Name: 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포를 신경 세포로 분화시키는 행잉 드롭 방법을 사용하여 신경 발생 과정을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 조기 외배엽 발달 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NIH (1R35GM133496-01)에서 Z. Gao에 대한 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 단면에 도움을 준 라이언 홉스 박사에게 감사드립니다. 우리는 게놈 과학 및 생물 정보학, 고급 빛 현미경 검사영상, 유동 세포측정을 포함한 의학의 펜실베니아 주립 대학의 핵심 시설에 감사드립니다. 우리는 또한 RNA-seq 분석에 있는 도움을 주셔서 유카 이마무라 박사에게 감사드립니다.

1. mESC 문화
<ol><li>10cm 조직 배양 처리 플레이트를 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 젤라틴이 15-30분 이상 을 세울 수 있도록 한 후 이를 꺼낼 수 있습니다.</li>
	<li>종자 γ 조사 마우스 배아 섬유아데스 (MEFs) 하루 전에 미리 온난 한 mESC 배지에서 mESC를 배양하기 전에 (덜벡코의 수정 된 이글 매체 (DMEM) 15% 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산, β-메르카토에탄올, L-글루타민, 페니실린/연쇄절제술신, 피루바테 나트륨, LIF, PD0325901(PD), Chir99021(CH).</li>
	<li>γ 조사된 MEF가 E14 세포를 배양하기 전에 플레이트 표면에 정착하고 부착하도록 허용합니다.</li>
	<li>37°C 수조에서 E14 EsC를 해동하고 따뜻한 mESC 배지로 15cm 원문 튜브로 세포를 신속하게 이송합니다. 3 분 동안 200 x g에서 세포를 펠릿과 상체를 제거합니다.</li>
	<li>mESC 배지의 10mL에서 세포를 재연하고 이전에 시드된 γ 조사된 MEF를 포함하는 배양판에 세포를 플레이트한다. 5% CO2미만의 37°C 인큐베이터에서 세포 배양을 배양한다.</li>
	<li>배양 패용, 배지를 흡인시키고 멸균 1x PBS로 접시를 씻으세요. 플레이트 표면을 덮고 37°C에서 3분 동안 배양할 수 있는 충분한 0.05% 트립신을 추가합니다.</li>
	<li>단일 셀 서스펜션을 생성하기 위해 mESC 배지 및 파이펫으로 트립신을 중화시합니다. 세포를 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리하고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>혈류계 또는 세포 카운터로 세포를 계산하고 10cm 배양 판에서 약 5.0 x 105 세포를 시드한다.</li>
	<li>mESC 배지의 10mL에서 세포를 다시 중단하고, 앞서 설명한 바와 같이 젤라틴 코팅 조직 배양판상에 세포를 플레이트및 배양한다. 참고: mESC는 그들의 식민지에서 분화에서 세포를 방지하기 위하여 매 2 일마다 통과하는 것이 좋습니다. 중간 체의 페놀 레드는 전적으로 pH 표시기로서 작용하며 세포 밀도에 따라 2일 보다 빨리 황색(더 산성)을 돌릴 수 있다. 따라서 매일 매체를 변경해야 할 수도 있습니다. γ 조사된 MEF는 결국 몇 구절 후에 죽을 것입니다.</li>
</ol>2. EB, NPC 및 뉴런 분화
<ol><li>앞에서 언급한 배양 패세이징 프로토콜을 수행하고 셀을 계산합니다(단계 1.7-1.10).</li>
	<li>매달려 있는 드롭방법(0일차)<ol>
<li>10cm 세포 배양 판의 경우, 약 2.5 x 104 세포가 20 μL 분화 배지에서 중단될 수 있습니다 (15 % FBS, 비 필수 아미노산, β-메르카포에탄올, L 글루타민, 페니바틸린 / 스트렙토미신 및 나트륨 pyrue)에서 5.0 x 102 세포가 일시 중단됩니다. 세포를 포함하는 대략 50 20 μL 물방울은 1개의 10cm 판에 도금될 수 있습니다.</li>
		<li>적절한 수의 세포를 알리쿼트한 다음 세포를 200 x g에서 3분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다.</li>
		<li>20 μL당 5.0 x 102 세포의 세포 밀도에 대한 분화 배지의 적절한 부피에서 세포를 재축한다(예를 들어, 분화 배지의 1mL에서 2.5 x 104 세포).</li>
		<li>마이크로피펫 또는 리피터 파이펫을 사용하여 세포 현탁액의 20 μL 방울을 조직 배양판의 뚜껑에 놓습니다. 물방울이 서로 너무 가깝지 않아 병합되지 않도록 하십시오. 참고: 액적은 접시 자체가 아닌 뚜껑에 놓일 때 조직 배양 처리 부착 플레이트 또는 서스펜션 플레이트에 도금될 수 있습니다. 보다 실현 가능하고 멸균 접근법을 위해, 부착 조직 배양 판에 액적을 플레이트하고 아래에 설명된 바와 같이 서스펜션 플레이트로 옮기.</li>
		<li>접시를 1x PBS5-10mL로 채우고 뚜껑을 조심스럽게 접시에 다시 놓습니다. 37°C 인큐베이터에서 배양한다. 참고 : PBS는 물방울이 건조되는 것을 방지하기 위해 배양 판에 추가됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일째에는마이크로피펫을 사용하여 뚜껑에서 물방울을 수집하고 10mL의 분화 매체로 채워진 10cm 세포 배양 현탁판에 놓는다. 인큐베이터에서 저속으로 흔들리는 궤도 셰이커에 문화를 배양합니다.</li>
	<li>4일째에,EB를 수확하고, 세포를 수집하고, 원심분리기를 200 x g에서 3분 동안 수집하고, 상부물을 제거한다. 참고: 후속 실험의 요구 사항에 따라 1배 PBS로 세척할 수도 있습니다.</li>
	<li>절차를 계속하고 신경 전구 세포 (NPC)로 EB 분화를 유도하기 위해, 5 μM 망추산 (RA)으로 분화 배지를 준비한다.</li>
	<li>이전 배지를 100 x g에서 3분 동안 펠릿으로 제거하거나 기존 배지를 흡입하기 전에 EB가 정착하도록 허용합니다. 배양판에 5 μM RA를 함유한 분화 배지10mL를 첨가한다.</li>
	<li>6일째에는상기와 같이 플레이트를 기울이고 배지를 피펫으로 배팅하여 5 μM RA를 함유한 신선한 배지로 배지의 절반 이상을 교체한다. 참고: 배지의 절반 이상이 5일과 7일에 신선한 RA 함유 매체로 교체하는 것이 좋습니다. 페놀 레드 인디케이터에 유의하십시오. 황색으로 변하면 모든 매체를 대체하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>8일째에는세포를 수집하고, 3분 동안 200 x g에서 원심분리하고, 상퍼를 제거하여 NPC를 수확한다. 참고: NPC는 후속 실험의 요구에 따라 1x PBS로 세척할 수도 있습니다. 필요한 경우 NPC를 동결하고 나중에 문화 및 분석을 위해 다시 해동할 수 있습니다. NPC를 배양해야 하는 경우, accutase는 트립신의 대안으로사용될 수도 있습니다.</li>
	<li>절차를 계속하고 NPC를 뉴런으로 분화하려면 원심분리에 의해 15mL 원추형 튜브에서 NPC를 수집하고 트립신으로 해리하고 37 °C에서 3 7 °C에서 배양하십시오. 모든 NPC 응집체가 해리되고 트립신을 매체로 중화할 수 있도록 NPC파이펫을 피펫합니다.</li>
	<li>40 μm 나일론 세포 스트레이너로 세포를 필터링하고 N2 배지에서 1.5 x 105/cm2의 밀도로 도금하기 전에 세포를 계산합니다 (DMEM / F12 배지 + 3 mg / mL 포도당 + 3 mg / mL 지질이 풍부한 소 se rum 알부민 (LBSA) + 1:100 N2 보충 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL 펜/스트렙 + 1 mM L-글루타민) 후속 PCR 및 서부 블롯 실험을 위한 조직 배양 처리 플레이트에; 또는 면역 형광 실험을위한 조직 배양 챔버에.</li>
	<li>9일째에는기존 배지를 신선한 N2 매체로 교체하십시오.</li>
	<li>10일,N2/B27 배지(50% DMEM/F12 및 50% 신경 기저, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 보충제, 1:100 B27 보충제, 50 U/mL 펜/스트렙, 1mM L-글루타민)으로 N2/B27 배지를 전환하십시오.</li>
	<li>11-12일에는 다음과 같이 뉴런을 수확하십시오. 1x PBS로 세포를 세척하고 트립신을 추가하고 37°C 인큐베이터에서 배양한 후 3분 동안 배양한 후 중간 및 원심분리기로 트립신을 3분 동안 200 x g로 중화한다.</li>
</ol>3. mESC 및 분화 셀의 특성화
<ol><li>알칼리성 인산염 (AP) 분석 
	<ol>
<li>키트를 사용하여 알칼리성 인산염 활성을 평가합니다(재료 표참조).</li>
		<li>배양판에서 배지를 제거하고 1x PBS로 EsC를 세척합니다.</li>
		<li>플레이트에 키트와 함께 제공되는 수정 용액 1mL(포름알데히드와 메탄올로 구성되어 있음)을 추가하고 실온에서 2-5분 동안 배양합니다. 참고: 수정 솔루션의 오버 인큐베이션은 AP 활동을 손상시킬 수 있습니다.</li>
		<li>수정 용액을 제거하고 1x PBS로 EsC를 세척하고 접시에 PBS를 일부 남겨 둡니다. 참고: ESC를 PBS에 촉촉하게 유지하여 AP 활동을 손상시키지 않도록 하십시오.</li>
		<li>A, B 및 C 기판 용액을 1:1:1 비율로 혼합하여 AP 솔루션을 준비합니다. A와 B 용액을 먼저 혼합하고 C 용액을 추가하기 전에 실온에서 2 분 동안 혼합물을 배양합니다.</li>
		<li>1x PBS를 제거하고 이전에 준비된 AP 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>문화판을 알루미늄 호일로 감싸거나 어두운 방에서 3.5단계를 수행하여 어둠 속에서 약 15분 동안 EsC를 배양합니다.</li>
		<li>반응을 모니터링하고 용액이 밝게 변할 때 반응 용액을 제거하여 비특이적 얼룩을 피하십시오.</li>
		<li>1x PBS로 EsC를 두 번 세척합니다.</li>
		<li>1x PBS 또는 마운팅 매체로 ESC를 덮어 시료가 건조되는 것을 방지합니다. 참고: AP 식에 빨간색 또는 보라색 얼룩이 나타납니다. 플레이트는 4°C 냉장고에 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>EsC 및 EB 및 NPC에 대해 각각 1.6-1.7 및 2.4 단계를 수행하여 다양한 단계에서 세포를 수집합니다.</li>
		<li>RNA, DNA 및 단백질 추출 용액을 사용하여 RNA를 분리합니다(재료 표참조).</li>
		<li>역전사 키트로 cDNA를 생성하고(재료 표참조) 제조업체 의 설명서를 따릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>고정 및 포함 
	<ol>
<li>전술한 바와 같이 수확 한 EB및 NPC (단계 2.6) 실온에서 30 분 동안 1 x PBS에서 4 % 파라 포름알데히드 (PFA) 용액으로 수정하십시오.</li>
		<li>PFA를 제거하고 5 분 동안 1 x PBS로 샘플을 세척하십시오.</li>
		<li>샘플을 1x PBS, 10%-20%-및 30%-자당 용액의 직렬 희석에 배치하여 25\u201228°C에서 30분 동안 시료를 다음 솔루션으로 옮겨배배복시 30분 후에 다음 솔루션으로 옮겨놓는다. 참고: 샘플은 포함 단계를 계속하기 전에 4°C에서 30% 자당 용액에 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>피펫 팁을 자당 용액으로 적시고 샘플을 저온 몰드의 중앙에 놓고 과도한 액체를 피펫으로 넣습니다. 참고: 필터 용지를 사용하여 초과 용액을 제거할 수도 있습니다. 파이펫 팁을 자당 용액으로 적시면 EB와 NPC가 팁 벽에 달라붙지 않도록 하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>샘플을 다시 중단하지 않고 금형에 최적의 절삭 온도(OCT) 솔루션을 신중하게 추가하고 파이펫으로 과도한 거품을 제거합니다.</li>
		<li>샘플을 실험실 믹서에 낮은 속도로 배치하여 샘플을 15분 동안 약간 동요시킵니다. 이렇게 하면 10월 솔루션에서 다시 중단되는 경우 EB 및 NPC를 하단으로 해결하는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>금형을 액체 질소 또는 드라이 아이스에 배치하여 신속하게 시료를 동결합니다. 참고: 샘플은 다음 단계로 계속하기 전에 -70°C 냉동고에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>냉동 절제 
	<ol>
<li>냉동을 설정하여 샘플을 계측기로 옮기기 전에 -20에서 -18°C로 식힙니다.</li>
		<li>얼어 붙은 10월 블록을 금형에서 분리하고 홀더 표면에 약간의 OCT 용액을 배치하여 홀더에 고정하십시오.</li>
		<li>10월 블록을 정렬하여 EB와 NPC가 블레이드에 가장 가깝도록 조정하여 단면화 중에 샘플이 손실되지 않도록 합니다.</li>
		<li>조심스럽게 블록의 10 μm을 섹션과 샘플을 포함하는 조각에주의를 기울이는.</li>
		<li>샘플을 포함하는 OCT 슬라이스를 티슈 포함 유리 슬라이드에 빠르게 배치하고 10월 슬라이스가 실온에서 1시간 동안 공기 건조되도록 합니다. 참고: 샘플은 나중에 사용하기 위해 -70 °C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>면역형광 (IF) 
	<ol>
<li>블록 OCT 섹션 또는 배양 챔버에 뉴런을 포함 10% 정상 당나귀 혈청/0.1% Triton X-100 에 1 x PBS에 1 x PBS 에 1 시간 실온에서 시간.</li>
		<li>1차 항체의 샘플을 4°C에서 하룻밤 사이에 1x PBS에서 5% 정상 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100으로 배양한다.</li>
		<li>1x PBS/0.1% 트리톤 X-100 세 세 번 세척할 때마다 샘플을 세척합니다.</li>
		<li>이차 항체로 샘플을 5% 정상 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100에서 실온에서 1시간 동안 1배 PBS로 배양한다.</li>
		<li>1x PBS/0.1% 트리톤 X-100 세 번째로 세척할 때마다 5분 간 세척한 다음 1 μg/mL DAPI로 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>커버슬립과 일부 마운팅 매체로 샘플을 마운트하여 건조시로 만드십시오.</li>
		<li>형광 현미경의 밑에 견본을 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-세크 분석 
	<ol>
<li>다양한 단계에서 세포를 수집하고 RNA 추출을 수행합니다(3.2단계 참조).</li>
		<li>cDNA 라이브러리를 준비하고, Wang외.8에기재된 프로토콜에 따라 깊은 시퀀싱 및 데이터 분석을 수행한다.</li>
		<li>R 패키지, 클러스터 프로파일러를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 분석을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유동 세포측정 
	<ol>
<li>단계 1.6-1.7을 수행하여 EsC를 수집하고 매체에서 세포를 다시 중단합니다. 2.4단계를 따라 EB 및 NPC를 수집하고 배지에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>40 μm 나일론 세포 여과기를 사용하여 새로운 15 mL 원문 튜브로 셀 서스펜션을 필터링합니다.</li>
		<li>유동 세포계(기관의 핵심 시설에서 수행)를 사용하여 샘플의 GFP 신호를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화 방법은 수십 년 동안 확립되어 왔으며 연구자들은 이전 프로토콜을 수정하거나 다양한 목적을 위해 새로운 프로토콜을 계속 생성하고있다7,10,11. 우리는 마우스 또는 인간 ESC의 다른 혈통 분화의 분석에 사용될 수 있는 신경에 mESC의 분화 단계의 효율성 그리고 진행을 종합적으로 분석하기 위하여 일련의 분석을 이용했습니다. 더욱이, 우리의 접근은 시험관8에서신경 분화에 특정 유전자 또는 통로의 충격을 평가하기 위하여 유용한 공구로 입증되었습니다.
우리의 방법을 통해, 망막산 (RA)로 처리 된 다능한 언커밋 ESC는 고효율신경 혈통에 커밋하고 뉴런7을생성하도록 유도된다. ES 세포의 성공적인 ...

개발 중인 마우스 발아세포1,2,마우스 배아 줄기세포(mESC)의 내세포 질량으로부터의 첫 번째 파생이후 줄기세포자가재생 및분화3을연구하는 강력한 도구로 사용되고 있다. 더욱이, mESC 분화를 연구하면 신경퇴행성 질환4와같은 질환 치료에 줄기세포 기반 치료의 효율성과 안전성을 향상시킬 수 있는 분자 메커니즘에 대한 엄청난 이해를 이끌어 낸다. 동물 모델에 비해, 이 체외 시스템은 실용성 및 평가의 단순성, 동물과 대조적으로 세포주를 유지하는 데 드는 저렴한 비용, 유전자 조작의 상대적 용이성을 포함하여 많은 이점을 제공합니다. 그러나, 분화된 세포 유형의 효율 및 품질은 종종 다른 선인 mESC뿐만 아니라 분화 방법5,6에의해 영향을 받는다. 또한, 분화 효율을 평가하는 전통적인 분석은 견고성이 결여되어 유전자 발현의 글로벌 변화를 파악하지 못하는 선택된 마커 유전자의 질적 검사에 의존한다.
여기서 우리는 신경 분화의 체계적인 평가를 위해 애사의 배터리를 사용하는 것을 목표로합니다. 선택된 마커와 RNA-seq에 대한 기존의 체외 분석을 모두 사용하여 이 공정 중 전사적 변화뿐만 아니라 분화 효율을 측정하는 플랫폼을 구축합니다. 이전에 확립된 프로토콜7에기초하여, 우리는 매달려 있는 낙하 기술을 통해 배아 체(EBs)를 생성하고, 신경 전구세포(NPC)를 생성하기 위해 망막산(RA)의 초생리적 양을 이용한 유도를 거쳐 신경 유도 배지를 가진 뉴런으로 분화하였다. 분화의 효율을 검사하기 위해 기존의 RT-qPCR 및 면역 형광 (IF) 분석 외에도 RNA-seq 및 유동 세포 측정을 수행했습니다. 이러한 분석은 단계별 분화의 진행을 종합적으로 측정합니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신 + 0.53mM EDTA 1X</td><td>Corning</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% 젤라틴</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>탈이온수에서 준비</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>1X PBS</td></tr><tr><td>40-&mu에 희석; m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>항체를 1:500으로 희석하여 IF</td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 고감도 DNA 키트</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>C298-500</td><td>Fisher 화학</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EB 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>111000200</td><td>Pharmco</td><td>탈이온수에 희석</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>애틀랜타 Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 염기서열분석 시스템</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR 분석</td><td>탈이온수</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>해당 없음</td><td></td><td>MEF 상등액</td></tr><tr><td>m18srRNA 프라이머</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM</td></tr> <tr><td>비필수 아미노산</td><td>Corning</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog 프라이머</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTGG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3'</td></tr><tr><td>mNes 프라이머</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6</td></tr> <tr><td>프라이머</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2</td></tr> <tr><td>보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Nestin 일차 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td> 항체를 IF Neural basal Thermo Fisher Scientific<td>에 대해 1:200에 희석하였다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>뉴로필라멘트 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq 라이브러리 준비 키트</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>코닝</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>탈 이온수에서 준비</td></tr> <tr><td>- 염화칼</td>륨 <td>P217-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr> <tr><td>- 인산칼륨 일염기성 무수</td><td>0781-500G</td><td>VWR</td><td></td></tr> <tr><td>- 염화나트륨</td><td>BP358-10</td><td>피셔 생물 시약</td><td></td></tr> <tr><td>- 인산나트륨, 이염기성, 헵타하이드레이트</td><td>SX0715-1</td><td>Milipore</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 헥사머 프라이머</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>레티노산</td><td>Sigma</td><td>R2625</td>, <td>DMSO</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Corning</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>Sigma</td><td>84097</td>, <td>1X PBS에 희석,</td></tr><tr><td>SuperScript III, 역전사 효소</td>, <td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 화합물</td>, <td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>TriPure 분리 시약</td><td>시그마-알드리치</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

우리는 마우스 배아 줄기 세포를 뉴런 혈통으로 배양하고 분화하기 위한 단계별 절차를 설명하고, 분화된 세포를 특징짓는 일련의 에세이를 따릅니다. 상기 E14 마우스 배아 줄기세포는 매달려 있는 낙하 방법을 통해 배아체를 형성하기 위해 사용되었고, 그 후 망막산에 의해 신경 전구 세포로 분화하도록 유도하고, 마지막으로 뉴런으로 분화하였다. 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR) 및 면역형광 실험은 신경 전조자와 뉴런이 각각 8일째와 12일째에 대응하는 마커(신경 전조자 및 뉴런용 신경필라멘트용 네신틴)를 나타낸다는 것을 밝혔다. Sox1 프로모터 중심의 GFP 리포터를 발현하는 E14 라인에 대한 유동 세포 측정 실험은 8일째에 세포의 약 60%가 GFP 양성인 것으로 나타났으며, 이는 이 단계에서 신경 전구 세포의 성공적인 분화를 나타낸다. 마지막으로, RNA-seq 분석은 글로벌 전사적 변화를 프로파일로 사용되었다. 이러한 방법은 신경 분화 시 세포 정체성 전이를 조절하는 특정 유전자 및 경로의 개입을 분석하는 데 유용합니다.

우리의 방법의 표현으로, 우리는 E14 세포에 EB, NPC 및 신경 분화 실험을 수행했습니다. E14 세포는 γ 조사된 MEF 인구가 희석될 때까지 γ 조사된 MEF(도1A)에서배양되었다. 우리는 나노그 및 Oct4 마커에 대한 알칼리 인파타아제 (AP) 염색(도 1B)및 이후 RT-qPCR (아래 참조)을 수행하여 E14 세포의 자통을 확인했다. γ 조사된 MEF-없는 E14 세포는 도 2A에설명된 프로토콜을 사용하여 분화를 위해 유도되었다. 간단히, 500세포를 포함하는 20 μL의 분화 매체 액적물배양판의 뚜껑에 씨를 뿌려 하였다(자세한 내용은 프로토콜 섹션 2 참조). 그런 다음 형성된 EB를 수집하여 신선한 분화 매체에 서스펜션에 배치했습니다. 4일부터 8일까지, 5μM RA를 배양판에 첨가하여 NPC를 유도하였다.<strong...

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

마우스 배아 줄기 세포를 뉴런 세포로 분화시키는 프로토콜 외에도 분화 과정을 종합적으로 분석할 수 있는 일련의 실험을 보여줍니다. 이러한 기술은 초기 외배엽 배아 발달과 관련이 있으며, 연구자들에게 뉴런 세포 분화를 분석할 수 있는 옵션을 제공합니다. 이 절차를 시도할 때는 최적의 상태의 줄기세포부터 시작하는 것이 필수적입니다.따라서 EB, MPC 및 뉴런이 신선하고 최적의 배지에서 배양되는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 시각적 시연은 성공과 효과, 특히 차별화 부분에 영향을 줄 수 있는 미세한 세부 정보를 포함하고 있기 때문에 중요합니다. 행잉 드롭 세포 배양(hanging drop cell culture)을 설정하는 것으로 시작합니다.10cm 세포 배양 플레이트의 경우 분화 배지 20마이크로리터당 500개 세포로 농도를 조정합니다. 20마이크로리터 액적 50개를 저장할 수 있는 충분한 세포 현탁액을 준비합니다. 마이크로 피펫 또는 리피터 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 세포 현탁액 방울을 조직 배양 플레이트의 뚜껑에 놓고 방울이 너무 가까이 있지 않도록 하여 합쳐지는 것을 방지합니다.접시에 5-10ml의 PBS를 채우고 조심스럽게 접시 뚜껑을 다시 끼웁니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 배양을 배양합니다. 이틀 후, 뚜껑에서 물방울을 채취하여 10ml의 분화 배지로 채워진 10cm 세포 배양 현탁액 플레이트에 넣은 다음 인큐베이터에서 저속으로 설정된 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.또 다른 2 일 후에, 3 분 동안 200 시간 G에 세포를 원심 분리하고, 상층액을 제거하십시오. 신경전구세포로의 배아체 분화를 유도하려면 5마이크로몰 레티노산으로 분화 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 플레이트를 이틀 동안 배양한 다음 플레이트를 기울이고 피펫팅하여 배지의 최소 절반을 새 배지로 교체합니다.2일 후 200배 G에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 세포를 수집합니다. 배아체와 신경전구세포를 PBS에 4%PFA로 실온에서 30분 동안 고정합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고 PBS에서 5분 동안 세포를 세척합니다.섭씨 25-28도에서 PBS 10, 20 및 30% 자당 용액에서 세포를 연속적으로 배양하고, 세포가 튜브 바닥에 정착할 때까지 30분 이상 배양합니다. 그리고 이를 사용하여 샘플을 Cryomold의 중앙으로 옮기고 여분의 액체를 피펫팅합니다. 샘플을 다시 매달지 않고 최적의 절단 온도 또는 OCT 용액을 금형에 조심스럽게 추가한 다음 피펫으로 과도한 기포를 제거합니다.샘플과 함께 주형을 실험실 믹서에 저속으로 15분 동안 올려 놓으면 배아체와 신경 전구 세포가 OCT 용액의 바닥에 가라앉습니다. 그런 다음 곰팡이를 액체 질소에 넣어 샘플을 빠르게 동결합니다. 정상 당나귀 혈청 10%와 PBS 내 트리톤 X-100 0.1%의 뉴런을 포함하는 OCT 절편 또는 배양실을 실온에서 1시간 동안 차단합니다.그런 다음 5%의 일반 당나귀 혈청과 PBS의 0.05%Triton X-100에 희석된 1차 항체에서 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날에는 0.1% Triton X-100을 사용하여 PBS에서 샘플을 세척할 때마다 5분씩 3회 세척합니다. 5%normal 당나귀 혈청과 PBS에 0.05%Triton X-100에 희석된 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.Triton X-100 및 PBS에서 세척을 반복한 다음 밀리리터당 1마이크로그램의 DAPI에서 샘플을 배양합니다. 커버 슬립과 일부 장착 매체로 샘플을 장착하고 건조시킨 다음 형광 현미경으로 이미지화합니다. 뉴런 분화를 수행하기 위해 E14 세포는 섬유아세포 집단이 희석될 때까지 감마선이 조사된 마우스 배아 섬유아세포에서 배양되었습니다.E14 세포의 다능성은 알칼리성 인산가수분해효소 염색으로 확인되었습니다. 분화 후, 배아체는 지속적으로 크기가 증가하는 둥근 모양을 가졌습니다. 10일째가 되면, 신경세포가 뉴런으로 분화하면서 길쭉한 세포 모양을 갖게 되었습니다.면역형광 실험은 8일째에 신경전구세포에 대해, 12일째에 뉴런에 대해 수행되었습니다. 신경전구세포(neuro progenitor cell)에 둥지를 틀고, 뉴런(neuron)에 있는 신경필라멘트(neurofilament)에 대해 양성 염색(positive staining)이 관찰되었습니다. Sox1 promoter-driven GFP reporter를 발현하는 마우스 배아 줄기세포주를 분화하고, 배아 줄기세포 및 신경전구세포에 대해 유세포 분석을 수행하였다.NPC 단계에서 전체 세포의 58.7%가 GFP 양성인 반면 0%는 ESC 단계에서 GFP 양성인 것으로 나타났습니다. RNA 염기서열 실험은 E14 배아 줄기 세포, 배아체 및 신경 전구 세포에 대해 수행되었습니다. RNA 염기서열 히트 맵의 유전자는 발현 수준에 따라 분류되었습니다.4개의 유전자 클러스터에 대한 유전자 온톨로지 분석은 이들이 별개의 세포 기능 또는 경로에 해당한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 EBS는 구형의 검게 변한 세포 덩어리로 나타나야 합니다. EBS가 이와 함께 성장하도록 하려면 매체가 노랗게 변하기 시작하면 첫날에 매체를 변경하십시오.EB와 MPC 모두 초기 배아 발달의 중요한 단계에 있기 때문에 MPC 배양에도 동일한 접근 방식이 중요합니다. ChIPseek 및 염색질 확인 캡처 분석과 같은 다른 기능적 게놈 분석은 뉴런 분화의 여러 단계에서 수행될 수 있으며, 이를 통해 기저의 생물학적 과정을 이해할 수 있습니다. 뉴런 분화 과정에서 화학적 및 기능적 유전체학 분석을 통해 연구자들은 초기 배아 발달의 분자 메커니즘을 더 잘 설명할 수 있습니다.

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

이 비디오는 인간 배아 줄기 세포(hESCs)가 영양 세포나 중간 단계를 사용하지 않고 신경 전구 세포로 직접 분화되는 과정을 보여줍니다. 뼈 형태 유전 단백질(BMP)의 선택적 억제와 성장 인자-베타 또는 TGF-β 신호 전달 경로의 변형은 hESC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시킵니다.

인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

이 비디오는 신경 전구 세포를 뉴런으로 분화시키는 세포 배양 방법을 선보였습니다. 성장 인자로 보충된 영양이 풍부한 배지에서 세포를 배양함으로써, 전구 세포는 발달된 축삭돌기와 수상돌기를 가진 뉴런으로 성숙했습니다. 안정화제는 세포 생존력을 보장하고 분화 과정 전반에 걸쳐 산화적 손상으로부터 보호했습니다.

신경전구세포(Neural Progenitor Cells)를 뉴런(Neuron)으로 분화(Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neuron)

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

배우세요 마우스 배아 줄기 세포를 신경 세포로 분화시키는 행잉 드롭 방법을 사용하여 신경 발생 과정을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 조기 외배엽 발달 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구를 제공합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

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