Name: SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 배우세요 384웰 형식의 세포 열 이동 분석법을 사용하여 SHP2 억제제의 세포 내 표적 참여를 평가하는 방법을. 암 치료를 위한 효과적인 소분자 억제제 발견에 필수적인 기술입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 건강 보조금 1R21CA195422 (L. T.), 엡스타인 가족 재단 상 (N. D. P.C.), NCI 암 센터 지원 보조금 P30CA030199의 국립 학회에 의해 지원되었다. 또한,이 프로젝트는 화학 생물학 컨소시엄 계약 번호에 따라 국립 암 연구소, 국립 보건 원의 연방 기금으로 전체 또는 부분적으로 자금을 지원받았습니다. HHSN2612008000001E. 이 출판물의 내용은 반드시 보건 복지부의 견해나 정책을 반영하지 않으며, 미국 정부의 보증을 암시하는 무역 이름, 상업용 제품 또는 조직에 대한 언급도 아닙니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 세포 배양 및 시약 준비
<ol><li>500mL 의 성장 매체를 10% 태아 소 혈청, 항생제/항미코틱 1배, 20mM HEPES, 1mM 나트륨 피루바테로 제조합니다. 4 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>냉동 원래 재고 병에서 세포 열 이동 시약 (EA 시약, 리시스 버퍼 및 기판)을 해동하십시오.</li>
	<li>시약과 버퍼를 2mL 알리쿼트로 분배하고 -20°C에 저장합니다. 참고: 재현성을 위해 동결/해동을 피하고 분석 절차에 필요한 시약의 부피만 사용하십시오.</li>
</ol>2. HEK293T 셀의 성장 및 유지 보수
<ol><li>저통로 부착 HEK293T 세포를 극저온 저장으로부터 구하십시오.</li>
	<li>성장 매체에서 HEK293T 세포를 37°C, 5%CO2로유지한다.</li>
	<li>1:14 비율로 4 일마다 셀을 분할합니다. 참고: 최상의 성능을 위해 HEK293T 셀은 25배 이상 통과할 수 없습니다.</li>
</ol>3. 일시적인 과도 성 전적을 위한 HEK293T 셀 준비
<ol><li>세포 분리 시약의 3mL를 사용하여 16mL 플레이트로부터 HEK293T 세포를 분리한다.</li>
	<li>성장 매체의 12mL로 희석하십시오. 4 분 동안 1,400 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.</li>
	<li>10 mL 성장 매체에서 펠릿을 다시 중단합니다. 트라이판 블루와 셀 카운터를 사용하여 세포의 농도와 생존가능성을 측정합니다.</li>
	<li>플레이트 7.0 x 105 기하급수적으로 성장 HEK293T 세포 6 잘 세포 배양 플레이트에서 잘 당 약 24 회 전 형질 전. 참고: 각 플라스미드가 전감염될 수 있도록 잘 예약하십시오.</li>
	<li>37 °C에서 24 시간, 5 % CO2에대한 인큐베이션.</li>
</ol>4. HEK293T 세포의 트랜스페트
<ol><li>pICP-ePL-N-SHP2-WT 또는 pICP-ePL-N-SHP2-E76K(~200 ng/μL)의 정제된 플라스미드 스톡에서 2μg의 플라스미드 DNA를 200 μL의 트랜스페션 버퍼로 희석시켰다.</li>
	<li>10s 및 원심분리기의 소용돌이가 1,400 x g에서 4분 동안.</li>
	<li>희석된 DNA에 4 μL의 형질 전환 시약을 추가합니다. 10s 및 원심분리기의 소용돌이가 1,400 x g에서 4분 동안.</li>
	<li>10 분 동안 23 °C에서 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>인큐베이터에서 성장하는 HEK293T 세포를 함유한 6개의 웰 플레이트를 제거합니다. 6웰 플레이트의 부착된 셀에 투명 혼합물을 추가합니다. 37°C에서 24시간, 5% CO2의 배양.
</li>
</ol>5. 분석 판 준비
<ol><li>테스트할 화합물의 DMSO에 10mM 스톡 솔루션을 준비합니다.</li>
	<li>즉시 사용하기 위해 384웰의 낮은 죽은 볼륨 소스 플레이트에 억제제 용액을 분배합니다.</li>
	<li>액체 처리기를 사용하여 원하는 양의 억제제 또는 차량(DMSO)을 0.5% 미만의 DMSO(v/v)의 목표 최종 부피에서 384웰 의 실시간 PCR 플레이트로 반점한다. 불활성 가스 정화판 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 참고: 억제제 용량 반응 측정제의 경우, DMSO의 동일한 양이 각 억제제 농도에 사용되도록 그에 따라 DMSO를 백필해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 23°C에서 플레이트를 저장하고 24시간 이내에 플레이트를 사용하십시오.</li>
</ol>6. 전염성 세포 분리 및 준비
<ol><li>37°C 수조에서 성장 용지 및 세포 분리 시약을 preincubate. 인큐베이터에서 감염된 세포를 제거합니다. 접시의 우물에서 부드럽게 미디어를 흡인. 참고: 다른 감염된 플라스미드가 포함된 모든 웰에 새 흡인대를 사용하십시오.</li>
	<li>세포 분리 시약의 0.3 mL를 추가합니다. 플레이트 를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 플레이트 바닥의 표면을 철저히 덮습니다. 2분 동안 23°C에서 배양합니다.</li>
	<li>각 웰에 성장 미디어 1mL을 추가합니다. 웰의 부드럽게 파이펫 미디어와 셀을 피펫하고 15mL 팔콘 원심분리기 튜브로 이송합니다. 4 분 동안 1,400 x g에서 원심 분리로 세포를 수집합니다.</li>
	<li>부드럽고 철저하게 미디어에서 흡인. 참고: 세포 분리 시약의 잔류 페놀 레드는 분석에 방해가 될 수 있다.</li>
	<li>조심스럽게 성장 매체의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단. 트라이판 블루와 셀 카운터를 사용하여 세포의 농도와 생존가능성을 측정합니다. 참고: 셀 생존가능성은 > 90%여야 최상의 결과를 낳을 수 있습니다.</li>
	<li>세포를 125세포/μL 농도로 희석시다. 예를 들어, 5 μL 분석의 경우 이것은 ~625세포/μL이다. 최적의 생존을 위해 세포를 2시간 이하로 정지 상태로 유지합니다.</li>
</ol>7. SHP2 억제제와 세포의 배양
<ol><li>멸균 단일 채널 용액 트로프에 세포를 분배합니다.</li>
	<li>23°C에서 5분 동안 2,500 x g에서 SHP2 억제제 증착에 의해 미리 제조된 원심분리기 384-웰 실시간 PCR 플레이트.</li>
	<li>복합 플레이트에서 씰을 제거합니다. 125 μL 멀티채널 파이펫을 사용하여 희석된 셀의 5μL을 원하는 우물에 추가합니다.</li>
	<li>플레이트에 뚜껑이 없는 30초 동안 42 x g의 플레이트원심분리기. 플레이트가 회전한 후 플레이트에 뚜껑 씰을 부착하고 분석 플레이트를 37°C, 5%CO2에서 1h로 배양한다.</li>
</ol>8. 화학 발광 시약 마스터 믹스의 준비
<ol><li>도금 세포 후 -20°C 저장에서 필요한 수량의 검출 시약(EA 시약, 용해 완충및 기판)을 제거한다. 23 °C에서 시약을 해동하십시오. 참고: 이송의 편의를 위해 플레이트에 증착된 셀의 총 부피의 1.5배인 부피를 준비한다. 사용 후 시약을 재사용하지 마십시오.</li>
	<li>다음과 같이 구성 요소 및 부피 분획으로 구성된 조건 EA-10을 사용하여 시약의 마스터 믹스를 준비하십시오: EA 시약(0.17), 리시스 버퍼(0.17), 기판(0.67). 참고: 시약 비율은 공급업체 매뉴얼에 명시된 대로 수행된 최적화 실험을 기반으로 합니다.</li>
</ol>9. 이소르말 또는 열 프로파일 그라데이션 열 펄스
<ol><li>열 펄스의 전달을 위해 그라데이션 가능한 써모사이클러를 프로그래밍합니다.<ol>
<li>열 프로파일 그라데이션 실험의 경우 다음과 같은 예제 사양으로 열순환기 사전 프로그래밍을 수행합니다.</li>
		<li>열 펄스 : 3 분 원하는 용융 온도 (수직 또는 수평 그라데이션 +/- 15 °C; 24 우물에 걸쳐 38-68 °C 확산 1.25 °C의 온도 증가).</li>
	</ol>
</li>
	<li>평형 복구 단계 : 램프 속도 = 1 °C / s3 분 20 °C<ol>
<li>isothermal 실험의 경우 다음과 같이 프로토콜 설정이 설정됩니다.</li>
		<li>열 펄스 : 3 분 55 ° C. 평형 복구 단계 : 램프 속도 = 1 ° C / s3 분 20 ° C 참고: 재현성이 증가하려면 열순환기가 원하는 온도에 도달할 때 플레이트를 정확하게 배치하기가 어려울 수 있으므로 3분 펄스를 시작하기 전에 15초를 카운트다운하도록 프로그램을 설정합니다. 이 실험에 사용된 열순환기의 경우 재료 테이블을참조하면 열 펄스 중에 뚜껑이 유지됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. 리시스 감지 및 측정
<ol><li>다중 채널 파이펫을 사용하여 분석할 수 있는 각 웰에 동일한 볼륨(5 μL)을 첨가하여 용해 검출 마스터 믹스를 사용한 분석 플레이트를 보충합니다.</li>
	<li>30 s에 대 한 플레이트 42 x g 원심 분리 기. 어둠 속에서 23°C에 30-60분 간 보관하십시오.</li>
	<li>384웰 형식으로 발광을 감지할 수 있는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 화학 발광을 측정합니다. 플레이트 유형 및 통합 시간 최적화(통합 시간 1000 ms, 정착 시간 0 s)로 발광 측정을 수행합니다. 추가 분석을 위해 값을 카운트/s 및 출력으로 측정합니다.</li>
</ol>11. 데이터 분석
<ol><li>과학 적인 2D 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 발광 데이터를 분석합니다.</li>
	<li>비선형 회귀 및 Boltzmann 시그모이드 모델을 사용하여 정규화된 발광 데이터(차량 제어로 정규화)를 분석하여 열 프로파일을 생성합니다. 참고: 열 프로파일 실험에서, 계산된 V50,곡선의 바닥과 위쪽 사이의 중간 지점인 온도는 SHP2의 용융 온도를 정의합니다. 이더스말 실험에서 EC50은 반 최대 응답을 제공하는 억제제의 농도를 정의합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation%3A+thirty+years+and+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li>
<li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).</li>
<li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+inhibitors%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tyrosine+Phosphatases%3A+Time+to+End+the+Stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li>
<li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li>
<li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+Shp2+%28PTPN11%29+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li>
<li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li>
<li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li>
<li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeel%2C+BG+%22Handbook+of+Cell+Signaling+%28Second+Edition%29%22">Handbook of Cell Signaling (Second Edition)</a>. 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li>
<li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases%3A+next-generation+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li>
<li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li>
<li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+PTPome+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Thereapeutics+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li>
<li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li>
<li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li>
<li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets%3A+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li>
<li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li>
<li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li>
<li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-%2C+NF1-+and+RAS-driven+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li>
<li>Clinical Trial NCT03114319. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019).</li>
<li>Clinical Trial NCT03634982. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2%28E69K%29+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li>
<li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).</li>
<li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li>
<li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells%2C+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+%28PTPN11%29+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li>
<li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li>
</ol>

저자는 이 문서의 내용과 이해상충이 없다고 선언합니다.

우리는 세포에서 SHP2 인산염에 작은 분자의 직접적인 결합을 확인할 수 있는 표적 참여 분석서를 제출했습니다. 상기 분석체는 낮은 친화성 억제제를 구별할 수 있으며, 중요한 것은 GOF 온코겐성 SHP2-E76K 돌연변이체에 대한 SHP099형의 알로스테릭 억제제에 의한 효능의 부족을 확인할 수 있다. 이 소형 분석의 강점은 SHP2 억제제 스크리닝 캠페인에 통합될 수 있는 능력입니다. 알 수 없는 화학 물질에 의한 SHP2에 대한 세포 내 결합을 확인하는 분석의 능력은 스크리닝 자원을 효율적으로 배치할 수 있음을 보장하는 중요한 능력입니다. 전반적으로 소형화된 프로토콜은 강력하고 신뢰할 수 있습니다.
분석의 중요한 측면은 타이밍입니다. 최상의 결과는 HEK293T 세포의 형질 전환 후 24h를 얻어진다. SHP2-WT 및 SHP2-E76K 단백질은 독성이 없는 것으로 보입니다. 그러나 장기적인 높은 발현은 실험의 감도를 감소시킬 수 있으며 다시 최적화가 필요합니다. 세포를 조...

티로신 인산화는 세포1,,2에서신호 변환에 중요한 역할을 한다. 이 번역 후 변형은 단백질 티로신 키나아제 (PTKs)에 의해 촉매되고 단백질 티로신 인스파타제 (PTP)에 의해 반전됩니다. 따라서, 비정상적인 PTK 또는 PTP 기능은 많은 상속 또는 획득된 인간질환3,4,4,,5,6로이어집니다. Src-homology 2 (SH2) 도메인 함유 인산염 2 (SHP2)는 프로토 온코진 PTPN117에 의해 인코딩된 널리 발현된 비수용체 형 PTP이며 Ras/Raf/ERK, PI3K/Akt의 활성화에 의한 신호변환을포함하는 수많은 생리적 과정의 주요 레귤레이터이며, 8. 일반적으로 SHP2 활동은 비정상적인 신호를 방지하기 위해 엄격하게 조절됩니다. 기저 조건하에서 SHP2는 촉매 인광파아제 도메인 내의 활성 부위에 대한 액세스를 차단하는 N 단말 SH2 도메인에 의해 자동 억제된다(그림1A)9,,10. 세포 활성화 시, 티로신 인스포이드 결합 단백질은 SHP2를 모집하여 활성 부위가 기판에 접근할 수 있는 활성 형성을 채택하게 됩니다. 많은 암에서 SHP2 활동이 상승합니다. PTPN11의 체세포 게인(GOF) 돌연변이는 주로 백혈병에서 확인되었으며 N-SH2 도메인의 결합을 포스파타제 도메인으로 방지하여 구성활성 SHP2(도1B)11을초래한다. PTPN11의 생식선 GOF 돌연변이는 누난 증후군의 경우 ~50%,악성종양12의위험이 증가하는 발달 장애에 대한 책임이 있다. PTPN11 돌연변이가 드문 고형 종양에서는 인광결합 단백질의 수치가 더 높으며, 이는 향상된 SHP2활성(도 1C)으로이어진다. SHP2는 또한 면역 체크포인트 신호에 중요하며, BTLA 또는 PD-1과 같은 체크포인트 수용체는 SHP2를 모집하여 주요 신호 분자를 탈포하여 면역 세포활성화를방지13,14,,15.
PTP의 활성 부위가 매우 보존되고 고도로 충전되어 있기 때문에 작은 분자로 PTP를 타겟팅하는 것은 어려운 일이었습니다. 활성 부위를 표적으로 하는 억제제는 종종 강력하지만, 선택도 및 경구 생체 이용률이 떨어지는16,,17,,18,,19,,20,,21,,22를나타낸다. 실제로, 많은 보고 된 SHP2 억제제 가난한 선택성 및 세포에 효능의 부족에서 고통(23). 최근에는 SHP2의 알로스테릭 억제제와 우수한 선택성을 가진 알로스터리 억제제(예를 들어, SHP09924 및 RMC-455025)가보고되었으며 SHP2 억제제에 대한 관심을 새롭게 촉발시켰습니다. SHP099 및 RMC-4550에 기초한 화합물은 현재 수용체 티로신 키나아제(RTK) 경로활성화(26,27)로고형 종양을 치료하는 I상 임상시험에서현재 이다. 획기적인 동안, 이러한 화합물은 혈액암 환자의 상당수에서 백혈구 발생을 구동 하는 SHP2 종양 발생 돌연변이의 많은에 대 한 효과적 이다28,,29,,30. SHP2 온코겐성 변이체를 향한 SHP099와 같은 화합물의 효능부족은 SHP2 돌연변이체에서 중단되는 비활성 폐쇄 된 변형을 결합하고 안정화하여 SHP2 활동을 억제하기 때문에 독특한 알로스터 메커니즘에서 비롯됩니다. 또한, 최근보고서(31)에기초하여, SHP099와 같은 억제제로 치료받은 환자에서 적응성 내성 메커니즘은 매우 생각할 수 있다. 따라서, 활성을 대상으로 차세대 SHP2 억제제의 개발, 개방 상태는 강렬한 연구의 대상이다.
세포내의 새로운 SHP2 억제제의 특성화는 납 최적화 과정의 필수적인 측면이다. 비판적으로, 생리 조건 하에서 억제제의 입증 된 대상 참여는 약화학에 대 한 자원이 효율적으로 유망한 세포 효능화합물에 배포 되는 신뢰의 추가 수준을 제공. 과거에는, 그들의 표적에 작은 분자 억제제의 결합을 평가하는 몇몇 방법은 주로 단백질 키나아제(32)를위해 개발되었습니다. SHP2 셀룰러 표적 참여 분석기를 개발하기 위해 셀룰러 열 변화분석33을활용했습니다. 이러한 분석법은,단백질(34)에대한 체외 열 시프트(PTS) 분석과 유사하게, 표적 단백질 열 안정성을 모니터링하며, 이는 전형적으로 소분자의 결합에 의해 변화된다. 본래 분석은 표적 단백질 수준을 정량화하기 위해 항체를 활용하는 낮은 처리량 분석입니다. 대안적으로, 최근에 보고된 열시프트 분석법의 이체를 선택하여 β-갈라토시다아제 효소 단편 상보화(EFC)분석(도 2)35를이용한다. 이러한 실험의 경우, 관심 있는 단백질은 향상된 ProLabel 태그를 운반하는 N-또는 C 단말 융합 단백질로서 세포에서 발현된다(ePL, β 갈라토시다제의 42아미노산 단편). 세포는 384웰 PCR 호환 플레이트로 옮겨지고 관심 있는 화합물로 배양됩니다. 열사이클러는 열 안정성에 따라 온도가 증가함에 따라 단백질이 변성되고 집계되는 세포에 온도 그라데이션을 적용하는 데 사용됩니다. 관심 있는 단백질을 결합하고 안정화시키는 후보 화합물의 능력은 그 단백질의 열 안정성증가를 초래할 것이다. 따라서, 세포의 용액에 따라, 후보 화합물에 의해 안정화된 태그된 단백질은 차량 제어로 배양된 세포의 태그된 단백질보다 더 높은 온도에서 용액에 남아 있을 것이다. 리포터 효소 수용자(EA)는 용해성 ePL 태그 단백질을 보완할 수 있어 발광 기판을 사용하여 검출 가능한 β-갈라코시다제 활성을 생성한다.
최근 야생형 SHP2(SHP2-WT)에 대한 견고한 세포열 변속 분석과 소형 384웰 포맷36에서빈번한 SHP2 온코겐성 변종(SHP2-E76K)을 개발했다. 여기서, 우리는 안정적으로 세포에 있는 SHP2 억제제에 의한 표적 참여를 검출하고 억제제 힘 및 세포 열 이동 데이터 사이 상관관계의 높은 수준을 보여주는 이 분석의 상세한 프로토콜을 보고합니다. 일반적인 분석 워크플로우는 그림 3에나와 있습니다. 우리의 플랫폼은 N 단말 태그 전체 길이 ePL-SHP2 융합 단백질을 사용합니다. 해당 pICP-ePL-N-SHP2-WT 및 pICP-ePL-N-SHP2-E76K 발현 플라스미드의 생성을 위해, 최근 간행물36을참조하십시오. 이러한 분석은 열 그라데이션을 사용하여 SHP2 열 프로파일을 설정하고 억제제의 존재 또는 부재 시 SHP2 용융 온도를 결정할 수 있다. 열 프로파일이 확립되면, 그것은 또한 억제제 용량 반응 평가를 허용, 비등 조건하에서 수행 될 수있다. 두 가지 유형의 실험은 다음과 같습니다.

<table><tbody><tr><td>384 웰 구배 장착 열사이클러</td><td>에펜도르프 AG</td><td>X50시간</td><td></td></tr><tr><td>384웰 저부피 마이크로플레이트 에코 인증</td><td>벡맨 쿨터 주식회사</td><td>LP-0200</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>그레이너 바이오-원</td><td>657 160</td><td>뚜껑이 있는 멸균</td></tr><tr><td>항생제-항균제(항항제) 100 X</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>셀 카운터</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>백작부인 2세 FL</td><td></td></tr><tr><td>둘벡코의 변형 이글 미디엄 1X + 글루타맥스</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>10566-016</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>에코 어쿠스틱 액체 핸들러</td><td>벡맨 쿨터 주식회사</td><td>에코 550</td><td></td></tr><tr><td>전자 다중 채널 피펫</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>E1 클립팁</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>15630-680</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>InCell Pulse 스타터 키트</td><td>유로핀 디스커버X 코퍼레이션</td><td>94-4007</td><td>구성 요소로는 EA 버퍼, 용해 버퍼, 기판이 포함됩니다</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>테칸 트레이딩 AG</td><td>스파크</td><td></td></tr><tr><td>단일 채널 해협 통로</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>S253012005</td><td></td></tr><tr><td>피루베이트나트륨</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>11360-010</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>열 마이크로플레이트 실러</td><td>애질런트 테크놀로지스, Inc.</td><td>플레이트록</td><td></td></tr><tr><td>형질전환 시약</td><td>폴리플러스 트랜스펙션</td><td>제트프라임</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 시약</td><td>써모피셔 사이언티브</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec 384 실시간 PCR 플레이트</td><td>에펜도르프 AG</td><td>30132734</td><td></td></tr></tbody></table>

shp2(ptpn11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

PTPN11 프로토 온코진에 의해 인코딩된 Src-homology 2(SH2) 도메인 함유 인산체 2(SHP2)는 수용체 티로신 키나아제(RTK)구동 세포 신호의 핵심 중재자이며 세포 생존 및 증식을 촉진한다. 또한, SHP2는 B 및 T 세포 활성화를 저해하기 위해 면역 체크포인트 수용체에 의해 모집된다. Aberrant SHP2 기능은 많은 암의 발달, 진행 및 전이에 연루되었습니다. 실제로, 소분자 SHP2 억제제는 최근에 Ras/Raf/ERK 통로 활성화를 가진 고형 종양의 처리를 위한 임상 시험을 입력했습니다, 몇몇 종양성 Ras 돌연변이를 가진 종양을 포함하여. 그러나, SHP2 억제제의 현재 클래스는 백혈병에서 빈번히 발생하는 SHP2 온코겐이체에 대하여 효과적이지 않으며, 온코겐성 SHP2를 표적으로 하는 특정 소분자의 개발은 현재 연구의 대상이다. SHP2 와 같은 세포질 단백질을 관련시키는 대부분의 약 발견 캠페인의 일반적인 문제점은 화학 발견을 유도하는 1 차적인 약이 수시로 후보 화합물의 세포 표적 참여를 보고하지 않는 시험관 내 분석을 한다는 것입니다. 셀룰러 표적 참여측정 플랫폼을 제공하기 위해 야생형 및 돌연변이 SHP2 세포열 시프트 분석을 모두 개발했습니다. 이러한 소심은 세포내 SHP2 억제제의 표적 참여를 안정적으로 검출한다. 여기서 는 SHP2 억제제의 평가 및 특성화를 위한 귀중한 도구를 제공하는 이 분석법의 포괄적인 프로토콜을 제공합니다.

SHP2-WT용 열그라데이션 실험결과 접힌단백질(도 4A)에대해 전형적이고 일관된 좁은 용융 전이를 가진 시그로이드 세포열 프로파일이 생성되었다. SHP2는 두 개의 SH2 도메인과 촉매도메인(그림 1)의세 가지 독립적인 도메인으로 구성됩니다. 자동 억제 폐쇄 형태에서 이러한 도메인은 자체 연결; 열 프로파일 실험에서 관찰된 용융 전이는 아마도 셀에서 이 상태를 반영한 것으로 추정된다. 10μM에서 알로스테릭 억제제 SHP099를 가진 SHP2-WT의 배큐베이션은 SHP2-WT 열 프로파일을 중요하고 측정 가능한정도(도 4A)로안정화시켰다. 이는 SHP099와 같은 억제제의 알려진 결합 모드를 반영하여"분자 접착제"37로 작용하여 규제 결합 SH2 도메인과 촉매 하위 단위 사이의 이다. 중요한 것은, 우리의 세포 열 이동 분석은...

그대로 세포에서 후보 억제제에 의한 표적 참여를 평가하는 능력은 약물 발견에 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 야생 형 SHP2 또는 종양 발생 변이체를 대상으로 억제제의 셀룰러 표적 참여를 안정적으로 감지하는 384 개의 잘 포맷 셀룰러 열 이동 분석서를 설명합니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

티로신 포스파타제 SHP2는 세포 신호의 핵심 중재자로서 세포 생존과 증식을 촉진합니다. 우리 팀은 암 치료를 위한 소분자 SHP2 억제제를 찾는 데 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 기술은 세포 에 있는 소분자 SHP2 억제제의 표적 참여뿐만 아니라 세포 침투를 설치하는 신속하고 강력한 방법을 제공합니다.이것은 검색 리소스가 효율적으로 지시되도록 보장합니다. SHP2는 암 치료를 위한 매력적인 표적으로 합니다. 그리고 여러 SHP2 억제제는 임상 시험에 있습니다.향상된 효능 프로파일로 차세대 억제제의 발견을 용이하게 하는 당사의 기술. 절차에 입증셀레스트 로메로, 연구 조수와 더글러스 셰플러, 연구 조교수, 우리의 실험실에서. 플레이트에서 HEK293 T 세포를 분리하기 시작하려면 세포 분리 시약의 3 밀리리터를 사용한다.성장 매체의 12 밀리리터로 세포를 희석하고, 4 분 동안 1, 400 회 G에서 원심 분리로 수집합니다. 성장 매체의 10 밀리리터에서 세포 입맛을 다시 중단하고 trypan blue 및 셀 카운터로 세포의 농도 및 생존가능성을 측정합니다. 플레이트 700, 000 기하급수적으로 성장하는 세포는 6개의 우물로 각 우물로 들어가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 혈장 DNA의 2 마이크로그램을 200 마이크로리터의 형질 전환 완충제로 희석시킵니다. 플라즈마 DNA를 10초 동안 소용돌이시키고 4분 동안 1, 400배 G로 중앙분리합니다. 희석된 DNA에 4개의 미세입자 시약을 추가합니다.10 초 동안 소용돌이, 원심 분리를 반복합니다. DNA를 섭씨 23도에서 10분 동안 배양한 다음, 6개의 웰 플레이트에 부착된 HEK293 T 세포에 형질 전환 믹스를 추가하고 세포를 인큐베이터로 24시간 동안 반납한다. 분석 플레이트를 준비하려면 DMSO의 억제제 용액을 희석하여 10 밀리몰러의 재고 농도를 위해 즉시 사용하기 위해 384 개의 잘 낮은 죽은 볼륨 소스 플레이트로 분배하십시오.0.5% DMSO 미만의 최종 부피에서 384개의 실시간 PCR 플레이트로 액체 처리기를 사용하여 원하는 억제제 또는 차량을 반점한다. 불활성 가스 정화판 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 전감염된 세포를 준비하여 성장 매체를 미리 배양하고 섭씨 37도의 수조에서 분리 시약을 판매한다.인큐베이터에서 세포를 제거하고 우물에서 미디어를 부드럽게 흡인합니다. 각 웰에 세포 분리 시약의 0.3 밀리리터를 추가하고 플레이트 바닥을 철저히 덮기 위해 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 줍니다. 2분 동안 섭씨 23도에서 접시를 배양합니다.각 웰에 성장 매체의 1 밀리리터를 추가하고 우물에 세포를 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 세포를 수집하기 위해 4 분 동안 1 5 밀리리터 팔콘 원심 분리관 원심분리기 세포원심분리기로 이송합니다. 부드럽게 미디어를 흡인, 다음 성장 매체의 두 밀리리터에 세포 펠릿을 다시 중단.시도 팬 블루와 셀 카운터를 사용하여 셀 생존 능력이 90 % 이상인지 확인하십시오. 마이크로리터 당 125 세포의 농도로 세포를 희석하여 최적의 생존을 위해 2 시간 이상 현탁액에 세포를 유지합니다. SHP2 억제제로 배양을 위해 세포를 멸균 단일 채널 용액 트로프로 분배합니다.원심분리기는 이전에 준비된 384개의 실시간 PCR 플레이트를 5분 동안 2, 500회 G에서 한 다음 씰을 제거하고 125 마이크로리터 멀티 채널 파이펫을 사용하여 희석된 세포의 5마이크로리터를 원하는 웰즈에 첨가한다. 뚜껑없이 30 초 동안 42 시간 G에서 접시를 원심 분리 한 다음 뚜껑을 부착하고 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 1 시간 동안 접시를 배양합니다. 열 프로파일 그라데이션 또는 기타 실험에 대한 원고 방향에 따라 써모 사이클러를 프로그래밍합니다.열 사이클러 열 펄스 프로그램을 시작하고 열 블록에 분석 플레이트를 배치합니다. 프로그램이 완료되면 분석 판을 제거합니다. 허가 된 검출 마스터 믹스의 다섯 마이크로 리터와 분석 플레이트의 각 웰을 보충합니다.플레이트를 42회 G로 30초 간 30초 간 원심분리하고 어둠 속에서 섭씨 23도에서 30~60분 간 보관합니다. 최적화된 통합 시간으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 화학 발광을 측정합니다. 야생 형 SHP2용 열 그라데이션 실험은 접힌 단백질에 전형적인 좁은 용융 전이를 가진 시그로이드 세포 열 프로파일을 초래했습니다.알로스터 억제제 SHP099를 가진 야생형 SHP2의 배양은, 열 프로파일로 안정화되어 유의하고 측정 가능한 정도입니다. SHP2의 안정화, 또한 알로스터 화합물 처럼 SHP099의 효능으로 추적. 10 마이크로몰러에서 더 강력한 RMC-4550은 야생 형 SHP2에 대한 SHP099보다 더 높은 수준의 안정화를 생산했습니다.그들의 독특한 메커니즘으로 인해, 알로스터 억제제 와 같은 SHP099는 SHP2-E76K를 포함하여 많은 SHP2 온원성 돌연변이에 대해 덜 효과적이다. 이러한 알려진 특성과 일치하여 SHP099에 의한 SHP2-E76K의 한계 열 안정화만 관찰된다. EPL 태그 단백질의 발현 수준은 신호 강도에 극적으로 영향을 미칠 수 있다.일시적이고 안정적으로 통합된 야생 형 셀을 위한 열 프로파일. 동일한 자산 조건에 따라 표시됩니다. 이질적인 곡선의 정규화는 유사한 열 프로파일을 제공하므로 광범위한 EFC 감지 시스템을 드러냅니다.384 웰 플레이트의 짧은 축에서 열 그라데이션을 생성하는 열 사이클러 기능을 활용합니다. 일련의 이더스말 적정은 단일 플레이트에서 수행 될 수있다. 최적의 온도에서, 전체 10 점 용량 응답을 사용하여 이소성 적정, 유용한 EC50을 산출, RMC-4550에 대한.이 자산의 원리는 PROTAC 화합물에 의해 유도된 세포에 있는 단백질의 분해를 감시하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 우리는 돌연변이 SHP2와 백혈병의 억제제를 발견하기 위하여 세포 Thelma 교대 기술을 사용하고 있습니다, 빈번한 SHP2 종양원 돌연변이에 대하여 특정한 약은 이 암의 처리를 위한 중요한 충격이 있을 것입니다.

assessing-cellular-target-engagement-shp2-ptpn11-phosphatase

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오에서는 항 GFP 항체로 코팅된 비드를 사용하여 GFP 태그가 지정된 야생형 및 돌연변이 PD-1 단백질의 공동 면역침전을 수행하는 기술을 보여줍니다. bead-bound PD-1-GFP 단백질은 PD-1과 상호 작용하는 SHP2 단백질과 함께 배양되어 SHP2 상호 작용에서 중요한 역할을 하는 PD-1의 특정 구조 모티프를 식별할 수 있습니다.

형질주입된 세포에서 효소 수용체 상호작용을 연구하기 위한 면역침전 분석

여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

이 프로토콜은 rapamycin-regulated phosphatase의 설계, 생성 및 적용을 설명합니다. 이 방법은 살아있는 세포에서 인산가수분해효소 활성화에 대한 높은 특이성과 엄격한 시간적 제어를 제공합니다.

Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatase의 개발 및 응용

RASopathies는 RAS-MAPK 경로 과활성화에 의해 발생하는 다계통 유전 증후군입니다. 검증을 기다리는 잠재적인 병원성 변이가 지속적으로 나타나고 있으며, 전임상 근거가 부족하여 치료가 제한됩니다. 여기에서는 Teen-reporter 제브라피시의 라이브 FRET 이미징에 의한 배아 발생 중 RASopathy 관련 ERK 활성화 수준과 약리학적 조절을 테스트하고 교차 검증하기 위한 생체 내 프로토콜에 대해 설명합니다.

Live FRET 현미경 검사 및 면역형광을 통해 초기 제브라피시 누난 증후군 모델에서 ERK 활동 조절을 평가하기 위한 효율적인 프로토콜

여기에서는 효소 변형 분석을 위해 효모 표면 표시 기질을 사용하기 위한 프로토콜을 소개합니다. 이 플랫폼은 대표적인 효소 변형 분석법으로 기질 중 하나에 대한 티로신 인산가수분해효소 SHP-2의 탈인산화 활성 분석을 사용하여 시연되었습니다.

효모 표면에 표시된 단백질의 Enzymatic modification and flow cytometry assessment (효소 변형 및 유세포 분석 평가)

이 프로토콜은 복구 하 고 비 대상 배경 셀 혼합물에서 희소 한 대상 셀 단일 세포 수준에서 분자 유전 특성에 대 한 준비입니다. DNA 품질은 단일 세포 치료 비 고 (두 심사 기반 및 분석 대상) 단일 셀 응용 프로그램 허용 합니다.

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

배우세요 384웰 형식의 세포 열 이동 분석법을 사용하여 SHP2 억제제의 세포 내 표적 참여를 평가하는 방법을. 암 치료를 위한 효과적인 소분자 억제제 발견에 필수적인 기술입니다.

SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

더 많은 동영상 탐색