SHP2(PTPN11) 포스파타제 억제제에 의한 세포 표적 참여 평가

티로신 포스파타제 SHP2는 세포 신호의 핵심 중재자로서 세포 생존과 증식을 촉진합니다. 우리 팀은 암 치료를 위한 소분자 SHP2 억제제를 찾는 데 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 기술은 세포 에 있는 소분자 SHP2 억제제의 표적 참여뿐만 아니라 세포 침투를 설치하는 신속하고 강력한 방법을 제공합니다.

이것은 검색 리소스가 효율적으로 지시되도록 보장합니다. SHP2는 암 치료를 위한 매력적인 표적으로 합니다. 그리고 여러 SHP2 억제제는 임상 시험에 있습니다.

향상된 효능 프로파일로 차세대 억제제의 발견을 용이하게 하는 당사의 기술. 절차에 입증셀레스트 로메로, 연구 조수와 더글러스 셰플러, 연구 조교수, 우리의 실험실에서. 플레이트에서 HEK293 T 세포를 분리하기 시작하려면 세포 분리 시약의 3 밀리리터를 사용한다.

성장 매체의 12 밀리리터로 세포를 희석하고, 4 분 동안 1, 400 회 G에서 원심 분리로 수집합니다. 성장 매체의 10 밀리리터에서 세포 입맛을 다시 중단하고 trypan blue 및 셀 카운터로 세포의 농도 및 생존가능성을 측정합니다. 플레이트 700, 000 기하급수적으로 성장하는 세포는 6개의 우물로 각 우물로 들어가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 혈장 DNA의 2 마이크로그램을 200 마이크로리터의 형질 전환 완충제로 희석시킵니다. 플라즈마 DNA를 10초 동안 소용돌이시키고 4분 동안 1, 400배 G로 중앙분리합니다. 희석된 DNA에 4개의 미세입자 시약을 추가합니다.

10 초 동안 소용돌이, 원심 분리를 반복합니다. DNA를 섭씨 23도에서 10분 동안 배양한 다음, 6개의 웰 플레이트에 부착된 HEK293 T 세포에 형질 전환 믹스를 추가하고 세포를 인큐베이터로 24시간 동안 반납한다. 분석 플레이트를 준비하려면 DMSO의 억제제 용액을 희석하여 10 밀리몰러의 재고 농도를 위해 즉시 사용하기 위해 384 개의 잘 낮은 죽은 볼륨 소스 플레이트로 분배하십시오.

0.5% DMSO 미만의 최종 부피에서 384개의 실시간 PCR 플레이트로 액체 처리기를 사용하여 원하는 억제제 또는 차량을 반점한다. 불활성 가스 정화판 실러를 사용하여 플레이트를 밀봉합니다. 전감염된 세포를 준비하여 성장 매체를 미리 배양하고 섭씨 37도의 수조에서 분리 시약을 판매한다.

인큐베이터에서 세포를 제거하고 우물에서 미디어를 부드럽게 흡인합니다. 각 웰에 세포 분리 시약의 0.3 밀리리터를 추가하고 플레이트 바닥을 철저히 덮기 위해 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 줍니다. 2분 동안 섭씨 23도에서 접시를 배양합니다.

각 웰에 성장 매체의 1 밀리리터를 추가하고 우물에 세포를 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 세포를 수집하기 위해 4 분 동안 1 5 밀리리터 팔콘 원심 분리관 원심분리기 세포원심분리기로 이송합니다. 부드럽게 미디어를 흡인, 다음 성장 매체의 두 밀리리터에 세포 펠릿을 다시 중단.

시도 팬 블루와 셀 카운터를 사용하여 셀 생존 능력이 90 % 이상인지 확인하십시오. 마이크로리터 당 125 세포의 농도로 세포를 희석하여 최적의 생존을 위해 2 시간 이상 현탁액에 세포를 유지합니다. SHP2 억제제로 배양을 위해 세포를 멸균 단일 채널 용액 트로프로 분배합니다.

원심분리기는 이전에 준비된 384개의 실시간 PCR 플레이트를 5분 동안 2, 500회 G에서 한 다음 씰을 제거하고 125 마이크로리터 멀티 채널 파이펫을 사용하여 희석된 세포의 5마이크로리터를 원하는 웰즈에 첨가한다. 뚜껑없이 30 초 동안 42 시간 G에서 접시를 원심 분리 한 다음 뚜껑을 부착하고 섭씨 37도및 이산화탄소 5 %에서 1 시간 동안 접시를 배양합니다. 열 프로파일 그라데이션 또는 기타 실험에 대한 원고 방향에 따라 써모 사이클러를 프로그래밍합니다.

열 사이클러 열 펄스 프로그램을 시작하고 열 블록에 분석 플레이트를 배치합니다. 프로그램이 완료되면 분석 판을 제거합니다. 허가 된 검출 마스터 믹스의 다섯 마이크로 리터와 분석 플레이트의 각 웰을 보충합니다.

플레이트를 42회 G로 30초 간 30초 간 원심분리하고 어둠 속에서 섭씨 23도에서 30~60분 간 보관합니다. 최적화된 통합 시간으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 화학 발광을 측정합니다. 야생 형 SHP2용 열 그라데이션 실험은 접힌 단백질에 전형적인 좁은 용융 전이를 가진 시그로이드 세포 열 프로파일을 초래했습니다.

알로스터 억제제 SHP099를 가진 야생형 SHP2의 배양은, 열 프로파일로 안정화되어 유의하고 측정 가능한 정도입니다. SHP2의 안정화, 또한 알로스터 화합물 처럼 SHP099의 효능으로 추적. 10 마이크로몰러에서 더 강력한 RMC-4550은 야생 형 SHP2에 대한 SHP099보다 더 높은 수준의 안정화를 생산했습니다.

그들의 독특한 메커니즘으로 인해, 알로스터 억제제 와 같은 SHP099는 SHP2-E76K를 포함하여 많은 SHP2 온원성 돌연변이에 대해 덜 효과적이다. 이러한 알려진 특성과 일치하여 SHP099에 의한 SHP2-E76K의 한계 열 안정화만 관찰된다. EPL 태그 단백질의 발현 수준은 신호 강도에 극적으로 영향을 미칠 수 있다.

일시적이고 안정적으로 통합된 야생 형 셀을 위한 열 프로파일. 동일한 자산 조건에 따라 표시됩니다. 이질적인 곡선의 정규화는 유사한 열 프로파일을 제공하므로 광범위한 EFC 감지 시스템을 드러냅니다.

384 웰 플레이트의 짧은 축에서 열 그라데이션을 생성하는 열 사이클러 기능을 활용합니다. 일련의 이더스말 적정은 단일 플레이트에서 수행 될 수있다. 최적의 온도에서, 전체 10 점 용량 응답을 사용하여 이소성 적정, 유용한 EC50을 산출, RMC-4550에 대한.

이 자산의 원리는 PROTAC 화합물에 의해 유도된 세포에 있는 단백질의 분해를 감시하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 우리는 돌연변이 SHP2와 백혈병의 억제제를 발견하기 위하여 세포 Thelma 교대 기술을 사용하고 있습니다, 빈번한 SHP2 종양원 돌연변이에 대하여 특정한 약은 이 암의 처리를 위한 중요한 충격이 있을 것입니다.