마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

마우스 배아 줄기 세포를 뉴런 세포로 분화시키는 프로토콜 외에도 분화 과정을 종합적으로 분석할 수 있는 일련의 실험을 보여줍니다. 이러한 기술은 초기 외배엽 배아 발달과 관련이 있으며, 연구자들에게 뉴런 세포 분화를 분석할 수 있는 옵션을 제공합니다. 이 절차를 시도할 때는 최적의 상태의 줄기세포부터 시작하는 것이 필수적입니다.

따라서 EB, MPC 및 뉴런이 신선하고 최적의 배지에서 배양되는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 시각적 시연은 성공과 효과, 특히 차별화 부분에 영향을 줄 수 있는 미세한 세부 정보를 포함하고 있기 때문에 중요합니다. 행잉 드롭 세포 배양(hanging drop cell culture)을 설정하는 것으로 시작합니다.

10cm 세포 배양 플레이트의 경우 분화 배지 20마이크로리터당 500개 세포로 농도를 조정합니다. 20마이크로리터 액적 50개를 저장할 수 있는 충분한 세포 현탁액을 준비합니다. 마이크로 피펫 또는 리피터 피펫을 사용하여 20마이크로리터의 세포 현탁액 방울을 조직 배양 플레이트의 뚜껑에 놓고 방울이 너무 가까이 있지 않도록 하여 합쳐지는 것을 방지합니다.

접시에 5-10ml의 PBS를 채우고 조심스럽게 접시 뚜껑을 다시 끼웁니다. 섭씨 37도의 인큐베이터에서 배양을 배양합니다. 이틀 후, 뚜껑에서 물방울을 채취하여 10ml의 분화 배지로 채워진 10cm 세포 배양 현탁액 플레이트에 넣은 다음 인큐베이터에서 저속으로 설정된 궤도 셰이커에 플레이트를 놓습니다.

또 다른 2 일 후에, 3 분 동안 200 시간 G에 세포를 원심 분리하고, 상층액을 제거하십시오. 신경전구세포로의 배아체 분화를 유도하려면 5마이크로몰 레티노산으로 분화 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 플레이트를 이틀 동안 배양한 다음 플레이트를 기울이고 피펫팅하여 배지의 최소 절반을 새 배지로 교체합니다.

2일 후 200배 G에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 세포를 수집합니다. 배아체와 신경전구세포를 PBS에 4%PFA로 실온에서 30분 동안 고정합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고 PBS에서 5분 동안 세포를 세척합니다.

섭씨 25-28도에서 PBS 10, 20 및 30% 자당 용액에서 세포를 연속적으로 배양하고, 세포가 튜브 바닥에 정착할 때까지 30분 이상 배양합니다. 그리고 이를 사용하여 샘플을 Cryomold의 중앙으로 옮기고 여분의 액체를 피펫팅합니다. 샘플을 다시 매달지 않고 최적의 절단 온도 또는 OCT 용액을 금형에 조심스럽게 추가한 다음 피펫으로 과도한 기포를 제거합니다.

샘플과 함께 주형을 실험실 믹서에 저속으로 15분 동안 올려 놓으면 배아체와 신경 전구 세포가 OCT 용액의 바닥에 가라앉습니다. 그런 다음 곰팡이를 액체 질소에 넣어 샘플을 빠르게 동결합니다. 정상 당나귀 혈청 10%와 PBS 내 트리톤 X-100 0.1%의 뉴런을 포함하는 OCT 절편 또는 배양실을 실온에서 1시간 동안 차단합니다.

그런 다음 5%의 일반 당나귀 혈청과 PBS의 0.05%Triton X-100에 희석된 1차 항체에서 샘플을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날에는 0.1% Triton X-100을 사용하여 PBS에서 샘플을 세척할 때마다 5분씩 3회 세척합니다. 5%normal 당나귀 혈청과 PBS에 0.05%Triton X-100에 희석된 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

Triton X-100 및 PBS에서 세척을 반복한 다음 밀리리터당 1마이크로그램의 DAPI에서 샘플을 배양합니다. 커버 슬립과 일부 장착 매체로 샘플을 장착하고 건조시킨 다음 형광 현미경으로 이미지화합니다. 뉴런 분화를 수행하기 위해 E14 세포는 섬유아세포 집단이 희석될 때까지 감마선이 조사된 마우스 배아 섬유아세포에서 배양되었습니다.

E14 세포의 다능성은 알칼리성 인산가수분해효소 염색으로 확인되었습니다. 분화 후, 배아체는 지속적으로 크기가 증가하는 둥근 모양을 가졌습니다. 10일째가 되면, 신경세포가 뉴런으로 분화하면서 길쭉한 세포 모양을 갖게 되었습니다.

면역형광 실험은 8일째에 신경전구세포에 대해, 12일째에 뉴런에 대해 수행되었습니다. 신경전구세포(neuro progenitor cell)에 둥지를 틀고, 뉴런(neuron)에 있는 신경필라멘트(neurofilament)에 대해 양성 염색(positive staining)이 관찰되었습니다. Sox1 promoter-driven GFP reporter를 발현하는 마우스 배아 줄기세포주를 분화하고, 배아 줄기세포 및 신경전구세포에 대해 유세포 분석을 수행하였다.

NPC 단계에서 전체 세포의 58.7%가 GFP 양성인 반면 0%는 ESC 단계에서 GFP 양성인 것으로 나타났습니다. RNA 염기서열 실험은 E14 배아 줄기 세포, 배아체 및 신경 전구 세포에 대해 수행되었습니다. RNA 염기서열 히트 맵의 유전자는 발현 수준에 따라 분류되었습니다.

4개의 유전자 클러스터에 대한 유전자 온톨로지 분석은 이들이 별개의 세포 기능 또는 경로에 해당한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 EBS는 구형의 검게 변한 세포 덩어리로 나타나야 합니다. EBS가 이와 함께 성장하도록 하려면 매체가 노랗게 변하기 시작하면 첫날에 매체를 변경하십시오.

EB와 MPC 모두 초기 배아 발달의 중요한 단계에 있기 때문에 MPC 배양에도 동일한 접근 방식이 중요합니다. ChIPseek 및 염색질 확인 캡처 분석과 같은 다른 기능적 게놈 분석은 뉴런 분화의 여러 단계에서 수행될 수 있으며, 이를 통해 기저의 생물학적 과정을 이해할 수 있습니다. 뉴런 분화 과정에서 화학적 및 기능적 유전체학 분석을 통해 연구자들은 초기 배아 발달의 분자 메커니즘을 더 잘 설명할 수 있습니다.