Name: 척수 손상 다음 마우스에 있는 오줌 방광의 분자 분석을 위한 단 하나 세포 해리 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 학습하세요 척수 손상 마우스 방광의 단일 세포 해리 방법을 통해 세포 생존율이 높은 현탁액을 생성하는 기술입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 시퀀싱에 활용됩니다.

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이 작품은 국립 보건원 (R01 DK077195에서 R.M.A, R01 DK104641에서 R.M.A 및 D.R.B)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 혈액학/ 종양학, 보스턴 아동 병원, 소아과 부, 하버드 의과 대학 및 다나 파버 암 연구소의 스튜어트 오킨 박사로부터 귀중한 의견을 인정합니다. 우리는 또한 마우스의 수술 후 치료에 카일 코스타에서 지원을 인정, 메리 타글리엔티와 박사 하비발라 Shojaeisadi (박사 양시 연구소, 소아과의 학과, 신생아 의과, 소아과의 학과, 신생아 의과, 보스턴 어린이 병원, 하버드 의과 대학) 기술 지원 및 도움이 토론을 위해.

<ol><li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Urology%22%5BJournal%5D)">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24(2013).</li>
<li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+miRNA-regulated+networks%2C+hubs+of+signaling%2C+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li>
<li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I%3A+architecture%2C+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II%3A+regenerative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li>
<li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

여기에 설명된 마우스 척수 손상 모델은 방광 수축과 외부 요도 괄약근 이완 사이의 협착로 인한 기능성 방광 출구 장애물을 만드는 재현 가능한 방법을 제공한다. 이것은 차례로 비뇨기과 매끄러운 근육 구획의 확장에 의해 특징지어진 상해 후에 2 주 초에 방광 벽의 심오한 리모델링을 연상시킵니다. 설치류에서 SCI 모델의 구현에 중요한 단계는 (i) 부상 후 10\u201214 일 동안 계속되는 척추 충격의 기간 동안 수동 방광 발현에 엄격한 주의를 포함한다; (ii) 체중 감량을 최소화하기 위한 영양 농축; 및 (iii) 소변 비열의 반환을 넘어 확장 실험에 대한 특히 소변 확장에 대한 잠재력의 완화. 모델의 한계는 일시적인 혈뇨 기간 동안 혈전에서 마우스에 요도 폐색에 대한 잠재력을 포함, 그리고 추가로 수술 후 역행 사정 다음 정액 응고에서 남성 마우스에서.
여기에 설명된 조직 해리 접근법은 실험적 모욕에서 발생하는 조직의 구조적 변화를 고려하는 것의 중요성을 보여 주며, 이 경우 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 SCI에 따라 중요한 조직 리모델링이 있을 수 있다. 단일 세포 분석의 증가로 유전자 발현에서 관찰된 차이는 단순히 해리 유발 된 동요의 결과가 아니라 질병 모델과 관련된 근본적인 생물학적 변화를 진정으로 대표하는 것이 중요합니다. 공개적으로 이용 가능한 식 데이터의 사용은 우리가 생존가능성을 극대화하면서 세포외 매트릭스의 효과적인 소화를 보장하기 위해 소화 버퍼의 공식을 수정할 수 있었습니다. 향후 응용 분야에서 고려될 수 있는 추가 수정은 해리프로토콜(15)에민감한 즉각적인 초기 유전자의 전사를 중단하기 위해 actinomycin D의 첨가를 포함한다.
파이프팅 기술은 조직을 해리하거나 이미 현탁액에있는 세포를 전송 할 때 중요합니다. 전단력으로 인한 세포의 물리적 손상을 줄이기 위해 세포 재서스펜션 중에 부드럽고 천천히 피펫하는 것이 중요합니다. 일반적으로 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 표준 팁을 사용하는 경우 세포를 손상시키는 전단 력을 피하기 위해 피펫 셀 서스펜션을 부드럽게 피하는 것이 특히 중요합니다. 이 프로토콜에서는 세포 스트레이너를 사용하는 것이 불가피하지만, 세포 농도는 100 μL 이상의 부피 손실과 함께 20% 이상 감소할 수 있다. 정확한 세포 수를 보장하기 위해 긴장 후 세포 농도를 결정하는 것이 좋습니다.
흐름 세포면에서 FMO 컨트롤은 중복방출 피크에서 신호의 출혈로 인해 배경의 측정을 제공합니다. 그(것)들은 항체가 그 채널에 포함될 때 존재할 수 있는 비특이적인 항체 결합, 또는 배경 염색의 측정이 아닙니다. 비특이적 항체 결합을 고려하기 위해, 하나는 적절한 등류형 제어를 포함해야 한다; 배경 염색의 경우 음수 컨트롤을 포함해야 합니다. 이러한 컨트롤을 종합하여 세포 집단을 정확하게 측정할 수 있습니다.

정상적인 오줌 방광 기능의 동요는 많은 개별을 위한 삶의 감소질로 이끌어 낼 수 있습니다. 부상이나 질병이 정상적인 방광 기능을 탈선하는 방법을 더 잘 이해하기 위해서는 방광 내의 세포의 정상적인 생물학적 상태와 실험적 동요 하에서 어떻게 변화하는지 조사하는 것이 중요합니다. 그러나 현재까지 오줌 방광 내에 거주하는 특정 세포 인구와 부상으로 어떻게 변하는지 는 불완전하게 특징지어지고 있습니다.
유동 세포형 또는 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 같은 단일 세포 프로파일링 방법은 방광 내의 특정 세포 유형에 빛을 비출 가능성이 있다. 그러나, 유익한 조직이 되는 이러한 접근법은 수확된 조직의 생존력, 유전자 발현 및 대표적인 세포 집단 비율에 영향을 미치지 않는 방식으로 소화되어야 한다. 효소 적 분리를 사용하는 프로토콜은 무차별 적인 프로테아제 활성1을통해 표면 마커 발현에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 세포 측정에 의한 세포 식별에 영향을 미치는 반면, 해리 과정 자체는 반 덴 브링크 및 동료2에의해 최근에 설명된 바와 같이 즉각적인 초기 유전자의 유도로 이어질 수 있다. 저자는 해리에 영향을 받은 하위 인구가 작더라도, 즉각적인 초기 유전자의 높은 발현 수준 때문에 대량 발현 연구 결과에 있는 강한 오염 신호를 시작할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 또한, 해리 프로토콜의 지속 기간은 일부 하위 집단에 고유한 것으로 나타난 유전자의 대량 발현 수준을 검출하는 데 영향을 미쳤다. 따라서, 해리 프로토콜의 영향을 고려하지 않고 생성된 단일 세포 데이터 세트는 근본적인 생물학과는 반대로 해리 방법으로부터 발생하는 유전자 발현 변화를 산출할 수 있다. 이러한 관측에 따르면 발표된 단일 세포 전사 데이터는 주의해서 해석되어야 하며, 그 결과는 독립적인 방법으로 검증되어야 합니다.
비록, 가혹하고 긴 해리 방법은 세포2에서유전자 발현을 바꿀 수 있습니다; 세포의 효과적인 격리는 존재하는 세포 모형의 정확한 표현을 얻기 위하여 필수적입니다. 방광은 다중 세포 모형을 포함하는 복잡한 기관이기 때문에, 비뇨기과 또는 기질 세포와 같은 몇몇 인구는 세포외 매트릭스 안에 존재하는 섬유아세포와 같은 그밖 세포 모형이 상대적으로 과소 표현될 수 있고 격리하기 어려울 수 있습니다. 방광이 척수 손상3,4 또는 방광 출구 방해5,6에서관찰되는 것과 같은 상당한 리모델링 및 섬유증을 겪은 경우 해리는 더욱 어려워진다.
여기서는 척수 손상 마우스 방광에서 하류 단일 세포 분석을 위한 최적화된 조직 해리 방법을 설명합니다. 유동 세포측정을 사용하여, 우리는 단 하나 세포 현탁액을 산출하고, 세포 생존가능성을 지원하며, 세포 집단의 정확한 비율을 유지하는 그들의 능력을 위한 4개의 효소 소화 프로토콜을 비교했습니다. 이 분석에 기초하여, 우리는 세포 사멸, 세포 응집체, 비 세포 핵산 및 다운스트림 분석의 잠재적억제제를 최소화하는 것이 고품질 데이터를 달성하는 데 중요하다는 결론을 내립니다.

<table><tbody><tr><td>2.5 X 확대경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 Vicryl 봉합사, 6.5mm 바늘 3/8 서클</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Cell Strainer</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 필터 와이드 오리피스 피펫터 팁 (1000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>에어로졸 필터 와이드 오리피스 피펫터 팁 (1000 &마이크로; L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD326 (Ep-CAM), 랫 모노클로날, IgG2a, &kappa;, 친화도 정제</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 랫 안티 마우스 CD45, 랫트 단클론, IgG2b, &kappa;, 클론 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN 마이크로 해부 겸자, 스트레이트, 1x2 이빨, 3.75" 길이, 0.3mm 팁 너비, 0.12mm 이빨</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company주식회사</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>시그마</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO 마이크로 봉합 바늘 홀더, 잠금 장치가 있는 직선, 5.75" 길이</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>세포 계수 키트, 이중 챔버 슬라이드 30개, 60개, 트리판 블루</td><td>Biorad</td><td>1450003</td> 세포 염색 완충액 포함 Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G 콜라겐분해효소 유형 I Worthington Biochemical Corporation의 콜라겐분해효소 Biorad 420201 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>세포<td>염색 완충액</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>LS004196</tr><tr><td>Collagenase Type III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor 488 & 프로피듐 요오드화물 (PI)</td><td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td></td><td>Sigma DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer Health Care LLC,NADA</td> <td># 140-913 FDA 승인. 로트 번호: AH01CGP</td><td>2.27% 주사 가능한 용액</td></tr><tr><td>Falcon 15ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1) 항체, rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase, type II</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers(100 &마이크로; m)</td> <td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, 마이크로 해부 스프링 가위, 스트레이트, 4" 길이, 0.15mm 팁 너비</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 항체, rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 안티 마우스 CD3&엡실론; 항체, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 항체, rat monoclonal, IgG2b, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a 항체, rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 항체, mouse monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells 항체, IgG2b, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &kappa;, Clone 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액 (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>나사 캡 마이크로 원심 분리기 튜브, 1.5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>삼중 항생제 연고 (neomycin / polymyxin B / bacitracin)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>피부 보호제</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), 페놀 레드</td><td>없음 Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin 눈 연고</td><td>Dechra 수의학 제품</td><td>NADA # 065-016. FDA 승인.</td><td>마취 중 눈 보호</td></tr></tbody></table>

척수 손상 다음 마우스에 있는 오줌 방광의 분자 분석을 위한 단 하나 세포 해리 접근

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

우리는 분리기 괄약근 dyssynergia, 기능성 방광 출구 방해 및 후속 방광 벽 리모델링을 유도하기 위하여 마우스에 있는 척수 손상의 구현을 기술합니다. 비부상 조절및 척수 손상마우스에서 방광벽의 세포구성평가를 용이하게 하기 위해 높은 세포 생존가능성을 지원하고 유동 세포측정에 의한 이산 하위집단의 검출을 가능하게 하는 최적화된 해리 프로토콜을 개발했습니다.
척수 손상은 흉부 척수의 완전한 transection에 의해 생성됩니다. 조직 수확 시, 동물은 깊은 마취 하에 인산염 완충식식염으로 침투하고 방광은 티로드의 완충제로 수확됩니다. 조직은 공개적으로 이용 가능한 유전자 발현 데이터베이스의 심문에 의해 결정된 마우스 방광의 콜라겐 함량에 기초하여 최적화된 소화 완충제에서 인큐베이션 하기 전에 다진다. 단일 세포 현탁액의 생성에 이어, 물질은 세포 생존가능성, 세포 수 및 특정 하위 집단의 평가를 위한 유동 세포측정에 의해 분석된다. 우리는 이 방법이 90% 이상의 생존력을 가진 세포 집단을 산출하고, 중간엽 및 상피 기원의 세포의 견고한 표현을 산출한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 마우스 방광 및 잠재적으로 다른 장기에 있는 개별적인 세포 모형의 정확한 다운스트림 분석을 가능하게 할 것입니다.

수술 흉부 척수 흉부의 성공은 여러 매개 변수의 평가에 의해 결정되며, 그 중 가장 명백한 것은 뒷다리 마비입니다. 동물은 앞다리를 사용하여 뒷다리를 드래그합니다. 그렇지 않으면 수유, 그루밍 및 경보를 포함한 활동 수준은 일반적으로 정상입니다. 또한, 동물은 12시간마다 조사관이 수동 방광 발현을 필요로 하는 의지에 따라 10~14일 후에 반사 블렌딩이 반환될 때까지 의지에 따라 방광 조절을 잃게 된다. 안락사 다음, 부상의 성공의 추가 징후는 주로 방광 대 체중 비율의 증가와 관련이, 조직 리모델링의 표시. 조직학적 분석은 비뇨기과 민원 근육 구획3내의 증식을 나타낸다.
단일 셀 서스펜션 의 준비 공개적으로 이용 가능한 발현 데이터를 사용하여 세포외 매트릭스 단백질용 방광 조직의농축(도 2)을결정하고 소화 믹스의 제형을 알리는 데 사용하였다. 콜라겐은방광벽(11,12)의핵심 성분이기 때문에, 먼저 마우스 ENCODE프로젝트(13)에의해 생성된 RNA 프로파일링 데이터 세트를 사용하여 마우스 방광에서 가장 풍부한 콜라겐(들)을 결정하기 위해 노력했다. 우리의 분석은 콜라겐 1A1, 콜라겐 3A1, 콜라겐 1A2 및 콜라겐 6A1이 마우스 방광 내의 가장 풍부한 콜라겐 유형임을 보여주었다(그림 2A). 우리는 또한 타불라 무리스 (마우스 (무스 무큘러스)에서 단일 세포 전사 데이터의보상)을 사용하여 콜라겐 1, 3, 6 및 히알루로난의 mRNA 발현 수준을 결정했습니다. 데이터는 조직 사이에서 공유된 세포 모형에 있는 유전자 발현의 직접 그리고 통제된 비교를 허용합니다. 이 분석은 이러한 세포외 매트릭스 성분의 발현이 비뇨기과(도2B)가아닌 중간엽 세포 유형에서 더 널리 퍼진 것으로 나타났다.
방광에서 고립 된 세포의 생존에 해리의 효과 유동 세포측정 분석은 4가지 프로토콜을 이용한 효소 소화가 각각 83%, 86%, 93% 또는 90%의 생존가능성을 산출한 것으로 나타났다. 따라서 프로토콜 섹션 3은 세포 생존가능성을 보존하는 데 가장 중요한 것으로 간주되었다. 또한 세포의 약 4%가 괴사(PI +/부속서V-)(도 4A)인것을 관찰하였다. 이러한 관찰은 소화 프로토콜의 효율성과 세포 생존가능성에 대한 후속 이점을 강조합니다.
방광에 있는 세포의 다른 인구에 척수 손상의 효력 우리는 대조군에 비해 SCI 마우스의 방광에 있는 총 세포 수에 있는 중요한 증가를 관찰했습니다. SCI 방광에서 얻은 점 플롯의 패턴은 또한 척수 손상으로 인한 지속적인 장기 리모델링과 약간 달랐다(그림 4B: 첫 번째 컬럼). 대조군과 비교하여 SCI 동물의 방광은 CD45 양성 세포의 상당한 증가를 보였습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> 그림 1: 간의 밝은 색상으로 대표적인 관류 완료. (A)관류의 시작 부분에 간 색을 보여줍니다. (B)관류의 끝에 밝은 간 색을 표시합니다. 마우스 (A)는 관류 2 주 전에 척수 트란담을 가지고 있었고, 그 결과 척수 손상이없는 마우스 (B)에서 마우스와 달리 골반에서 방광 비대 및 돌출이 발생했습니다. 이 경우 방광은 작고 골반에 숨겨져 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> 그림 2: 마우스 방광에서 세포외 매트릭스(ECM) 성분의 전사적 발현. (A)43가지 콜라겐 타입의 바 차트. 표현은14(데이터는 BioProject: PRJNA66167)에서 수집된 백만 개의 매핑된 읽기당 1킬로베이스당 읽기에 의해 명시된다. (B)미생물액액액액계 3'-엔드계에서 수득된 세포 유형의 유전자 발현의 바이올린 플롯은 남성과 여성의 소화 된 오줌 방광 샘플(남성과 여성)의 풀에서 계산된다. 카운트는 백만 ln (CPM +1)8당 1 + 카운트의 천연 logarithm을 사용하여 각 셀에 대해 로그 정규화되었다. 로개스텀을 복용하기 전에 CPM 1의 의사 수가 추가되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> 그림 3: 게이팅 전략 및 FMO 제어를 통해 형광 확산을 결정합니다. (A)세포 집단의 선택. (B)싱글을 위한 게이팅 전략. (C)괴사용 게이팅, PI 및 부속서 V 항체를 이용한 초기 및 후기 세포. (D\u2012F) 다색 유동 세포측정의 회로도 플롯(예를 들어, A, B, C, D 불소크롬 +와 결합된 항체(부속서 V 및 PI). 이는 염색되지 않은 대조군과 비교하여 FMO 대조군에 의해 나타난 형광 A 채널로 항체로 확산되는 형광을 나타낸다. 주황색 점선은 빨간색의 얼룩지지 않은 경계에 비해 FMO 게이팅 경계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> 그림 4: 방광에 있는 다른 세포 모형의 혈투 세포측정. (A)부속서 V/PI 더블 염색 흐름 차트. 각 프로토콜에 사용되는 효소와 화학 물질의 상이한 조합은 해당 생존성 플롯 앞에 표현된다. 이러한 데이터는 프로토콜 섹션 3에서 가장 높은 생존력을 얻었다는 것을 보여줍니다. (B)단일 채널에서 검출된 라이-6A/E(Sca-1) 및 CD326(Ep-CAM)의 강도를 보여주는 대표적인 히스토그램. (C)마우스 방광의 세포 집단에 대한 SCI의 효과. 상부 패널은 대조군 비수술용 마우스로부터 얻어진 3개의 해리된 방광에 염색의 결과를 보여주고 낮은 패널은 SCI를 가진 3개의 동물에 염색의 결과를 보여줍니다. 첫 번째 열은 총 세포 집단입니다. 두 번째 열에는 단일 게이팅 선택이 표시됩니다. 세 번째 컬럼은 B 세포, T 세포 및 NK 셀에 대해 부정적인 살아있는 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 네 번째 열은 CD45에 대해 양성 라이브 셀에 대한 염색을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>양(500mL용)</td>
			<td>어러지니</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-포도당</td>
			<td>0.9 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Tyrode의 솔루션을 준비하기 위한 구성 요소입니다. 표시된 구성 요소는 500mL Tyrode의 솔루션을 준비하기 위한 것입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>금액</td>
			<td>프로토콜 섹션 1</td>
			<td>프로토콜 섹션 2</td>
			<td>프로토콜 섹션 3</td>
			<td>프로토콜 섹션 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.03 mM</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라게나아제 타입 I</td>
			<td>132.5대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라게나아제 타입 III</td>
			<td>96.4대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라게나제 타입 VI</td>
			<td>50대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>드나스</td>
			<td>10대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>파파인</td>
			<td>115대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>팬 콜라게나제</td>
			<td>50대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>히알루로니다제</td>
			<td>10.5 대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>디스파스 II</td>
			<td>1.25 대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>세포 해리 솔루션</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>재조합 효소</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 소화 버퍼를 준비하기 위한 구성 요소입니다. 표시된 성분은 2.5mL 소화 믹스의 제조를 위한 것입니다(1 U는 37°C에서 분당 기질 1 μmol의 가수분해를 촉매한다. 각 효소의 단위의 정의를 위한 제품 데이터 시트를 참조하십시오).

이 프로토콜의 목표는 척수 손상의 마우스 모델에 최적화된 조직 해리 프로토콜을 적용하고 유동 세포측정에 의한 단일 세포 분석 접근법을 검증하는 것입니다.

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

이 프로토콜은 생물학적 정보를 사용하여 높은 세포 생존율을 가진 단일 세포 현탁액의 생성을 촉진하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 세포 생존율과 분리된 세포 유형의 적절한 표현을 유지하는 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있다는 것입니다. 수술 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 연구원인 후세인 아타(Hussein Atta)가 맡을 것입니다.조직 해리 절차를 시연하는 사람은 Ali Hashemi와 FACS 분석인 Yaser Heshmati가 맡을 것입니다. 마취된 성인 마우스에서 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후, 흉추에서 가장 두드러진 가시 돌기를 촉진합니다. 진통제와 항생제는 수술 전에 투여됩니다.마우스 뒷면의 목 아래쪽에서 가장 눈에 띄는 가시돌기 바로 아래까지 세로로 직사각형을 깎고 정중선의 양쪽에서 1cm를 깎습니다. 노출된 피부를 절개 부위부터 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 10% 포비돈 요오드와 70% 에탄올 물티슈로 세 번 소독합니다. 마지막으로 닦은 후 수술 부위에 창문이 있는 멸균 4x4인치 거즈 스펀지로 마우스를 덮습니다.척수 손상을 유도하려면 먼저 등 중앙을 1.5cm 절개하고 날카로운 둔기 절개를 사용하여 척추돌기와 T9, T10 및 T11 척추의 얇은 판에서 근육을 분리합니다. T10 척추돌기의 양측 후판 절제술을 시행하기 전에 가는 가위를 사용하여 T9와 T10, T10과 T11 사이의 척추간 인대를 날카롭게 나눕니다. 얇은 판이 완전히 절제되면 가위를 사용하여 척수를 절제합니다.측면 기둥을 완전히 자르려면 양쪽에 있는 가는 가위 끝을 섬세하게 쓸어줍니다. 멸균 면 팁을 사용하여 출혈을 압축하십시오. 항상성을 달성한 후 7-0 폴리글락틴910 연속 봉합사로 피부를 닫고 수술 후 탈수를 방지하기 위해 1ml의 식염수를 피하로 투여한 다음 동물을 새 케이지로 되돌려 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 동물을 새 케이지로 되돌립니다.12시간마다 한 손으로는 동물을 잡고 다른 한 손으로는 하복부를 마사지하면서 검지와 엄지손가락을 사용하여 팽창된 방광을 찾아 부드럽게 압박하여 동물이 스스로 소변을 볼 수 있을 때까지 수동 방광 표현을 자극합니다. 관심 방광 세포 유형의 다운스트림 분석을 위해 적절한 실험 시점에 동물이 적절하게 마취된 후 골반에서 횡격막까지 정중선 개복술을 수행하고 횡격막을 갈비뼈에서 잘라냅니다. 흉골과 평행한 뼈 연골 경계를 따라 횡격막에서 시작하여 첫 번째 갈비뼈까지 동물의 양쪽에 있는 갈비뼈를 따라 흉부를 엽니다.흉곽 앞쪽을 동물의 머리 위에 고정한 후, 가는 가위를 사용하여 심낭을 잘라내고 23게이지 바늘을 관류 장치에 연결합니다. 바늘을 좌심실에 삽입하고 조직에 구멍을 뚫지 않고 바늘을 대동맥으로 천천히 전진시킵니다. 바늘이 제자리에 놓이면 분당 15ml의 유속으로 조직에 PBS를 주입하기 시작하고 가는 가위의 끝을 사용하여 오른쪽 심방을 빠르게 작게 자릅니다.배액이 맑고 옅어진 간 색이 관찰되면 관류를 중지하고 혈관 척추와 요도에서 방광을 분리한 다음 얼음처럼 차가운 Tyrode의 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 방광을 넣습니다. 단일 세포 현탁액을 준비하려면 모든 방광을 채취한 후 100마이크로리터의 Tyrode 용액이 들어 있는 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 찢습니다. 무게를 잰 후 100마이크로리터의 Tyrode 용액이 들어 있는 10cm 페트리 접시에 담긴 방광을 다진 다음 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 조직 조각을 방광당 2.5ml의 소화 완충액으로 옮깁니다.Nutator 믹서에서 섭씨 37도에서 40분 동안 조직을 배양하고 5ml 피펫을 사용하여 1분 동안 샘플을 분쇄한 후 원심분리로 해리된 세포와 조직을 수집합니다. 펠릿을 1ml의 세포 분리 용액에 재현탁시키고 세포를 Nutator 믹서에 추가로 10분 동안 놓습니다. 배양이 끝나면 다른 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁합니다.1분 후, 9 밀리리터의 PBS를 첨가하여 용해를 중지하고 70 마이크로미터 스트레이너를 통해 세포를 50 밀리리터 튜브로 여과한 다음 세포를 다시 원심분리하고 FC 블록이 보충된 200 마이크로리터의 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 얼음에서 10분 동안 배양한 후 원심분리로 세포를 수집하고 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 적절한 양의 형광단 접합 항체 마스터 믹스에 펠릿을 20분 동안 재현탁합니다. 배양이 끝나면 1ml의 세포 염색 완충액으로 세포를 세척하고 5마이크로리터의 FITC Annexin V와 1마이크로리터의 프로피듐 요오드화물이 보충된 100마이크로리터의 신선한 세포 염색 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.실온에서 15분 후 400마이크로리터의 Annexin 결합 완충액을 세포에 첨가하고 반전으로 혼합합니다. 유세포 분석으로 세포를 분석하려면 먼저 염색되지 않은 세포 샘플을 사용하여 세포의 측면 및 전방 산란 매개변수를 설정한 다음 530나노미터 및 575나노미터 이상에서 형광 방출을 측정하여 죽은 세포를 배제합니다. 각 점 블롯의 그리드를 사용하여 첫 번째 감소에서 음의 모집단을 정의하고 형광 마이너스 1 컨트롤을 사용하여 음수 및 양수 모집단 매질이 정렬될 때까지 스펙트럼 중복을 수정합니다.그런 다음 관심 있는 특정 마커를 가진 세포의 이벤트 100, 000개를 측정하여 필요에 따라 관심 세포 집단에 대한 게이트를 만듭니다. 모든 샘플이 실행되면 적절한 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 콜라겐 1A1, 콜라겐 3A1, 콜라겐 1A2, 콜라겐 6A1은 쥐의 방광에서 발견되는 가장 풍부한 콜라겐 유형입니다.콜라겐 1, 3, 6 및 히알루론의 mRNA 발현 수준을 결정하기 위한 분석은 이러한 세포외 기질 구성 요소의 발현이 요로상피보다 중간엽 세포 집단에서 더 널리 퍼져 있음을 보여줍니다. 유세포 분석은 여러 서로 다른 효소 분해 프로토콜이 생존력이 높은 세포 집단을 생성하며, 이 분석에 사용된 세 번째 분해 프로토콜이 세포 보존에 가장 효과적인 것으로 결정됨을 나타냅니다. 이 방법을 사용하면 척수 손상 마우스의 방광에서 분리된 총 세포 수를 크게 증가시켜 방광을 대조군과 비교할 수 있습니다.대조군과 비교했을 때, 척수 손상 동물의 방광도 CD45 양성 세포가 크게 증가한 것으로 나타났습니다. 7.1단계는 심장 집단을 식별하는 데 중요합니다. 게이팅 전략은 관심 있는 셀에 의해 알려져야 합니다.SCI 동물의 방광은 뚜렷한 세포 개체군을 가지고 있습니다. 이 프로토콜은 세포 분류, 일차 세포 배양, 단일 세포 염기서열분석 및 생존 가능한 단일 세포가 필요한 기타 분자 및 세포 다운스트림 절차에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 생존율을 제공하므로 세포 집단 손실이 적으며, 이는 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 단일 세포 분석 기술의 핵심 포인트입니다.

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

플라스크에 세포의 준수 속도에 따라 musculoskeletal 부드러운 조직에서 분리 성인 줄기 세포.

소프트 Musculoskeletal 조직에서 줄기 세포를 분리

태아 마우스 조직에서 신경 능선 - 파생의 연결을 progenitors 정화 최적화된 절차를 설명합니다. 이 방법은 형광 활성화된 셀 정렬 (FACS)에 의해 이산 인구를 분리하기 위해 형광등 기자 대립 유전자로부터 표현의 활용합니다. 기술은 개발 전반에 걸쳐 또는 성인 조직에서 subpopulations의 연결을 분리하여 적용할 수 있습니다.

태아 쥐의 내장 장기에서 자율 신경 Progenitors의 형광 - 활성 셀 정렬 (FACS) 절연을위한 최적화된 절차

출처: 양, E. 외. 요로 감염의 쥐 모델에서 생성된 단일 세포 내 박테리아 군집의 분리, 즉 단일세포 분석을 위한 연구. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 감염된 마우스 방광에서 세포 내 박테리아 군집을 포함하는 단일 상피세포를 입 마이크로피펫팅을 이용해 수동 분리하는 과정을 시연하여, 요로 감염 모델에서 생존 가능한 숙주 관련 대장균 집단의 하위 단일 세포 분석을 가능하게 합니다.

세포 내 박테리아 군집을 포함하는 마우스 방광 상피 세포 분리

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여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

이 프로토콜에는 요로 감염의 murine 모델에서 단일, 감염 방광 상피 세포를 분리 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

다운스트림 단일 세포 분석에 대 한 요로 감염의 Murine 모델에서 생성 된 단일 세포내 세균성 지역 사회의 절연

이 프로토콜은 추가 세포 실험을 위한 쥐 방광에서 1 차적인 신경세포 및 glia 격리를 위한 반복가능한 프로토콜을 설치하기 위하여 시도합니다.

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이 신경세포 해리 프로토콜은 출발 물질의 양이 적은 샘플을 대상으로 하며, 선택적 고정 및 염색 단계를 통해 다운스트림 분석을 위해 매우 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

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이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.

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