라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

Conpokal은 공초점 현미경 검사법과 원자력 현미경 검사를 프로브를 사용하여 샘플 표면을 찌르습니다. 두 기술이 개별적으로 효과적이지만 Conpokal은 기계적 특성화를 통해 형광 공동 지역화를 용이하게 합니다. Conpokal 기술의 주요 장점은 거의 동시 이중 현미경 검사법입니다.

공초점은 지역 특정 기계적 특성을 제공하는 AFM 프로빙 전후에 사이토셀레탈 및 기타 세포 공정을 조사합니다. 이 기술은 예를 들어, 뇌 세포는 전기 자극과 강제 거래를 검사하기 위해 생리적 조건하에서 조사 될 수있다, 메카노 생물학 필드 내에서 영향을 미친다. 분석을 시작하기 전에 원하는 데이터 수집을 위해 적절한 AFM 캔틸레버를 선택하고 장갑, AFM 칩 장착 단계, 핀셋 및 작은 드라이버가 칩을 유리 블록에 장착합니다.

조심스럽게 유리 블록의 중심에 AFM 칩을 배치합니다. 캔틸레버플러스 AFM 칩의 매우 작은 부분은 유리 블록의 눈에 보이는 비 불투명 한 부분에 있어야합니다. 드라이버를 사용하여 칩이 유리 블록에 맞을 때까지 나사를 조이고 렌즈를 사용하여 칩이 올바르게 지향되는지 확인합니다.

칩이 제대로 지향되면 유리 블록을 AFM 헤드에 적절한 방향으로 배치하고 유리 블록을 제자리에 고정시킵니다. 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 교정 접시의 바닥을 찾은 후, AFM 시스템 Z 스테퍼 모터 제어판을 사용하여 샘플 위에 AFM 캔틸레버 2000 미크론을 이동합니다. 밝은 필드 조명과 Z 스테퍼 모터 제어판을 사용하여 AFM 칩을 100~200미크론 단계로 유리 접시 바닥으로 천천히 낮추어 AFM 팁을 페트리 접시에 충돌하지 않도록 합니다.

X Y를 제어하는 수동 마이크로미터또는 기기 플랫폼에서 AFM 헤드의 일반 모션을 찾습니다. AFM 캔틸레버의 그림자가 어두워지고 모양이 선명해지면 수동 마이크로미터를 사용하여 AFM 헤드를 수정하고 시야 내에서 AFM 캔틸레버의 위치를 조정합니다. 이 때 조회 테이블을 조정해야 할 수 있습니다.

AFM 팁이 접시 의 바닥에 가까워지고 있음을 나타내는 현미경 소프트웨어 보기에 그림자가 나타나는 지 확인합니다. 팁이 대부분 초점이 될 때까지 작은 단계를 사용하여 AFM 팁을 낮춥니다. 레이저가 위치에있을 때, AFM 팁이 캔틸레버에있는 곳의 뒷면에 레이저를 배치하기 위해 레이저 정렬 다이얼을 사용합니다.

레이저 정렬 패널은 0 볼트보다 큰 합계 신호를 표시해야 합니다. AFM 캔틸레버의 모든 방향에서 작은 거리인 레이저를 이동하여 AFM 팁에 남아 있는 동안 최대 합계 신호가 달성될 때까지 이동합니다. 레이저 위치가 설정되면 수동으로 제어된 편향 다이얼을 사용하여 수직 및 측면 편향을 0으로 설정합니다.

수직 및 측면 편향 노브를 사용하여 검출기를 정렬하여 대상이 중심이 되고 레이저 정렬 패널에서 관찰된 수직 또는 측면 편향이 없습니다. 교정 창을 열고 모든 실험특정 정보를 입력합니다. 레이저 라이트 필터를 교체합니다.

보정하기 전에 공초점 현미경 광원을 끄고 AFM 인클로저를 닫아 실내 조명이나 진동에서 발생하는 잠재적 인 소음을 완화하십시오. 교정 버튼을 눌러 시스템이 팁을 교정할 수 있도록 합니다. 교정이 완료되면 캔틸레버의 강성과 그 감도가 교정 패널에 표시됩니다.

그런 다음 자동 접근 명령 버튼을 사용하여 팁을 샘플 접시의 하단으로 낮추고 재생 버튼을 눌러 스캔을 시작하기 전에 스킨 영역, 해상도, 설정 점, Z 길이 및 픽셀 시간의 크기를 설정합니다. 현미경 소프트웨어에서 공초점 현미경 이미징의 경우, 공초점 기능을 활성화하고 샘플을 염색하는 데 사용 된 염료에 적합한 레이저 라인을 선택합니다. 샘플에서 이러한 기능을 흥분시키고 이미지화하기 위해 하나 또는 여러 레이저 라인을 선택하고 게인을 샘플 형광을 최적화하지만 소음양을 제한하는 값으로 설정합니다.

레이저 전원을 조정하여 채도픽셀을 방지하는 동시에 동적 범위를 최대화하고 핀홀 크기를 한 영역 단위로 설정하여 광학 단면화의 해상도를 최대화합니다. 필요한 경우 샘플 밝기에 따라 값을 조정합니다. 픽셀 거주 시간을 설정하려면 약 2마이크로초 의 거주 시간으로 시작하여 필요에 따라 샘플 밝기를 반영하도록 조정합니다.

선택한 목표에 대한 픽셀 크기를 선택하려면 계측기가 나이퀴스트 옵션 버튼과 이미지의 선택한 픽셀 수를 통해 픽셀 크기를 계산하도록 합니다. 다음으로 스캔 옵션을 선택하고 데이터 수집을 시작합니다. 포커스 노브를 사용하여 가장 선명한 형태로 샘플 피처를 나타내는 초점 평면, 데이터 수집을 시작하는 스캔 버튼 및 캡처 버튼을 사용하여 2차원 이미지를 캡처합니다.

Nyquist 옵션을 통해 픽셀 크기를 제어하는 패널을 사용하여 스캔 영역 크기를 줄여 단일 셀만 둘러싸습니다. 수집 도구를 활성화하고 샘플의 피처를 가장 명확하게 비추는 레이저 라인만 사용하여 평면 사이의 제안된 간격을 사용하여 측정할 볼륨에 대한 시작 및 마감 평면을 설정합니다. 파일이름을 지정하고 연결된 폴더에 저장합니다.

또는 샘플 두께에 대한 사전 지식이 존재하는 경우, 부피를 정의하고 상부를 중간 평면 위에 샘플 두께를 가지도록 초점을 조정하여 가장 밝고 날카로운 중간 평면을 선택하고, 아래쪽은 중간 평면 아래 두께를 가지도록 설정한 다음 적절한 단계 크기를 선택합니다. 지금 실행 버튼을 눌러 인수를 실행합니다. 수집이 완료되면 파일을 적절한 폴더에 저장합니다.

실험이 끝나면 유리 블록을 제거하면서 장갑을 착용하고 마운팅 스테이션에 놓습니다. 고무 그립핀셋을 사용하여 AFM 칩을 조심스럽게 제거하고 사용된 팁을 사용되었음을 나타내기 위해 액세스 에서 벗어나 수납 상자의 위치에 다시 배치합니다. 향후 참조의 경우 실험에서 사용된 팁을 참고합니다.

여기서, 살아있는 HEK 세포를 통해 대표적인 AFM 스캔이 표시됩니다. 이 특정 HEK 세포에 대한 높이는 라인 스캔에 의해 입증 된 바와 같이 약 10 미크론이었다. 여기서 부적절한 AFM 팁 선택으로 인한 불량 한 검사의 예를 관찰 할 수 있습니다.

이 이미지에서, 검은 색 픽셀은 큰 셀 높이로 인해 AFM PA 영역이 범위를 벗어났음을 나타내는 셀의 정점에 나타났다. AFM 캔틸레버의 끝은 셀 높이에 비해 팁 높이가 부족하여 팁 오프셋으로 인해 이미지에 나타납니다. AFM 이미지의 이러한 아티팩트는 셀을 이미지하기 위해 다른 AFM 팁을 선택했음을 나타냅니다.

세 가지 색 공초점 이미징을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 세포 핵, 마이크로 튜블러 및 지방혈막을 시각화한다. 나노 기계 모델과 함께 팁 들여쓰기의 분석은 표면의 계수 맵의 생성을 허용한다.

여기서, 레이저 공초점 Z 스택의 상응하는 3D 프로젝션이 도시된다. 연쇄상 구균 뮤테륨의 이러한 대표적인 분석에서 관찰된 바와 같이 AFM 스캔 및 측정된 계달체 맵은 미생물을 위해 획득할 수 있습니다. 입증 된 바와 같이, 더 나은 해상도는 AFM이 규모에서 달성 될 수있다, 기존의 공초점 현미경 검사보다.

접착제 힘 매핑은 분자 상호 작용을 시각화하기 위해 conpokal을 통해 수행되는 기술입니다. 예를 들어, 결합 운동학을 관찰하기 위해 세포 표면 분자의 변조를 연구한다. Conpokal은 의학 미생물학에서 구조 기능 관계를 탐구하기위한 새로운 경로를 안내합니다.

예를 들어, 물리적 및 화학적 이벤트 및 펩티도글리칸 층은 항생제 내성에 연결될 수 있다.