척수 손상 다음 마우스에 있는 오줌 방광의 분자 분석을 위한 단 하나 세포 해리 접근

이 프로토콜은 생물학적 정보를 사용하여 높은 세포 생존율을 가진 단일 세포 현탁액의 생성을 촉진하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 세포 생존율과 분리된 세포 유형의 적절한 표현을 유지하는 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있다는 것입니다. 수술 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 후세인 아타(Hussein Atta)가 맡을 것입니다.

조직 해리 절차를 시연하는 사람은 Ali Hashemi와 FACS 분석인 Yaser Heshmati가 맡을 것입니다. 마취된 성인 마우스에서 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후, 흉추에서 가장 두드러진 가시 돌기를 촉진합니다. 진통제와 항생제는 수술 전에 투여됩니다.

마우스 뒷면의 목 아래쪽에서 가장 눈에 띄는 가시돌기 바로 아래까지 세로로 직사각형을 깎고 정중선의 양쪽에서 1cm를 깎습니다. 노출된 피부를 절개 부위부터 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 10% 포비돈 요오드와 70% 에탄올 물티슈로 세 번 소독합니다. 마지막으로 닦은 후 수술 부위에 창문이 있는 멸균 4x4인치 거즈 스펀지로 마우스를 덮습니다.

척수 손상을 유도하려면 먼저 등 중앙을 1.5cm 절개하고 날카로운 둔기 절개를 사용하여 척추돌기와 T9, T10 및 T11 척추의 얇은 판에서 근육을 분리합니다. T10 척추돌기의 양측 후판 절제술을 시행하기 전에 가는 가위를 사용하여 T9와 T10, T10과 T11 사이의 척추간 인대를 날카롭게 나눕니다. 얇은 판이 완전히 절제되면 가위를 사용하여 척수를 절제합니다.

측면 기둥을 완전히 자르려면 양쪽에 있는 가는 가위 끝을 섬세하게 쓸어줍니다. 멸균 면 팁을 사용하여 출혈을 압축하십시오. 항상성을 달성한 후 7-0 폴리글락틴910 연속 봉합사로 피부를 닫고 수술 후 탈수를 방지하기 위해 1ml의 식염수를 피하로 투여한 다음 동물을 새 케이지로 되돌려 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 동물을 새 케이지로 되돌립니다.

12시간마다 한 손으로는 동물을 잡고 다른 한 손으로는 하복부를 마사지하면서 검지와 엄지손가락을 사용하여 팽창된 방광을 찾아 부드럽게 압박하여 동물이 스스로 소변을 볼 수 있을 때까지 수동 방광 표현을 자극합니다. 관심 방광 세포 유형의 다운스트림 분석을 위해 적절한 실험 시점에 동물이 적절하게 마취된 후 골반에서 횡격막까지 정중선 개복술을 수행하고 횡격막을 갈비뼈에서 잘라냅니다. 흉골과 평행한 뼈 연골 경계를 따라 횡격막에서 시작하여 첫 번째 갈비뼈까지 동물의 양쪽에 있는 갈비뼈를 따라 흉부를 엽니다.

흉곽 앞쪽을 동물의 머리 위에 고정한 후, 가는 가위를 사용하여 심낭을 잘라내고 23게이지 바늘을 관류 장치에 연결합니다. 바늘을 좌심실에 삽입하고 조직에 구멍을 뚫지 않고 바늘을 대동맥으로 천천히 전진시킵니다. 바늘이 제자리에 놓이면 분당 15ml의 유속으로 조직에 PBS를 주입하기 시작하고 가는 가위의 끝을 사용하여 오른쪽 심방을 빠르게 작게 자릅니다.

배액이 맑고 옅어진 간 색이 관찰되면 관류를 중지하고 혈관 척추와 요도에서 방광을 분리한 다음 얼음처럼 차가운 Tyrode의 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 방광을 넣습니다. 단일 세포 현탁액을 준비하려면 모든 방광을 채취한 후 100마이크로리터의 Tyrode 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 찢습니다. 무게를 잰 후 100마이크로리터의 Tyrode 용액이 들어 있는 10cm 페트리 접시에 담긴 방광을 다진 다음 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 조직 조각을 방광당 2.5ml의 소화 완충액으로 옮깁니다.

Nutator 믹서에서 섭씨 37도에서 40분 동안 조직을 배양하고 5ml 피펫을 사용하여 1분 동안 샘플을 분쇄한 후 원심분리로 해리된 세포와 조직을 수집합니다. 펠릿을 1ml의 세포 분리 용액에 재현탁시키고 세포를 Nutator 믹서에 추가로 10분 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 다른 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다.

1분 후, 9 밀리리터의 PBS를 첨가하여 용해를 중지하고 70 마이크로미터 스트레이너를 통해 세포를 50 밀리리터 튜브로 여과한 다음 세포를 다시 원심분리하고 FC 블록이 보충된 200 마이크로리터의 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 얼음에서 10분 동안 배양한 후 원심분리로 세포를 수집하고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 적절한 양의 형광단 접합 항체 마스터 믹스에 펠릿을 20분 동안 재현탁합니다. 배양이 끝나면 1ml의 세포 염색 완충액으로 세포를 세척하고 5마이크로리터의 FITC Annexin V와 1마이크로리터의 프로피듐 요오드화물이 보충된 100마이크로리터의 신선한 세포 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

실온에서 15분 후 400마이크로리터의 Annexin 결합 완충액을 세포에 첨가하고 반전으로 혼합합니다. 유세포 분석으로 세포를 분석하려면 먼저 염색되지 않은 세포 샘플을 사용하여 세포의 측면 및 전방 산란 매개변수를 설정한 다음 530나노미터 및 575나노미터 이상에서 형광 방출을 측정하여 죽은 세포를 배제합니다. 각 점 블롯의 그리드를 사용하여 첫 번째 감소에서 음의 모집단을 정의하고 형광 마이너스 1 컨트롤을 사용하여 음수 및 양수 모집단 매질이 정렬될 때까지 스펙트럼 중복을 수정합니다.

그런 다음 관심 있는 특정 마커를 가진 세포의 이벤트 100, 000개를 측정하여 필요에 따라 관심 세포 집단에 대한 게이트를 만듭니다. 모든 샘플이 실행되면 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 콜라겐 1A1, 콜라겐 3A1, 콜라겐 1A2, 콜라겐 6A1은 쥐의 방광에서 발견되는 가장 풍부한 콜라겐 유형입니다.

콜라겐 1, 3, 6 및 히알루론의 mRNA 발현 수준을 결정하기 위한 분석은 이러한 세포외 기질 구성 요소의 발현이 요로상피보다 중간엽 세포 집단에서 더 널리 퍼져 있음을 보여줍니다. 유세포 분석은 여러 서로 다른 효소 분해 프로토콜이 생존력이 높은 세포 집단을 생성하며, 이 분석에 사용된 세 번째 분해 프로토콜이 세포 보존에 가장 효과적인 것으로 결정됨을 나타냅니다. 이 방법을 사용하면 척수 손상 마우스의 방광에서 분리된 총 세포 수를 크게 증가시켜 방광을 대조군과 비교할 수 있습니다.

대조군과 비교했을 때, 척수 손상 동물의 방광도 CD45 양성 세포가 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 7.1단계는 심장 집단을 식별하는 데 중요합니다. 게이팅 전략은 관심 있는 셀에 의해 알려져야 합니다.

SCI 동물의 방광은 뚜렷한 세포 개체군을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 세포 분류, 일차 세포 배양, 단일 세포 염기서열분석 및 생존 가능한 단일 세포가 필요한 기타 분자 및 세포 다운스트림 절차에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 생존율을 제공하므로 세포 집단 손실이 적으며, 이는 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 단일 세포 분석 기술의 핵심 포인트입니다.