-CAL</td><td>높이가 큰 샘플(예: 진핵 세포)에 잘 작동하는 AFM 팁NanoWizard</td></tr> <tr><td>4a</td><td>JPK-Bruker</td><td>NanoWizard 4a</td><td>AFM</td></tr><tr><td>Nikon A1 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>A1 HD25</td><td>명시야, 에피 형광 및 컨포칼 이미징에 사용되는</td></tr> 현미경 <tr><td>PENICILLIN/STREPTOMYCIN</td><td>VWR</td><td>16777-164</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>의 구성 요소PetriDishHeater</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>원하는 페트리 접시 샘플 온도 유지</td></tr><tr><td>qp-BioAC-Cl AFM 팁</td><td>나노 센서</td><td>qp-BioAC-Cl-10</td><td>다양한 강성의 세 가지 다른 AFM 캔틸레버</td></tr><tr><td>교체 가능한 탄소 섬유 팁 핀셋</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5051</td><td>섬세한 AFM 팁을 유리 장착 블록에 조심스럽게 배치하고 제거하는 데 사용</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth Bacto</td><td>BD DIFCO Bacterius Ltd</td><td>Bacto-249240</td><td>박테리아 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>Vancomycin, BODIPY FL Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V34850</td><td>박테리아 세포벽을 형광 라벨링하는 데 사용</td></tr></tbody></table>

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(conpokal) 근처

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

마이크로 및 나노 규모의 기계적 특성화에 사용할 수 있는 기술은 지난 수십 년 동안 폭발적으로 성장했습니다. 스캐닝 및 투과 전자 현미경의 추가 개발에서부터 원자력 현미경 검사법의 발명, 형광 이미징의 발전에 이르기까지, 작은 물질의 연구를 가능하게 하는 기술에 상당한 이득이 있었습니다. Conpokal은 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사법 (AFM)을 결합한 portmanteau로, 프로브가 표면을 "찌르다". 각 기술은 정성적 및/또는 정량적 이미지 수집에 매우 효과적이지만 Conpokal은 혼합 형광 이미징 및 기계적 특성으로 테스트할 수 있는 기능을 제공합니다. 거의 동시 공초점 이미징 및 원자력 탐사를 위해 설계된 Conpokal은 살아있는 미생물 샘플에 대한 실험을 용이하게합니다. 페어링된 계측기의 추가 통찰력은 AFM에 의한 측정된 기계적특성(예:탄성 계류, 접착, 표면 거칠기)의 공동 국소화를 제공하며, 서브셀룰러 구성 요소 또는 공초점 현미경 을 통해 관찰가능한 활동. 이 작업은 동일한 세포, 동일한 영역, 공초점 이미징 및 기계적 특성화를 달성하기 위해 동시에 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사법의 작동을 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

Conpokal 기술은 도 1A에 schematically 표현되며 설정 의 이미지가 도 1B에표시됩니다. AFM에서 동일한 구조와 공초점 현미경 검사를 통해 생물학적 구조를 정확하게 공동 찾기 위해서는 설치 중에 두 시스템의 정렬이 매우 중요합니다. 서로의 공간 요구 사항에 익숙한 평판 좋은 공초점 및 AFM 제조업체를 선택합니다. 또한, 기술의 성공적인 구현은 좋은 염색 절차, 생물학적 구조의 고정, AFM 팁의 적절한 선택에 의존한다. 살아있는 세포의 높이는 수시로 AFM 화상 진찰을 위한 도전을 제시합니다. 살아있는 HEK 셀을 통해 AFM 스캔은 그림 2A에표시됩니다. 이 특정 HEK 셀의 높이는 약 10 μm였으며, 녹색으로 라인스캔(도 2B)에의해 입증되었다. 0 오프셋(팁은 캔틸레버의 맨 끝에 있음) 또는 셀 높이보다 큰 팁높이(예:팁 높이 ≥ 10 μm)를 가진 AFM 팁은 개별 세포의 고도로 해결된 이미지를 생성합니다. 부적절한 AFM 팁 선택으로 인한 불량 검사의 예가 그림 2C에포함되어 있습니다. 이 이미지에서, 검은 색 픽셀은 AFM 압소가 큰 셀 높이로 인해 범위를 벗어났음을 나타내는 셀의 정점에 나타났다. AFM 캔틸레버의 끝은 셀 높이에 비해 팁 높이가 부족하여 팁 오프셋으로 인해 이미지(둥근 사각형)에 나타났습니다. AFM 이미지의 이러한 아티팩트는 셀을 이미지하기 위해 다른 AFM 팁을 선택해야 함을 나타냅니다.
이 방법에 는 살아있는 세포 이미징을 위한 정확한 프로브와 함께 형광 염색에 있는 능률적인 라벨이 필요합니다. 우리는 핵 얼룩 (형광 청색), 마이크로 투블러 얼룩 (형광 녹색), 및 지방성 막 얼룩 (적색 형광)을 가진 도 3A에 표시된 3 색 공초점 이미지를 수행했습니다. 이러한 라이브 셀 프로브는 제한된 스펙트럼 중복 및 표준 필터 큐브와의 호환성 때문에 선택되었습니다. 우리는 또한 그림 3B에밝은 필드 광학 이미지를 포함했다.
AFM에서 나노 기계 모델과 함께 팁 들여쓰기를 분석하여 표면의 계수 맵을 생성합니다. 팁 형상에 대한 Hertz 모델 핏및 포물선 프로파일(반경 8nm)을 사용하여 생성된 계수 맵의 예는 도 4A(도 3에표시된 것과 동일한 두 개의 세포)의 셀 형상의 3D 재구성에 오버레이되어 있다. 레이저 공초점 z 스택의 해당 3D 프로젝션은 도 4B에도시된다.
이 방법은 또한 작은 생물학적 구조에 적합, 그의 마이크로 및 나노 현미경 기능을 사용 하 여 해결 하기 어려운 단일 박테리아를 포함 하 여. 진행 중 연구는 연쇄상 구균 뮤탄의항생제 내성을 영향을 미치는 세포 벽 내의 기계적 메커니즘을 탐구하기 위해 Conpokal 기술을 활용합니다. Conpokal은 동일한 셀 샘플에서 라이브, 인솔루션, 데이터수집(예:표면 형태, 탄성 계수, 접착 강도 및 표면 거칠기)을 용이하게 하여 기계적 특성을 세포벽 성분의 존재 또는 부재와 결합합니다. 도 5A, B에는 연쇄상 구균 뮤테륨의 AFM 스캔 및 측정 된 계수 맵이 포함됩니다. 더 나은 해상도는 전통적인 공초점 현미경 검사법보다는 AFM을 가진 이 규모에서 달성되었습니다.
도 6은 세포벽에 부착되는 녹색 형광세포 구조 얼룩으로 얼룩진 엔테로코커스 대변의 식민지의 공초점 이미지를 포함한다. 도 5 및 도 6은 진핵 세포 이외에 미생물에 대한 콩포크 기술의 적용가능성을 입증한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig01.jpg"> 그림 1: Conpokal 설정입니다. (A)콩포칼 기술의 회로도. (B)계측기 설정의 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig02.jpg"> 그림 2: 살아있는 세포의 원자력 현미경 검사. (A)두 HEK 세포의 AFM 이미지. (B)신장 프로파일(A내 녹색선)은 10μm에서 세포 높이가 매우 크다는 것을 나타내는 HEK 셀의 높이 프로파일(A내 녹색선)이다. (C)AFM 압전이 세포 정점에 범위를 벗어나 캔틸레버 끝의 역이미징의 증거가 있는 성상세포 세포의 불량 AFM 이미지가 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig03.jpg"> 그림 3: 살아있는 세포의 공초점 및 밝은 필드 현미경 검사법. (A)핵얼룩(형광파), 마이크로투룰레 얼룩(형광녹색) 및 리포필막 얼룩(홍색)으로 염색된 살아있는 HEK 세포의 공초점 현미경 검사. (B)해당 브라이트필드 광학 이미지. 스케일 바는 10 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig04.jpg"> 그림 4: 살아있는 HEK 세포의 AFM 및 공초점 현미경 검사의 3D 렌더링 비교. (A)헤르츠 모델 핏과 포물선 프로파일(반경 8nm)을 이용하여 생성된 모듈러스 맵은 AFM으로부터 셀의 3D 재구성에 겹쳐진 팁 형상에 대해 이다. (b)핵얼룩(형광파), 마이크로투블러 얼룩(형광녹색) 및 리포필막 얼룩(적색형)을 가진 레이저 공초점 z 스택의 상응하는 3D 프로젝션. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig05.jpg"> 그림 5: 박테리아 샘플의 AFM. (A)AFM 스캔 및(B) 연쇄상 구균 뮤탄균의 계체 맵을 측정하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61433/61433fig06.jpg"> 그림 6: 박테리아 샘플의 공초점 현미경 검사법. 녹색 형광막 얼룩이있는 엔테로 코커스 대변의 식민지의 공초점 이미지. 스케일 바는 5 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61433/61433fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Conpokal은 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사를 프로브를 사용하여 샘플 표면을 찌르습니다. 두 기술이 개별적으로 효과적이지만 Conpokal은 기계적 특성화를 통해 형광 공동 지역화를 용이하게 합니다. Conpokal 기술의 주요 장점은 거의 동시 이중 현미경 검사법입니다.공초점은 지역 특정 기계적 특성을 제공하는 AFM 프로빙 전후에 사이토셀레탈 및 기타 세포 공정을 조사합니다. 이 기술은 예를 들어, 뇌 세포는 전기 자극과 강제 거래를 검사하기 위해 생리적 조건하에서 조사 될 수있다, 메카노 생물학 필드 내에서 영향을 미친다. 분석을 시작하기 전에 원하는 데이터 수집을 위해 적절한 AFM 캔틸레버를 선택하고 장갑, AFM 칩 장착 단계, 핀셋 및 작은 드라이버가 칩을 유리 블록에 장착합니다.조심스럽게 유리 블록의 중심에 AFM 칩을 배치합니다. 캔틸레버플러스 AFM 칩의 매우 작은 부분은 유리 블록의 눈에 보이는 비 불투명 한 부분에 있어야합니다. 드라이버를 사용하여 칩이 유리 블록에 맞을 때까지 나사를 조이고 렌즈를 사용하여 칩이 올바르게 지향되는지 확인합니다.칩이 제대로 지향되면 유리 블록을 AFM 헤드에 적절한 방향으로 배치하고 유리 블록을 제자리에 고정시킵니다. 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 교정 접시의 바닥을 찾은 후, AFM 시스템 Z 스테퍼 모터 제어판을 사용하여 샘플 위에 AFM 캔틸레버 2000 미크론을 이동합니다. 밝은 필드 조명과 Z 스테퍼 모터 제어판을 사용하여 AFM 칩을 100~200미크론 단계로 유리 접시 바닥으로 천천히 낮추어 AFM 팁을 페트리 접시에 충돌하지 않도록 합니다.X Y를 제어하는 수동 마이크로미터또는 기기 플랫폼에서 AFM 헤드의 일반 모션을 찾습니다. AFM 캔틸레버의 그림자가 어두워지고 모양이 선명해지면 수동 마이크로미터를 사용하여 AFM 헤드를 수정하고 시야 내에서 AFM 캔틸레버의 위치를 조정합니다. 이 때 조회 테이블을 조정해야 할 수 있습니다.AFM 팁이 접시 의 바닥에 가까워지고 있음을 나타내는 현미경 소프트웨어 보기에 그림자가 나타나는 지 확인합니다. 팁이 대부분 초점이 될 때까지 작은 단계를 사용하여 AFM 팁을 낮춥니다. 레이저가 위치에있을 때, AFM 팁이 캔틸레버에있는 곳의 뒷면에 레이저를 배치하기 위해 레이저 정렬 다이얼을 사용합니다.레이저 정렬 패널은 0 볼트보다 큰 합계 신호를 표시해야 합니다. AFM 캔틸레버의 모든 방향에서 작은 거리인 레이저를 이동하여 AFM 팁에 남아 있는 동안 최대 합계 신호가 달성될 때까지 이동합니다. 레이저 위치가 설정되면 수동으로 제어된 편향 다이얼을 사용하여 수직 및 측면 편향을 0으로 설정합니다.수직 및 측면 편향 노브를 사용하여 검출기를 정렬하여 대상이 중심이 되고 레이저 정렬 패널에서 관찰된 수직 또는 측면 편향이 없습니다. 교정 창을 열고 모든 실험특정 정보를 입력합니다. 레이저 라이트 필터를 교체합니다.보정하기 전에 공초점 현미경 광원을 끄고 AFM 인클로저를 닫아 실내 조명이나 진동에서 발생하는 잠재적 인 소음을 완화하십시오. 교정 버튼을 눌러 시스템이 팁을 교정할 수 있도록 합니다. 교정이 완료되면 캔틸레버의 강성과 그 감도가 교정 패널에 표시됩니다.그런 다음 자동 접근 명령 버튼을 사용하여 팁을 샘플 접시의 하단으로 낮추고 재생 버튼을 눌러 스캔을 시작하기 전에 스킨 영역, 해상도, 설정 점, Z 길이 및 픽셀 시간의 크기를 설정합니다. 현미경 소프트웨어에서 공초점 현미경 이미징의 경우, 공초점 기능을 활성화하고 샘플을 염색하는 데 사용 된 염료에 적합한 레이저 라인을 선택합니다. 샘플에서 이러한 기능을 흥분시키고 이미지화하기 위해 하나 또는 여러 레이저 라인을 선택하고 게인을 샘플 형광을 최적화하지만 소음양을 제한하는 값으로 설정합니다.레이저 전원을 조정하여 채도픽셀을 방지하는 동시에 동적 범위를 최대화하고 핀홀 크기를 한 영역 단위로 설정하여 광학 단면화의 해상도를 최대화합니다. 필요한 경우 샘플 밝기에 따라 값을 조정합니다. 픽셀 거주 시간을 설정하려면 약 2마이크로초 의 거주 시간으로 시작하여 필요에 따라 샘플 밝기를 반영하도록 조정합니다.선택한 목표에 대한 픽셀 크기를 선택하려면 계측기가 나이퀴스트 옵션 버튼과 이미지의 선택한 픽셀 수를 통해 픽셀 크기를 계산하도록 합니다. 다음으로 스캔 옵션을 선택하고 데이터 수집을 시작합니다. 포커스 노브를 사용하여 가장 선명한 형태로 샘플 피처를 나타내는 초점 평면, 데이터 수집을 시작하는 스캔 버튼 및 캡처 버튼을 사용하여 2차원 이미지를 캡처합니다.Nyquist 옵션을 통해 픽셀 크기를 제어하는 패널을 사용하여 스캔 영역 크기를 줄여 단일 셀만 둘러싸습니다. 수집 도구를 활성화하고 샘플의 피처를 가장 명확하게 비추는 레이저 라인만 사용하여 평면 사이의 제안된 간격을 사용하여 측정할 볼륨에 대한 시작 및 마감 평면을 설정합니다. 파일이름을 지정하고 연결된 폴더에 저장합니다.또는 샘플 두께에 대한 사전 지식이 존재하는 경우, 부피를 정의하고 상부를 중간 평면 위에 샘플 두께를 가지도록 초점을 조정하여 가장 밝고 날카로운 중간 평면을 선택하고, 아래쪽은 중간 평면 아래 두께를 가지도록 설정한 다음 적절한 단계 크기를 선택합니다. 지금 실행 버튼을 눌러 인수를 실행합니다. 수집이 완료되면 파일을 적절한 폴더에 저장합니다.실험이 끝나면 유리 블록을 제거하면서 장갑을 착용하고 마운팅 스테이션에 놓습니다. 고무 그립핀셋을 사용하여 AFM 칩을 조심스럽게 제거하고 사용된 팁을 사용되었음을 나타내기 위해 액세스 에서 벗어나 수납 상자의 위치에 다시 배치합니다. 향후 참조의 경우 실험에서 사용된 팁을 참고합니다.여기서, 살아있는 HEK 세포를 통해 대표적인 AFM 스캔이 표시됩니다. 이 특정 HEK 세포에 대한 높이는 라인 스캔에 의해 입증 된 바와 같이 약 10 미크론이었다. 여기서 부적절한 AFM 팁 선택으로 인한 불량 한 검사의 예를 관찰 할 수 있습니다.이 이미지에서, 검은 색 픽셀은 큰 셀 높이로 인해 AFM PA 영역이 범위를 벗어났음을 나타내는 셀의 정점에 나타났다. AFM 캔틸레버의 끝은 셀 높이에 비해 팁 높이가 부족하여 팁 오프셋으로 인해 이미지에 나타납니다. AFM 이미지의 이러한 아티팩트는 셀을 이미지하기 위해 다른 AFM 팁을 선택했음을 나타냅니다.세 가지 색 공초점 이미징을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 핵, 마이크로 튜블러 및 지방혈막을 시각화한다. 나노 기계 모델과 함께 팁 들여쓰기의 분석은 표면의 계수 맵의 생성을 허용한다.여기서, 레이저 공초점 Z 스택의 상응하는 3D 프로젝션이 도시된다. 연쇄상 구균 뮤테륨의 이러한 대표적인 분석에서 관찰된 바와 같이 AFM 스캔 및 측정된 계달체 맵은 미생물을 위해 획득할 수 있습니다. 입증 된 바와 같이, 더 나은 해상도는 AFM이 규모에서 달성 될 수있다, 기존의 공초점 현미경 검사보다.접착제 힘 매핑은 분자 상호 작용을 시각화하기 위해 conpokal을 통해 수행되는 기술입니다. 예를 들어, 결합 운동학을 관찰하기 위해 세포 표면 분자의 변조를 연구한다. Conpokal은 의학 미생물학에서 구조 기능 관계를 탐구하기위한 새로운 경로를 안내합니다.예를 들어, 물리적 및 화학적 이벤트 및 펩티도글리칸 층은 항생제 내성에 연결될 수 있다.

near-simultaneous-laser-scanning-confocal-atomic-force-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

Mitochondrial 융합은 시간이 지남에 mitochondrial 네트워크 photoconverted 매트릭스 타겟 GFP의 평균 추적에 의해 측정되었다. 지금까지 하나의 세포는 한 번에 한 시간 동안 운동 분석을 받다 수 있습니다. 우리는 동시에이를 통해 데이터 수집 과정을 속도, 여러 개의 세포를 측정하는 방법을 제시한다.

병렬 공촛점 현미경을 사용하여 여러 세포의 운동 데이터를 취득 빠르고 높은 해상도, mtPA-GFP 기반 Mitochondrial 퓨전 분석

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다.

치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

단백질-단백질 상호 작용은 BiFC(bimolecular fluorescence complementation)와 PALM(photoactivated localization microscopy)을 결합하여 나노미터 공간 해상도로 세포에서 시각화됩니다. 여기에서는 개별 Ras-Raf 복합체의 나노 스케일 클러스터링 및 확산을 시각화하기 위해 U2OS 세포에서 Ras-Raf 상호 작용을 이미징하기 위해 BiFC-PALM을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

이분자 형광 보완과 광 활성화 현지화 현미경 (BiFC-PALM)

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

이 프로토콜은 절단 된 신경을 통해 형광 칼슘 염료를 마우스 운동 신경 말단에 로딩하는 방법을 설명합니다. 또한, 컨포칼 현미경을 사용하여 말초 신경 종말에서 빠른 칼슘 과도 현상을 기록하는 독특한 방법이 제시됩니다.

Confocal 현미경을 사용한 높은 시간 분해능을 가진 마우스 신경근 접합부의 칼슘 과도 상태 등록

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

라이브 그람 음성 및 그람 양성 세균은 젤라틴 코팅 운모에 고정화 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 액체에 몇 군데 있습니다.

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

배우세요 Conpokal 기법을 활용한 라이브 셀의 형광 이미징과 역학적 특성 동시 분석 방법을. 공초점 현미경과 원자력 현미경을 결합하여 세포 역학 연구에 활용할 수 있습니다.

라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

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