Name: 소프트 리소그래피의 변경을 사용하여 루트 표면 미세 구조의 생물 적 복제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 배우세요 뿌리 표면 미세 구조의 생물학적 복제 기술을 사용하여 식물-환경 상호작용을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 다양한 재료로 합성 표면을 만들어 뿌리 표면 구조의 물리적 힘을 분석할 수 있게 합니다.

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연구는 MK에 농업 연구 조직에서 종자 기금에 의해 지원되었다.

1. 식물과 뿌리 준비 성장
<ol><li>옵션 1: 줄기에서 모험적인 뿌리를 준비한다.<ol>
<li>식물을 재배하기 위한 응원 트레이를 가져 가라.</li>
		<li>트레이를 흙으로 채웁니다.</li>
		<li>트레이의 각 셀에 M82 토마토 품종 의 씨앗 을 추가합니다.</li>
		<li>씨앗을 작은 토양으로 덮습니다.</li>
		<li>물이 트레이의 바닥을 채우고 토양이 물을 흡수할 때 빗방울로 바닥에서 트레이에 물을 공급합니다.</li>
		<li>일주일에 한 번 트레이의 바닥에 물 1 L 당 2 mL을 추가합니다.</li>
		<li>25 °C에서 성장하는 챔버에서 성장합니다.</li>
		<li>9h 라이트(7:00-16:00)의 조명 조건을 15h의 어둠과 번갈아 사용하십시오.</li>
		<li>3 주 후 토양에서 식물을 제거합니다.</li>
		<li>줄기와의 상호 작용 지점에서 식물에서 루트 시스템을 잘라냅니다.</li>
		<li>뿌리없는 식물을 물로 가득 찬 비커에 넣습니다.</li>
		<li>며칠 후, 줄기에서 나오는 모험적인 뿌리를 자르고 복제에 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>옵션 2: 씨앗 발아 뿌리를 준비합니다.<ol>
<li>페트리 접시 크기의 필터 용지에 물을 적시다.</li>
		<li>페트리 접시 안에 여러 M82 씨앗 (10 개 이하)을 넣어.</li>
		<li>플레이트를 25°C에서 배양합니다.</li>
		<li>매일 종이를 수분하게 합니다.</li>
		<li>발아 된 뿌리가 충분히 길면 (약 5 일), 씨앗을 제거하고 복제에 뿌리를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 폴리우레탄에서 루트 음의 복제본 준비
<ol><li>음의 복제 솔루션을 생성하려면 9.49 g의 이우레탄 디메타크릴레이트를 20mL 바이알에 추가합니다.<ol>
<li>바이알에 에틸 메타크릴레이트 1.45mL를 추가합니다.</li>
		<li>실온(RT)에서 저은 용액이 맑아지고 균일해질 때까지 저어줍니다. 참고: 약 2h는 균일한 용액에 도달하기에 충분합니다.</li>
		<li>가소제 3mL, 디틸 프탈레이트, RT에서 1시간 동안 저어줍니다. 참고 : 디틸 프탈레이트는 아크릴 단조로 오해입니다.</li>
		<li>사진 시이터의 300 μL, 2-하이드록시-2-메틸프로필피오페논을 추가하고 RT에서 밤새 저어줍니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 솔루션을 RT에 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>루트의 음수 복제본을 생성하려면 깨끗한 유리 슬라이드를 사용하여 음수 복제 솔루션의 1mL을 부어 넣습니다.<ol>
<li>2\u20123 뿌리를 솔루션 위에 놓습니다. 뿌리가 솔루션에 의해 완전히 덮여 있는 것을 허용하지 마십시오.</li>
		<li>8\u201210 분 동안 8 W 울트라 바이올렛 (UV) 램프 아래에 슬라이드를 유지합니다. 너무 오랫동안 자외선 아래에 용액을 유지하지 마십시오. 참고: 폴리우레탄을 너무 어렵게 만들어 루트를 제거하는 것이 불가능하므로 자외선 아래에 용액을 너무 오래 보관하지 않는 것이 중요합니다.</li>
		<li>UV 램프를 끄고 유리 슬라이드에서 복제본을 제거하고 에탄올로 채워진 페트리 접시에 넣어 반응하지 않은 단조량을 제거합니다.</li>
		<li>음수 복제본을 얻으려면 집게를 사용하여 복제본에서 루트를 매우 느리게 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PDMS에서 루트 양성 복제본을 준비합니다.
<ol><li>양수 복제본용 혼합물을 생성하려면 10g의 디메틸 실록산을 종이 컵에 놓습니다.<ol>
<li>경화제 1 g을 넣고 완전히 섞습니다.</li>
		<li>기포를 제거하기 위해 2 시간 동안 진공 상태에서 건조기에 혼합물을 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>양수 복제본을 생성하려면 폴리우레탄 네거티브 복제본을 페트리 접시에 놓습니다.<ol>
<li>음수 복제본 위에 PDMS 혼합물을 붓습니다.</li>
		<li>미세 구조의 적용범위를 보장하기 위해 진공을 2h로 적용하십시오.</li>
		<li>RT에서 하룻밤 페트리 요리를 보관하십시오.</li>
		<li>경화 된 양수 복제본을 음수 복제본과 손으로 분리합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 에틸 셀룰로오스에서 루트 양성 복제본을 준비합니다.
<ol><li>에틸 셀룰로오스 용액을 생성하려면 100ml 컵에 가소제로 디틸 플라탈레이트 1.32 ml를 넣습니다.<ol>
<li>에탄올 20mL를 넣고 RT에서 2시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>에틸 셀룰로오스 3.3 g를 넣고 밤새 저어줍니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>양수 복제본을 생성하려면 폴리우레탄 네거티브 복제본을 페트리 접시에 놓습니다.<ol>
<li>에틸 셀룰로오스 용액을 음의 복제본 위에 붓습니다.</li>
		<li>페트리 요리를 RT에서 하룻밤 동안 유지합니다.</li>
		<li>포셉에 의해 음수 복제본에서 양수 복제본을 매우 느리게 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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우리는 뿌리 표면 미세 구조의 복제를위한 새로운 방법을 제시한다. 이 메서드는 잎 표면 미세 구조 복제4의기존 방법에 의존 합니다. 이 방법을 개발하기 위해, 우리는 잎에 대한 기존의 방법을 조정했다. 잎 복제 방법을 뿌리로 복사하는 데 문제가 있는 단계가 루트 성형의 첫 번째 단계를 포함한다는 것을 깨달았습니다. 이것은 생물학적 조직을 수반하기 때문에 방법의 가장 민감한 부분입니다. 그 결과, 우리는 경화에 비교적 온화한 조건을 요구하여 생물학적 조직에 최소한의 손상을 일으키는 중합체를 선택하고 싶었습니다. UV라이트(29)에서빠르게 중합(10분 이내)할 수 있기 때문에 폴리우레탄을 선택했습니다. 또한, 일단 중합30을 매우 단단하고 우리는이 속성이 폴리 우레탄 금형에서 뿌리를 비교적 쉽게 제거 할 수 있기를 바랍니다.
제시된 방법은 네거티브 이미지(음수 복제본)가 첫 번째 단계에서 형성되고 복제가 네거티브 복제본에 기초하여 두 번째 단계에서 형성되는 2단계 접근법이다. 이것은 우리가 작업 할 수있는 재료의 범위를 확장합니다. 잎 표면 미세 구조 복제는 주로 PDMS 또는 에폭시재료(11, 31)에서,31수행되었다. 일부 작업은 다른 물질, 특히 미생물 성장을 지원하는재료(13,32)로수행되었다., 이는 최근 몇 년 동안 이 방법이 잎 표면 구조의 맥락에서 미생물 표면 상호 작용을 연구하는 데 사용되었기 때문이다. 그러나 잎의 맥락에서 이 방법에셀룰로오스와 같은 재료는 사용되지 않았습니다. 폴리우레탄 네거티브 복제본을 금형및 양성 복제본용 다양한 재료로 사용하는 것이 좋습니다. 즉, 다양한 재질에서 양수 복제본을 만드는 것은 음의 복제본이 만들어지면 비교적 쉽습니다. 현재 셀룰로오스 유도체를 사용하고 있지만, 셀룰로오스 유도체와 함께 펙틴 및리그닌(33) 33,,34와 같은 뿌리 표면에 보다 관련성이 있는 물질을 사용할 가능성을 모색하고 있습니다.
또한 잎은 2D 표면이기 때문에 뿌리 표면이 구부러져 3D 표면이기 때문에 기존의 잎 표면 미세 구조 복제 방법에 따라 확장됩니다. 폴리우레탄 솔루션에 전체 루트를 포함시키면 릴리스가 허용되지 않으므로 전체 표면의 복제를 활성화하지 않습니다. 따라서 루트 표면 미세 구조를 복제할 때 루트의 한쪽을 선택해야 합니다. 생성된 합성 표면은 곡면이 약 절반이지만 전부는 아닙니다. 우리의 가정은 루트 표면의 구조적 특징은 주로 루트 길이를 따라 축에 대칭된다는 것입니다. 그러나 이러한 대칭이 가정되지 않는 연구에서복제할 적절한 측면 루트를 선택하도록 주의해야 합니다.
우리는 뿌리가 금형으로 사용될 수있는 두 가지 옵션을 제시합니다. 첫 번째는 줄기에서 자란 모험적인 뿌리의 옵션이며 두 번째는 종이에 발아 된 뿌리의 옵션입니다. 첫 번째 옵션은 주로 이러한 뿌리와 함께 작동 하기 쉬운 방법을 연습에 연구원을 돕기 위한 것입니다. 두 번째 옵션은 환경 조건에 관계없이 다른 품종의 뿌리 사이에서 찾을 수있는 유전 적 차이를 나타냅니다. 이러한 표면은 중요한 연구 도구로 사용될 수 있지만, 환경이 뿌리 표면 구조, 특히 뿌리가35,,36으로자라는 토양에 강한 영향을 미칠 수 있음을 알아야 한다. 토양에 의해 가해지는 기계적 응력으로 인해, 뿌리가토양(37)에침투함에 따라 표면에 발생하는 상처 이외에 일부 형태학적 변화가 발생할 수밖에 없다. 토양에서 뿌리를 제거하고 구조를 손상시키지 않고 청소하는 것은 매우 어려운 작업입니다. 따라서, 우리는 안정적으로 토양에서 성장 뿌리의 뿌리 표면 미세 구조를 모방하는이 방법을 사용하는 능력에 관해서는 낙관적이지 않다. 그러나, 미세 구조의 변화가 눈에 띄게 명확한 유전적 차이 또는 환경 적 차이에 초점을 맞춘 연구를 위해,이 방법은 뿌리 표면 미세 구조의 영향을 연구하는 도구로 사용할 수 있습니다.
우리의 방법은 뿌리 표면의 미세 구조 적 특성을 모방하는 불활성 표면을 생성합니다. 이 방법은 다른 모든 효과에서 루트 환경 상호 작용에 구조적 효과 분리 하도록 설계 되었습니다 하는 동안, 우리는 그 상호 작용에 화학 화합물을 무시할 수 없습니다. 일부 미생물은 화합물, 특히 영양소를 첨가하지 않고는 표면에서 생존하거나 기능하지 않을 수 있습니다. 이 플랫폼의 개발의 다음 단계는 구조와 결합 될 때 다른 상호 작용에 미치는 영향을 연구하기 위해 화학 화합물의 제어 추가 될 것입니다.
이 방법은 뿌리-미생물 상호 작용을 연구하기 위한 합성 플랫폼의 개발의 첫 번째 단계로 개발되었다. 여기서 우리는 뿌리 표면의 미세 구조를 모방하고 이 초기 플랫폼은 미생물 거동에 표면 미생물 구조의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 이 플랫폼은 자연 시스템의 다른 많은 요소가 없기 때문에 제한됩니다. 이 플랫폼은 표면을 생성하기 위해 올바른 재료를 사용하고 시스템에 다른 중요한 화학 물질을 추가하여 더욱 개발되어야합니다. 보다 진보된 플랫폼에서는 화학물질의 공간 분포를 상상할 수도 있습니다. 그러나, 현재 뿌리 미생물 상호 작용에 있는 구조적 효력을 격리하기 위하여 그밖 방법이 없기 때문에, 우리는 연구원이 그 상호 작용에 있는 구조 특정 질문을 하기 위하여 이 초기 플랫폼을 이용할 수 있기를 바랍니다.

잎 표면 미세 구조의 복제는 생체 모방 연구 분야1,,2,,3,,4에서공지된 방법입니다. 잎 표면 미세 구조의 초기 복제는 미세 구조, 특히 스토마타,,,5,6,7,8,89,,10의더 나은 시각화를 위해 잎 표면에 적용 된 매니큐어 및 고무 재료를 사용하여 수행되었다. 이어서 상기 방법이 개선되었고, 고급 폴리머는 연석소법을 사용하여 잎 표면 미세구조를 모방하는 데 사용되었으며, 특히 초소수성 표면의 생체모방의맥락에서2,3,,44,11,,12. 최근 몇 년 동안, 본 방법은 천연 잎 필로스피어(15)의 일환으로 병원성1513, 14,14 또는 유익한지 표면에 거주하는 잎 표면과 미생물 간의 상호작용에 대한 연구에서 유용한 도구로 입증되었다. 자연 계통의 단순화는 순수합성 시스템이,,표면(15, 16,17,18)으로사용되더라도 표면-미생물 상호작용연구에서 매우 유용하다는 것이 입증되었다.,16
잎 표면 미세 구조의 복제는 다른 미생물과 잎의 표면에 발생하는 상호 작용을 연구하기위한 유용한 도구로 나타났지만 식물 뿌리에는 그러한 도구가 존재하지 않습니다. 식물 뿌리는 땅 아래에 거주하기 때문에 연구하기가 더 어렵고 모든 상호 작용은 토양 내에서 발생합니다. 잎과 마찬가지로, 뿌리 표면 미세 구조는 뿌리 미생물 상호 작용에 역할을 할 가능성이 높습니다. 그러나, 현재는 복잡한 뿌리-미생물 상호작용에서 뿌리 표면 미세구조의 특정 역할을 분리하는 방법이 존재하지 않는다. 가장 많이 연구된 뿌리 표면 미세 구조 특징은 루트모발(19,,20,,21)이다. 루트 모발은 표면적을 증가시키고 영양분과 물22를보다 효율적으로 섭취할 수 있게 함으로써 중요한 역할을 하지만, 뿌리 미생물 상호 작용의 구조적 특징으로서의 참여는 결코 테스트되지 않았습니다.
잎에서 연약한 리소그래피에 가장 널리 사용되는 폴리머는 폴리디메틸 실록산(PDMS)이다. PDMS 속성은 잎 큐티클15,,23의것과 유사합니다. 그러나, 식물 뿌리에서 가장 풍부한 물질은 PDMS26,27,28의것과,다른 성질을 가진 셀룰로오스24,25이다. ,, PDMS를 사용하여 루트 환경 상호 작용에서 표면 미세 구조 효과를 연구하기 위한 합성 플랫폼을 구축하면 이상적이지 않습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 다양한 재료로부터 합성 뿌리 표면 미세 구조 복제본을 형성할 수 있게 한다. 잎 표면 미세 구조 복제를위한 방법과 마찬가지로 이것은 2 단계 프로세스입니다. 첫 번째 단계는 생물학적 조직(root)을 폴리우레탄 몰드(음의 복제본)로 성형하는 원천으로 사용합니다. 뿌리 표면 미세 구조의 음수 이미지를 나타내는 폴리우레탄 몰드는 PDMS 및 셀룰로오스 유도체를 포함한 다양한 재료로부터 뿌리 표면 미세 구조의 양수 복제를 생성하는 베이스로 사용될 수 있다. 이러한 루트 표면 복제는 나중에 루트-미생물 상호 작용에서 표면 구조 역할을 이해하는 플랫폼으로 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>2-하이드록시-2-메틸프로피오페논</td><td>시그마</td><td>405655</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 프탈레이트</td><td>114520010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>디우레탄 디메타릴레이트</td> 시<td>그마</td><td>436909</td><td></td></tr><tr><td>에틸 셀룰로오스</td><td>232705000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸 메타크릴레이트</td><td>시그마</td><td>234893</td><td></td></tr><tr><td>샤피르 용액</td><td>GAT 비료</td><td>6-2-4</td><td></td></tr><tr><td>실가드 184 키트</td><td>폴리머-G</td><td>510018400500</td><td></td></tr></tbody></table>

소프트 리소그래피의 변경을 사용하여 루트 표면 미세 구조의 생물 적 복제

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

생물 모방은 더 나은 인류를 위해 생물 학적 시스템, 특히 생물학적 구조를 모방하기 위해 화학 및 물질 과학을 사용하는 것입니다. 최근에는 잎 표면의 미세 구조를 모방한 생체 모방 표면이 잎 환경 상호 작용에 잎 미세 구조의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 뿌리에는 그러한 도구가 존재하지 않습니다. 우리는 뿌리 표면 미세 구조의 합성 모방을 인공 표면으로 허용하는 도구를 개발했습니다. 우리는 2 단계 프로세스를 사용하여 잎 표면 미세 구조 복제로 알려진 소프트 리소그래피 방법에 의존했습니다. 첫 번째 단계는 생물학적 조직을 수반하기 때문에 더 도전적인 단계입니다. 여기서, 우리는 뿌리 성형을 위해 UV에 의해 경화된 강하고 단단한 폴리우레탄에 의존하는 다른 폴리머 및 경화 전략을 사용했습니다. 이를 통해 뿌리 털과 같은 섬세하고 도전적인 특징을 포함하여 뿌리 표면 미세 구조의 신뢰할 수 있는 부정적인 이미지를 얻을 수 있었습니다. 그런 다음 이러한 부정적인 이미지를 템플릿으로 사용하여 잘 확립된 폴리디메틸 실록산(PDMS)과 세포의 가까운 모방을 나타내는 셀룰로오스 유도체, 에틸 셀룰로오스를 모두 사용하여 뿌리 표면 미세 구조 복제를 달성하고 미생물에 의해 분비된 셀룰라아제 효소에 의해 분해될 수도 있다. 이 새로 형성 된 플랫폼은 이전에 잎에 표시 된 것과 유사한 방식으로 뿌리 미생물 상호 작용에서 표면의 미세 구조 적 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 시스템은 표면 특징에 비해 미생물의 위치를 추적할 수 있으며, 향후 그 활동은 셀룰라아제 분비의 형태로 추적할 수 있습니다.

루트 표면 미세 구조 복제를 형성하려면 성형을 위해 루트를 선택해야 합니다. 우리는 토양에서 토마토 식물을 성장, 뿌리 시스템에서 자연 뿌리의 사용을 매우 도전만들기. 뿌리 시스템에서 토양을 제거하는 것은 어려울 수 있으며 또한 뿌리 시스템 뿌리가 깨지기 쉽고 성형 시도에 침입 할 수 있습니다. 따라서 먼저 실험실에서 프로토콜을 설정하려면 더 엄격한 뿌리를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 뿌리의 형성은 도 1A에설명되어 있다. 식물 뿌리 시스템은 식물이 3 주 동안 재배 된 후 제거되고 뿌리없는 식물은 줄기에서 출현 뿌리가 나올 때까지 약 1 주일 동안 물에 배치됩니다. 이러한 루트는 프로토콜 설립 중에 복제에 사용할 수 있습니다. 프로토콜이 잘 구축되면 보다 사실적인 루트 표면 구조가 필요합니다. 여기서 우리는 매우 어려운 토양의 전체 제거로 토양에서 성장 뿌리를 피하는 것이 좋습니다. 대신 우리는 유전자 특정 식물의 뿌리 표면 미세 구조에 귀중한 정보를 공급, 발아 뿌리의 사용을 제안한다. 이러한 뿌리의 성장은 도 1B에설명되어 있다. 씨앗은 젖은 필터 용지에 배치하고 25 °C에서 배양됩니다. 약 5일 후에 필터 용지가 촉촉하게 유지되는 동안 발아된 뿌리는 복제를 위해 충분히 깁니다. 그 뿌리는 이전에 제안된 뿌리보다는 더 연약하고 더 섬세한 배려를 요구합니다.
루트 표면 미세 구조 복제본의 생성은 2단계 프로세스입니다. 첫 번째 단계에서 천연 뿌리는 폴리우레탄 기반 금형(음수 복제본)으로 성형되고 있다. 이 단계의 장점은 폴리우레탄 금형에 대한 모든 재료가 준비되고 있으며, 루트는 UV에 10 분 노출을 위해 맨 끝에 준비 된 용액의 상단에 배치된다는 것입니다. 그 결과, 생물학적 조직은 너무 오랫동안 가혹한 조건에 노출되지 않으며 과정의 끝에 부드럽게 처리될 수 있다. 모든 프로토콜 단계를 수행하면 양호한 음수 복제본이 생성됩니다. 이 복제본은 루트 표면의 셀 구조와 루트 털의 위치를 나타내는 구멍을 보여준다(도 2A). 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계를 따르지 않으면 프로시저가 실패합니다. 이러한 단계 중 하나는 경화 전에 폴리우레탄 용액에 루트를 배치하는 것입니다. 폴리우레탄 용액에 뿌리가 침수를 피하기 위해 매우 부드럽게 배치해야합니다. 이러한 침수는 뿌리의 어느 부분이든 이를 제거할 능력이 없는 하드 폴리머에서 뿌리의 함정을 유발할 것이다. 이러한 이벤트가 발생하면 경화 후 루트가 음수 복제본 내에유지됩니다(그림 2B). 또 다른 중요한 단계는 UV 광에 의한 경화 시간에 관한 것입니다. 권장 경화 시간은 8\u201210 분입니다. 10 분 지나면 매우 단단한 폴리 우레탄 곰팡이가 발생하여 폴리 우레탄 금형 내에서 루트를 분리할 수 없습니다. 뿌리의 파손은 때때로 큰 조각이 깨진경우(그림 2C,상단, 보라색 화살표로 표시)를 육안으로 볼 수 있습니다. 그러나, 때로는 작은 뿌리 조각은 육안으로 발견하기 어려운 물질에 남아 현미경이 사용되어야한다(그림 2C,하단, 보라색 화살표로 표시). 프로토콜의 연속 전에 현미경으로 폴리우레탄 음성 복제본을 주의 깊게 검사하여 잔류 뿌리가 존재하지 않도록 하는 것이 좋습니다.
폴리우레탄 음의 복제본이 준비되면; 많은 재료는 양수 복제본의 준비에 사용될 수 있습니다. 폴리우레탄 음수 복제본을 금형으로 사용하여 양수 복제본을 준비하면 직선으로 진행되며 폴리우레탄 음수 복제본의 품질에 완전히 의존합니다. 양수 복제본을 생성하기 위해 우리는 PDMS를 모두 사용했는데, 이는 연석 소사학(도 3A)-에틸 셀룰로오스가 주로 셀룰로오스(그림3B)로구성된 뿌리 표면의 특성을 더 잘 모방하는 물질로 잘 알려져 있기 때문에.Figure 3A PDMS 복제본의 SEM 이미지는 루트 털을 매우 선명하게 보여줍니다. 머리카락은 신장 구역에 있으며, 거기서 머리카락이 나타나기 시작합니다. 따라서, 루트 모발의 길이는 천연뿌리(그림 3A)와마찬가지로 뿌리 표면을 따라 다양합니다. 에틸 셀룰로오스는 PDMS보다 더 단단하고 덜 유연한 필름을 생성합니다. 따라서, 음의 금형에서 제거하면 더 많은 주의가 필요합니다. 그러나, 일부 모발및 표면 미세구조는 광현미경(도 3B)하에서볼 수 있다. 그러나 이 두 재질을 사용하여 양수 복제본을 생성했지만 필름을 형성할 수 있는 모든 재료는 폴리우레탄 네거티브 복제본을 사용하여 양수 복제본에 적합한 후보가 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61437/61437fig01.jpg"> 그림 1: 복제를 위한 토마토 식물 뿌리. (A)토마토(M82) 식물은 25°C에서 9h의 빛과 15h의 어둠으로 재배됩니다. 3 주 후, 식물은 토양에서 제거되고 뿌리 시스템이 차단됩니다. 뿌리없는 식물은 약 일주일 후 줄기에서 출현 뿌리가 나올 때까지 물에 넣습니다. 이러한 뿌리는 루트 시스템의 루트로 정확한 구조를 표시하지 않지만 좋은 모델을 나타냅니다. 이러한 뿌리는 루트 시스템 뿌리보다 덜 취약하므로 실험실에서 기술을 수립할 때 작업하는 것이 좋습니다. (B)토마토(M82) 씨앗은 페트리 접시에 젖은 필터 용지에 넣고 25°C에서 배양한다. 종이는 매일 수분을 공급하고 씨앗은 발아하고 있습니다. 뿌리가 커지고 약 5 일 후에 복제에 사용할 만큼 충분히 길다. 이러한 뿌리는 더 부드럽고 방법이 잘 확립되면 사용해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61437/61437fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61437/61437fig2v2.jpg"> 그림 2: 폴리우레탄 음극복제의 현미경 이미지. (A)모든 단계에 따라 프로토콜에 따라 만들어진 폴리우레탄 음극복제의 SEM 이미지. 셀 구조가 선명하 게 보입니다. 노란색 화살표는 뿌리의 머리카락에 의해 형성 된 구멍을 가리킵니다. (B)용액으로 완전히 덮여 있었기 때문에 그 안에 뿌리를 가진 폴리우레탄 음성 복제본의 가벼운 현미경 이미지는 제거가 불가능하였다. 폴리우레탄 네거티브는 내부의 뿌리로 치료되었다. 뿌리는 눈으로 볼 수 있으며 가벼운 현미경 검사를 사용하입니다. 경화 된 복제본에서이 루트를 제거하는 것은 불가능합니다. (C)너무 오랫동안 자외선 아래에 보관된 폴리우레탄 음성 복제본의 광 현미경 이미지. 그 결과, 눈(상단 이미지, 보라색 화살표로 표시된) 또는 현미경으로만 보이는 작은 분획(보라색 화살표로 표시된 작은 분획)으로 폴리머에서 루트를 완전히 제거할 수 없습니다( 보라색 화살표로 표시된 낮은 이미지). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61437/61437fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61437/61437fig03.jpg"> 그림 3: 양수 복제본의 현미경 이미지. (A)PDMS로 만든 양성 복제본의 SEM 현미경. 확대는 루트 털을 보여줍니다. (B)에틸 셀룰로오스로 만든 양성 복제본의 가벼운 현미경 이미지. 머리카락은 오른쪽 이미지에 표시되며 표면 텍스처는 왼쪽의 이미지에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61437/61437fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

바이오미메틱스는 이전에 잎-미생물 상호 작용을 연구하는 도구로 사용되어 왔습니다. 그러나 뿌리에는 그러한 도구가 존재하지 않습니다. 여기서는 루트 환경 상호 작용 연구를 위한 뿌리 표면 미세 구조를 모방한 합성 표면을 형성하는 프로토콜을 개발합니다.

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

이 프로토콜을 사용하면 루트 표면 미세 구조를 모방한 합성 시스템을 개발할 수 있습니다. 이 시스템은 표면 구조에 중점을 둔 제어 방식으로 루트 환경 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 루트 환경 상호 작용을 연구하는 모든 실험실에서 수행 할 수있는 간단한 기술입니다.또한,이 기술은 다양한 재료에서 표면의 형성을 가능하게한다. 가장 어려운 단계는 음의 금형에서 천연 뿌리의 제거입니다. 이 단계는 뿌리 털을 찢어 방지 하기 위해 루트의 부드러운 처리 필요.시각적 데모는 이 절차를 복제하는 시청자의 능력을 향상시킵니다. 성장 3 주 후 토양에서 식물을 제거하여 시작합니다. 줄기와의 상호 작용 지점에서 식물의 뿌리 시스템을 잘라 물과 비커에 뿌리없는 식물을 넣어.며칠 후, 줄기에서 나오는 모험적인 뿌리를 자르고 복제에 사용합니다. 씨앗 발아 뿌리를 준비하기 위해 페트리 접시 안에 필터 용지를 물과 함께 적어 종이에 여러 개의 M82 씨앗을 넣습니다. 25도에서 요리를 배양하고 매일 종이에 수분을 공급합니다.약 5 일 후, 발아 뿌리는 복제에 사용할 만큼 충분히 길 것입니다. 9.49 그램의 이뇨제 희석제 를 50 밀리리터 컵에 추가하여 음의 복제 솔루션을 준비하십시오. 에틸 메타크릴레이트 1.45밀리리터를 컵에 넣고 실온에서 저장하여 용액이 균질화되고 투명해 보일 때까지 보관하십시오.가소제 3 밀리리터를 넣고 한 시간 동안 용액을 저어줍니다. 그런 다음 사진 시니터의 마이크로리터 300기를 추가하고 밤새 또는 모든 거품이 제거 될 때까지 저어줍니다. 루트의 음수 복제본을 생성하려면 깨끗한 유리 슬라이드를 사용하여 음수 복제 솔루션의 1 밀리리터를 부어 넣습니다.뿌리가 완전히 덮여 있지 않은지 확인하여 솔루션 위에 2~3개의 뿌리를 놓습니다. 8와트 자외선 램프 아래에 8-10분간 슬라이드를 유지한 다음 UV 램프를 끕다. 유리 슬라이드에서 복제본을 제거하고 에탄올로 채워진 페트리 접시에 넣어 반응하지 않은 단조량을 제거합니다.집게를 사용하여 복제본에서 루트를 천천히 부드럽게 제거합니다. 양수 복제본에 대한 PDMS 솔루션을 준비하려면 10 그램의 디메틸 실록산을 컵에 놓습니다. 경화제 1 그램을 넣고 완전히 섞습니다.혼합물을 진공 상태에서 2시간 동안 가열하여 기포를 제거합니다. 폴리우레탄 네거티브 복제본을 페트리 접시에 넣고 PDMS 혼합물을 음의 복제본 위에 붓습니다. 미세 구조의 적용 범위를 보장하고 하룻밤 실온에서 페트리 접시를 유지하기 위해 2 시간 동안 진공을 적용합니다.다음 날, 포셉을 사용하여 음의 복제본과 경화 된 양수 복제본을 분리합니다. 에틸 셀룰로오스의 양성 복제본을 준비하려면 에탄올 20 밀리리터를 100 밀리리터 컵에 넣습니다. 그런 다음 1.32 밀리리터의 가소제와 3.3 그램의 에틸 셀룰로오스를 추가합니다.실온에서 2시간 동안 용액을 저어줍니다. 다음 날, 페트리 접시에 네거티브 복제본 위에 에틸 셀룰로오스 용액을 붓고 하룻밤 동안 후드 아래에 접시를 둡니다. 그런 다음 포셉을 사용하면 음수 복제본에서 양수 복제본을 천천히 제거합니다.프로토콜을 올바르게 따르는 경우 양호한 음수 복제본을 생성할 수 있습니다. 이 복제본은 루트 표면의 셀 구조와 루트 털의 위치를 나타내는 구멍을 보여 준다. 폴리우레탄 용액에 뿌리가 침수되면 경질 폴리머에 갇혀 경화 후 음의 복제본 내에 유지됩니다.권장 경화 시간을 초과하는 UV 빛으로 경화하면 매우 단단한 폴리우레탄 금형이 발생하여 뿌리를 깨지 않고 제거할 수 없습니다. 때로는 뿌리 조각이 너무 작아서 현미경 검사를 볼 필요가 있습니다. 양수 복제본은 PDMS 및 에틸 셀룰로오스로 생성되었습니다.루트 털은 신장 구역에 있으며, 거기서 그들은 등장하기 시작합니다. 그들의 길이는 자연적인 뿌리와 유사하게 더 길어질수록 뿌리 표면을 따라 다릅니다. 에틸 셀룰로오스 복제본의 일부 머리카락은 가벼운 현미경으로도 볼 수 있습니다.음수 복제솔루션 위에 루트를 배치할 때는 오른쪽을 선택하고 솔루션 내부의 루트의 침수를 방지하는 것이 중요합니다. 이 기술은 뿌리 표면 환경 상호 작용을 연구하는 새로운 방법을 공급하기 위해 개발되었습니다. 구체적으로, 표면의 미세 구조 및 재료 특성에 의해 발생하는 물리적 힘.

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이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.

레이저 컷 스텐실을 사용한 간단한 리소그래피 없는 단일 셀 마이크로패터닝

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

이것은 목적, 운영, 그리​​고 소설 중력이 분석기의 결과를 보여주는 대표을 단계별로 안내합니다.

섬유 단백질을 늘이기 및 측정 소설 중력 포스 분석기의 사용을 보여주는

다목적 플라즈마 리소그래피 기술은 휴대폰 첨부 파일을 안내에 대한 안정된 표면 패턴을 생성하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 천연 조직을 모방하고 몇 가지, 서로 다른 세포 유형을 공부에 사용되었음을 포함 셀 네트워크를 만들어 적용할 수 있습니다.

세포 네트워크의 창조를위한 플라즈마 리소그래피 표면 Patterning

배우세요 뿌리 표면 미세 구조의 생물학적 복제 기술을 사용하여 식물-환경 상호작용을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 다양한 재료로 합성 표면을 만들어 뿌리 표면 구조의 물리적 힘을 분석할 수 있게 합니다.

소프트 리소그래피의 변경을 사용하여 루트 표면 미세 구조의 생물 적 복제

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