Name: 액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 학습하세요 액체 상 전자 현미경을 위한 포유류 세포의 그래핀 인클로저 기법. HER2 수용체 표지와 그래핀 코팅을 통해 암 세포 막 단백질을 태양 환경에서 고해상도로 관찰하는 방법을 익히세요.

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우리는 세포 배양 프로토콜에 도움을 D. B. Peckys, 원고를 검토 F. Weinberg, 실험및 수치에 도움을 준 T. Trampert, 수치에 도움을 준 S. S. Smolka, INM을 통해 그의 지원에 대한 E. Arzt에게 감사드립니다. 이 연구는 엘스 크뢰너-프레세니우스-스티프퉁에 의해 지원됩니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

단백질 기능을 더 잘 이해하려면 그대로 세포의 혈장 막에서 단백질 위치에 대한 정보를 얻는 것이 중요합니다. 이 정보를 얻기 위한 방법은 초해상도 형광 현미경 검사법1,,2를포함한다. 초해상도 현미경 검사는 지난 몇 년 동안 더 개발되었지만, 그것의 해상도는 여전히 세포 실험의 실제적인 조건에 대 한 약 20 nm에 국한, 전형적인 수용 체 단백질의 범위에 크기 는 1-10 nm. 단백질을 시각화하기에 충분한 해상도를 가진 단 하나 세포 및 단 하나 분자 수준에 단백질의 화상 진찰은 EM을 통해 가능합니다. 그러나 절개로 인해, 종래의 EM 방법은 전형적으로 세포를그대로두지 않으며, 이는 플라즈마 멤브레인에서 단백질의 문맥과 공간 분포에 대한 중요한 정보의 손실로 이어집니다. 저온-TEM을 갖는 전체 세포에 대한 방법은6,단백질 라벨링을 저온-EM(27)과 결합하는 것이 가능하며, 또한 저온-STEM이28개입증되었다.27 그러나, 극저온-EM 워크플로우는 세포 초구조 및 단백질 구조를 연구하는 데 최적화되며 멤브레인 단백질 공간 분포를 분석하는 데 는 그리 많지 않습니다. 임계점 건조는 또 다른 전체 세포 준비 방법이지만 샘플은 여러 건조 단계를 거치며, 기술은 매우 시간이 많이 소요되는29. 막 단백질은 또한 동결 골절7을통해 검사되었습니다. 이 방법에서는 세포가 고정, 동결 및 골절됩니다. 골절된 부품은 탄소 및 백금 층에 의해 복제되고 생물학적 시료가 제거됩니다. 그런 다음 복제본을 EM30으로분석할 수 있습니다. 전체 세포 분석은 전체 세포의 문맥 내의 막에 단백질의 분포에 대한 정보가 손실되어 동결 분획으로 불가능합니다.
여기에 제시된 방법은견본9,,31를얇게 슬라이스할 필요 없이 세포막을 연구할 수 있게 한다. 세포는 막 단백질의 국소화가 EM 심상과 상관되는 형광 심상에서 볼 수 있도록 그대로 유지됩니다. 수화 상태의 그대로 세포 내의 단일 세포 및 단일 분자 수준에서 단백질을 연구하는 것은 이 그래핀 인클로저 방법을 사용하여 QD 표지 단백질의 STEM을 사용하여 2nm의 해상도로 가능하다는 것을 보여주었다9. 그들의 네이티브 상태에 있는 세포를 지키는 것은 단백질 기능을 이해하는 데 중요한 단 하나 세포 및 단 하나 분자 수준에서 분석이 가능하다는 것을 막 단백질의 공간 분포를 보존하고, 치료 접근을 위한 새로운 약을 개발하는 것을 중요합니다.
EM을 가진 화상 진찰 생물학 견본의 또 다른 중요한 양상은 전자 광선에 기인한 견본의 방사선 손상입니다. 용액은 종종 탄소32의얇은 층 사이의 시편을 캡슐화하는 것과 같은 가능한 한 전자 용량또는 다양한 코팅 방법의 감소를 포함한다. 우리의 방법은 그래핀 코팅이 비 코팅 된 샘플을 위해 세포 표면에 나타나는 빔 유도 아티팩트를 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 화학적으로 고정된 그래핀 코팅 된 생물학적 샘플의 검사는 200 케브 빔 에너지에서 D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2에서 전자 빔 조사하에서 가능한 밝은 반점과 같은 방사선 손상없이 샘플에 나타나는. 정교한 시료 제제, 예를 들어 염색, 임베딩, (극저온)단면, 골절 등을 포함하는 다른 EM 방법에 비해, 여기에 설명된 방법은 시간이 덜 소요된다. 단백질의 라벨링은 몇 시간 이내에 수행되며 그래 핀 코팅은 숙련 된 연구자에게 약 15 분밖에 필요하지 않습니다. 샘플 준비는 형광 현미경 검사법에 필요한 절차와 유사합니다.
프로토콜은 일부 단계에서 수정할 수 있습니다. 마이크로칩의 그래핀은 필터 용지로 블랜트할 때 그래핀이 움직이지 않도록 공기 건조될 수도 있습니다. 그래핀이 소금으로 오염되면 소금을 녹여 오염을 최소화하기 위해 약 1 시간 동안 수면에 떠있는 것이 가능합니다. 그래핀상 구리 또는 PMMA 오염발생은 프로토콜의 해당 에칭 단계를 확장함으로써 감소될 수 있다. 다른 그래핀 코팅 방법은 예를 들어, 그래핀-PMMA가 세포에 직접 증착되고, PMMA는 그 후3333아세톤에서 세척하여 제거된 곳을 설명하였다. 우리의 방법에서, PMMA는 추가 아세톤 세척 단계로 인한 세포에 가능한 손상을 방지하기 위해 코팅하기 전에 제거되었다. NaCl은 평평한 기판으로 선택되었기 때문에 그래 핀을 주름시키지 않고 물에 용해하여 그래핀9를방출한다. 게다가, 원하는 크기로 절단 할 수 있으며 기판 잔류물은 그래 핀에 남아 있지 않습니다. 그러나 이러한 기준을 고려하여 염화칼륨과 같은 다른 기질도 사용할 수 있습니다.
잠재적인 라벨 유도 클러스터링 가능성을 줄이기 위해 GA 고정 단계는 FA 고정 후 직접 구현될 수 있으며, 그 후 모든 멤브레인 단백질이 고정됩니다. FA를 사용한 첫 번째 고정 단계는 이미 생물학적 구조를 고치지만 멤브레인 단백질 확산의 감소된 수준은 여전히34개,QD당 다중 스트렙타비딘의 존재로 인해 라벨 유도 클러스터링으로 이어질 수 있다. GA를 사용하여 고정하면 LM 동안 자동 형광 신호로 이어질 수 있으며, 따라서, 설명된 프로토콜에서 LM 후에 수행되지만 다른 곳에서 설명된 바와 같이 감소될 수 있다34. 캐코디레이트 버퍼는 매우 독성이 있으며, 다른 고정제도 사용할 수 있지만, EM 프로토콜에 일반적으로 사용되는 버퍼이기 때문에 여기에 cacodylate가 사용되고, 침전을 방지하고, 세균및 곰팡이의 성장을 방지하며, 지질막(35)의초구조적 무결성을 보존하는 데 필요한 칼슘 이온과 호환된다. 필요한 경우, 오스뮴 테트옥사이드는 지질 안정화를 위한 추가 고정으로 사용될 수 있다. 이것은 세포 구조의 대비를 향상시키는 것을 도울 것입니다, 그러나 또한 시스템에 또 다른 금속을 추가하고 QD에 얻은 대비를 감소시키는 것을 도울 것입니다.
여기에 설명된 프로토콜에는 좋은 명령이 필요한 많은 단계가 포함되어 있습니다. 마이크로칩의 SiN 표면을 긁지 않도록 하고 파손을 방지하기 위해 마이크로칩을 취급하기 전에 일부 교육이 필요합니다. 앞서 언급했듯이 SiN 창이 때때로 끊어질 수 있으므로 마이크로칩을 중복으로 준비하는 것이 좋습니다. 마이크로칩에서 필요한 수의 세포를 얻으려면 약간의 경험이 필요합니다. 그래 핀으로 세포를 코팅하는 것은 물에 그래 핀을 부동 오른쪽 기울기 각도를 찾기 어려울 수 있기 때문에 약간의 훈련이 필요합니다. 물에서 그래 핀을 잡을 때, 얇은 그래 핀을 보기 어려울 수도 있습니다. 그래핀이 마이크로칩에 있는 즉시 필터 용지로 과도한 물을 제거해야 합니다. 이것은 마이크로 칩에서 그래 핀을 제거하지 않도록 필터 용지의 끝만 수행해야합니다.
그래핀 코팅은 샘플에 아티팩트가 나타나는 것을 방지했습니다. 그러나 D < 4 x 102 e-/Å2의 경우 코팅되지 않은 샘플에 대한 아티팩트가 나타나지 않았으며 2 개의 코팅되지 않은 샘플에 대해서만 아티팩트가 나타났습니다. 따라서, 코팅되지 않은 세포의 검사는 그래 핀을 사용하고 유물 형성의 위험을 피하는 것이 더 좋을지라도 가능한 것처럼 보입니다. 이러한 유물의 구성은 미래에 분석하여 형성을 방지하는 방법에 대한 힌트를 줄 수 있습니다. 세포의 구조적 안정성에 관해서는 그래 핀 코팅의 사소한 개선만 관찰되었다. 고정 된 세포는 분명히 그들의 구조가 SiN 막의 근접에 있던 검사 된 얇은 영역에서 안정화되었다. 그러나 여기서 검사하지 않은 것은 진공4에노출되었을 때 세포 시료에 발생하는 것으로 알려진 유물을 건조시키는 것입니다. 세포의 건조는 또한 QD 거리가 결과로 변경될 수 있도록 세포의 수축으로 이끌어 낼 것입니다. 여기에 사용되는 전자 용량의 경우 그래핀 코팅 및 비 코팅 시료의 QD의 거리는 안정적으로 유지되었습니다. EM용 세포에 대한 그래핀 코팅의 효과를 검사하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
이 방법의 한 가지 제한은 세포의 화학적 고정이 필요하다는 것입니다. 따라서 라이브 셀 실험을 수행할 수 없습니다. 그러나 라벨링이 필요하지 않고 구조 안정성이 높은 세포가 사용되는 경우, 예를 들어 박테리아, 고정되지 않은 세포는 다른 전자 투여량 허용 오차이기는 하지만 EM36에 대한 그래핀에 동봉될 수 있다. 또한 단백질은 직접 감지할 수 없으므로 단백질을 시각화하려면 QD가 필요합니다. 이 메서드는 작은 레이블의 이점을 누릴 수 있습니다. 초구조가 명확하게 보이지 않는 것이 좋든 나쁘든 간에 토론의 포인트입니다. 우리의 방법은 선택된 단백질만 볼 수 있는 형광 현미경 검사법의 것과 유사합니다37. 울트라 구조의 가시성을 높이면 이미지에 훨씬 더 많은 정보가 추가되고 어떤 시점에서 개별 레이블 위치를 감지하지 못하게 됩니다. 더욱이, 여기서 설명된 방법은 하나의 단백질 종을 위한 것이며, 여러 단백질에 라벨을 붙일 수 있도록 프로토콜의 추가가 필요하다. 마지막으로, 항체모방(21) 또는nanobody(38)와 같은 작은 친화성이 특이히 결합분자가 가능할 때 작용한다. 일반적으로 사용되는 항체는 훨씬 더 크고 올리고머로 단백질 하위 단위의 기능적 상태의 검출을 방지할 수 있습니다.
우리의 방법은 수화 상태에서 세포를 유지하면서 EM을 사용하여 전체 세포에 단백질 기능을 연구하는 데 유용합니다. 일련의 세포를 검사하는 것이 쉽게 가능합니다. 세포와 단백질의 그밖 모형은 또한 공부할 수 있습니다. 단백질 라벨링이 필요하지 않은 경우, 프로토콜의 하위 집합은 다양한 생물학적 표본의 그래핀 코팅에 사용될 수 있다. 전체 세포를 연구하는 능력은 분자 수준에서 막 단백질 기능의 상관 관계를 이해하기 위한 세포 연구에서 관련이 있습니다.

막 단백질 기능의 분석은 세포 생물학 연구 및 약물 개발에 필수적입니다. 중요한 실험의 클래스는 세포에 있는 막 단백질 위치의 검사를 관련시킵니다. 이 정보는 동적 조립 및 분해를 통해 다양한 세포 기능을 구동하는 단백질 복합체 및 플라즈마 막의 특정 위치에 있는 단백질 의 조립에 대한 결론을 추론하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 기술 중, 가벼운 현미경 검사법 (LM) 및 전자 현미경 검사법 (EM) 세포에서 단백질 기능을 공부하기 위해 사용 됩니다. LM은 액체에 있는 전체 세포의 분석을 허용합니다; 그러나, 해상도는 실용조건1,2하에서 초분해능 형광 현미경검사용 종래의 경우 200-300nm, 최대 20nm로 제한된다.,2 EM은 약 1Å 해상도3을제공하지만, 종래의 시료 제제는 탈수, 금속 염색을 필요로 하며, 수지와 같은 마운팅 물질에 포함시켜 전염 전자 현미경(TEM)4. 보다 원소적인 환경에서 생물학적 샘플을 보존하기 위해 cryo-EM 기술을5,,6로사용할 수 있다. 샘플은 비정질 얼음으로 빠르게 고정되고 필요한 경우 단면이 지정됩니다. 또 다른 옵션은 동결 골절 EM7입니다.
그들의 네이티브, 액체 상태에서 온전한 세포 내의 막 단백질을 연구하기 위한 EM 기술은 지난 10년 동안8,,9,,10,,11에서나타났다. 2nm의 공간 분해능은 SiN 멤브레인에서 재배되고 그래핀9층으로동봉된 전체 세포에서 양자점(QD) 표지막 단백질에 대해 달성되었다.
여기서, 단백질 라벨링 및 그래핀 코팅을 위한 프로토콜의 세부 사항은9,,12가 설명된다. 이 프로토콜의 목표는 수화 상태에서 세포를 보존하면서 전체 고정 세포의 막에서 HER2의 공간 분포를 분석하는 것입니다. 그래핀코팅은 진공 상태에서 세포의 건조를 방지하고, 또한 방사선손상(13)을감소시킨다. 이 방법은 손상되지 않은 혈장 막 내의 표지된 막 단백질에 대한 정보를 제공하지만, 이 방법은 일반적으로 EM과 같이 세포 초구조를 연구하는 데 유용하지 않다.
그래핀은 알려진 가장 얇은 나노 물질이며, 벌집격자(14)에배치된 단일 탄소 원자 두꺼운 결정시트로 구성된다. 높은 유연성과 기계적 강도를 포함한 독특한 특성을 가지고 있습니다. 최근 연구에 따르면 결함이 없는 그래핀은 가스및 액체에 침투할 수 없지만 결함으로 수소투과(15)를허용합니다. 이 누설은 여기에서 사용되는 다층 그래핀을 사용하여 줄일 수 있습니다. 이중층 그래핀은 최근 저온-EM 샘플에 대한 지원으로서 유용함을 나타내며, 균일하지 않은 층만 형성될 수 있는 그래핀 옥사이드에 비해 얇은 얼음층의 균질성을 향상시키는 것으로나타났다. 그래핀은 또한 액체상 투과 전자 현미경 검사법13,,17동안 생물학적 시료의 빔 손상을 감소시키는 것으로 나타났다. 예시적인 실험으로서, 포유류 유방암 세포주 SKBR3에서 발현된 HER2는 STEM을 사용하여 기록된 QDs18 및 공간 분포로 표지되었다. 세포는 전자 투명 SiN멤브레인(19)을가진 Si 마이크로칩에 시드되었다. 마이크로칩은 LM 및 EM과 견고하고 호환되며 전체 라벨링 프로시저가마이크로칩(19)에서직접 수행될 수 있기 때문에 지원으로 선택되었다. 셀 부착 후 HER2는 2단계 라벨링프로토콜(20)으로레이블을 지정했습니다. 먼저, 생체화 된 항 HER2 항체 미메틱화합물(21)이 HER2에 부착되었다. 세포는 그 때 표지 유도 수용체 군집을 방지하기 위하여 화학적으로 고정되고, 세포 초구조의 안정성을 증가시키기 위하여. 연쇄상 비딘 코팅 QDs는 이후 HER2 항체 모방 복합체에 연결되었다. 밝은 형광 신호와 QD의 전자 조밀 코어는 상관 접대 형광 및 전자 현미경 검사법 (CLEM)20을허용했다. CLEM은 STEM 분석에 대한 관심있는 세포 영역이 세포상에서 HER2의 국소화를 강조하는 개요 형광 현미경 이미지로부터 선택할 수 있기 때문에 특히 유용합니다. 세포는 높은 HER2 수준을 가진 세포 영역을 확인하기 위하여 형광 현미경 검사법에 의해 분석되었습니다. 그 후, 3-5층 두께의 그래핀 시트를코팅9,,22용세포로 이송하였다. 이어서, 시료는 EM 시편 홀더에 장착되었다. STEM 데이터는 환상 암장(ADF) 검출기를 사용하여 획득되었으며, 세포 표면 위치에 비해 전지 표면에 HER2의 공간 분포에 대한 정보를 제공하지만 셀의 초구조에 대한 정보는 제공하지 않았다. 전자빔 조사 하에서 시료의 안정성을 결정하기 위해, 시료는 이미지D시리즈에서 증가용량(D)에서 검사되었다. 그래핀 코팅 및 비 코팅 샘플의 차이를 조사하였다. 여러 종류의 방사선 손상을 평가하였다.
여기서 설명한 프로토콜은 HER2 과발현 포유류 유방암 세포주 SKBR3를 HER223을표적으로 하는 모델 시스템으로 사용한다. 프로토콜은 하나의 그래 핀 코팅 샘플의 준비를 포함, 하나의 유사한 샘플하지만 비교를위한 그래 핀 코팅없이. 실험은 SiN 창이 매번 끊어질 수 있고 대부분의 경우에 실험 복제본을 얻을 수 있기 때문에 중복으로 제조된다. 이 방법의 전체 수율은 그래핀 으로 덮인 세포를 가진 마이크로칩이 모든 경우에 전체 SiN 창이 그래핀으로 덮여 있을 수 있더라도 일반적으로 예외적인 오류로 얻어진다는 것을 의미합니다. 중복 복제는 프로토콜에 설명되지 않습니다.
라벨링 프로토콜(steps 1-5)은이전에발표된 COS7 섬유아세포 세포에서 표피 성장 인자 수용체의 라벨링 프로토콜과 비교된다. 해당 용지의 세부 사항은 마이크로칩의 취급 및 웰 플레이트의 사용에 대해 언급됩니다. 다음 프로토콜은 HER2, 그래핀 코팅9에라벨을 부착하고 시료의 방사선 내성을 검사하는 데 최적화되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HPLC용 아세톤(최소 99.8 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>2626-1L</td><td></td></tr><tr><td>AL54 분석 저울</td><td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany</td><td>30029077</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraction V, biotin-free, &ge; 98 %, for molecular</td><td>biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 &micro; M</td><td>Affibody, Solna, Sweden</td><td>10.0817.02.0001</td><td></td></tr><tr><td>원자 분해능 분석 현미경 JEM-ARM200F</td><td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric</td><td>Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylic acid sodium salt trihydrate &ge; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>5169.1</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크, PS, 처리, 멸균, 필터 스크류 캡 50ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, 독일</td><td>7696781</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플라스크, PS, 처리, 멸균, 필터 스크류 캡 250ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, 독일</td><td>7696782</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 멀티웰 플레이트, 처리, 24-웰</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, 독일</td><td>7696792</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell plates, treated , 96-well</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696794</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 원심분리기 튜브 15 ml sterile</td><td>Greiner Bio-One GmbH, 프리켄하우젠, 독일</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CELLview 세포 배양 접시, PS, 35/10mm, 유리 바닥, 1 구획</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>627861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, 독일</td><td>5401000010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes 50 ml sterile</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellStripper 비효소 세포 해리 솔루션</td><td>Corning, NY, USA</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>9286.1</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>PK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Easypet</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td></td><td></td>4430000018</tr><tr><td>Eppendorf Research plus 피펫 가변, 0.1 - 2.5 &마이크로; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, 독일</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 &micro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, 독일</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 피펫 가변, 10 - 100 &마이크로; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 &micro; l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, 독일</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>HPLC용 에탄올 절대 (최소 99.9 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>2222-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>F8141</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 Leica DMI6000</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), High glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>10099141</td><td>로트 번호:</td></tr><tr><td>1751893 Gibco Goat Serum, New Zealand origin</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>16210064</td><td>로트 번호: 1788320</td></tr><tr><td>Gibco Phosphate buffered Saline (PBS), pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 48R CO2 인큐베이터</td><td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>CO48310001</td><td></td></tr><tr><td>Gatan Model 950 Solarus&mdash; 플라즈마 클리너</td><td>Gatan GmbH, M&uuml; nchen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액 Grade I, H2O 25%, 전자 현미경 고정제로 사용하기 위해 특별히 정제</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine &ge; 98.5 % Ph.Eur., USP, BP</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>도립 실험실 현미경 Leica DM IL LED Leica</td><td>Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td>Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany</td><td>MR 3002</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential Aminoacids (NEAA) 100x W/O L-Glutamine</td><td>Biowest, Nuaill&eacute;, France</td><td>X0557-100</td><td></td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드 76 mm x 26 mm</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 튜브(1.5 ml, 2 ml) 비멸균</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752</td><td></td></tr><tr><td>MSc-Advantage&mdash; 클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ocean Microchips SiN window 400x150 &micro; m, 200 nm 스페이서</td><td>DENSsolutions, 델프트, 네덜란드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omnifix 일회용 주사기 Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml)</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>10 mL: C542.1 20 ml: T550.1</td><td>purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany</td><td>VO 200</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR, Darmstadt, Germany</td><td>#291-0057</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 16% 용액, EM 등급</td><td>전자 현미경 과학, Hatfield, PA, 미국</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Perfekt-Kescher with</td><td>handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany</td><td>T5112</td><td></td></tr><tr><td>랙에 에어로졸 장벽이 있는 피펫 팁, 비멸균</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>2-200&micro; l:</td> 랙에 에어로졸 장벽이 있는 7695892 <td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 멸균</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>0.1-10 &micro; L : 7695880 2-100 &마이크로; L : 7695883 100-1000 &마이크로; L : 7695886 1250 &마이크로; l XL: 7695887</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 0.01% 용액 mol. WT.70.000 - 150.000</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 &micro; M</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>면도날, 보석 코팅되지 않은 3면, 스틸 백, 탈지</td><td>페르소나, AccuTec 블레이드, 베로나, 버지니아, 미국</td><td>94-0451</td><td></td></tr><tr><td>원형 여과지, 재없음, 등급 589/3 블루 리본, 직경 150mm</td><td>Schleicher & Schuell, Dassel, 독일</td><td>300212</td><td></td></tr><tr><td>일상 입체 현미경 Leica M60</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany</td><td>M60</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 ROTILABO 피펫, 멸균 (1 ml, 2 ml, 10 ml)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1</td><td></td></tr><tr><td>혈청학적 피펫, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, 독일</td><td>1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 멸균, (5 ml, 25 ml, 50 ml)</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany</td><td>5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555</td><td></td></tr><tr><td>진탕 SW22</td><td>Julabo GmbH, Seelbach, Germany</td><td>9550322</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>HN00.1</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 결정, 절단 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm</td><td>International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA</td><td>9750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate decahydrate, ACS 시약, &ge; 99.5 %</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium persulfate</td><td>carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>4365.2</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 ROTILABO PES, sterile 0.22 &micro; m</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>P668.1</td><td></td></tr><tr><td>Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm</td><td>ACS material, Pasadena, CA, USA</td><td>TTG30011</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 Dumoxel 03</td><td>Manufactures D' Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td><td>0103-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>핀셋 Inox 02 Manufactures</td><td>D' Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland</td><td>0102-7-PO</td><td></td></tr><tr><td>핀셋, 플라스틱 교체 가능한 팁</td><td>Ideal-tek SA, Balerna, 스위스</td><td>5SVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>물 ROTISOLV HPLC 그라디언트 등급</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany</td><td>A511.2</td><td></td></tr></tbody></table>

액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

프로토콜은 스캐닝 전송 전자 현미경 검사(STEM)를 사용하여 유방암 세포의 손상되지 않은 혈장 막에서 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)를 조사하기 위해 설명된다. 포유류 유방암 세포주 SKBR3의 세포는 실리콘 진타(SiN) 창이 있는 실리콘 마이크로칩에서 재배되었다. 세포는 화학적으로 고정되었고, HER2 단백질은 2단계 비오틴-스트렙타비딘 결합 프로토콜을 사용하여 양자점 나노입자(QDs)로 표지되었다. 세포는 수화 상태를 유지하고 STEM 중 전자 빔 손상으로부터 보호하기 위해 다층 그래핀으로 코팅되었습니다. 전자 빔 조사 하에 샘플의 안정성을 검사하기 위해, 투여 량 시리즈 실험이 수행되었다. 그래핀 코팅 및 비 코팅 샘플을 비교하였다. 빔 유도 손상, 밝은 유물의 형태로, 증가 전자 용량 D에서일부 비 코팅 샘플에 등장, 코팅 된 샘플에 어떤 유물이 나타나지 않는 동안.

도 1A는 창이 덮여 있는 방식으로 시드된 세포를 나타내지만, 이를 평평하게 하고 부착할 수 있는 충분한 공간이 있어 약2/3rd(그림 1B)의합류로 이어진다. 마이크로칩(도1C)에너무 많은 세포가 시드되는 경우, 모든 세포가 마이크로칩을 부착할 공간이 부족하다. 도 1D는 24h 이후와 동일한 마이크로칩을 나타낸다. 세포의 절반 이상이 평평해지지 않았습니다. 한편, 셀이 너무 적으면(도 1E),SiN 창은 도 1F에서볼 수 있듯이 24h 후 큰 빈 공간으로 끝납니다. 도 1G는 도 1A 및 도 1B에서세포의 DIC 이미지를 나타낸다. 도 1H는 HER2의 성공적인 라벨링을 나타내는 노란색으로 표시된 해당 형광 이미지 의 거짓을 나타낸다.
대표적인 STEM 데이터는 도 4에도시되어 있다. 그래핀 코팅(왼쪽 컬럼) 및 비코팅(오른쪽 컬럼) SKBR3 세포를 조사하였다. 도 4A,B는 창에 있는 셀의 M = 800x 개요 이미지를 표시합니다. 인셋으로 표시된 영역은 용량 시리즈 동안 M = 80,000x에서 이미지화되었으며 그림 4C,D를참조하십시오. QD는 밝은 반점으로 보입니다. 도 4E 및 도 4F는 도 4C의직사각형 위치에서 획득한 M = 50,000x 확대 된 이미지를 보여 주며,D. 두 이미지는 D = (7.8 ±0.4) x 103 e-/Å2와함께 투여 시리즈를 수집 한 후 기록되었다. 투여량 계열은 M = 80,000x에서 기록되었다. 노출된 영역은 직사각형으로 인식될 수 있으며, 이에 따라 비코팅 된샘플(도 4F)에대해 사각형이 명확하게 보였다.
그래 핀의 존재를 확인하기 위해 세포가없는 영역의 회절 패턴을 확인하지만 SiN 창에 그래 핀이 있거나없는 것을 획득했습니다. 그래핀의 육각형 구조는 그래핀 코팅샘플(도 4G)의회절 패턴에서 관찰되었으며, 비코팅 시료(도4H)에대해 결석하였다. 단일 결정 그래 핀의 회절 패턴은 그래 핀의 고도로 정렬 된 육각 형 구조로 인해 6 배 대칭을 가질 것입니다. 따라서 육각형 구조는 샘플에 그래 핀의 존재를 나타냅니다.
샘플에 전자 빔 조명의 효과를 조사하기 위해 STEM 이미지는 축적 된 전자 용량의 이미지 시리즈에서 획득되었습니다. 코팅되지 않은 및 그래핀 코팅 된 샘플에 대한 대표적인 결과는 각각 도 5A-D 및 도 5E-G에표시됩니다. 모든 데이터는 셀의 가장자리에서 습득되었으며, 여기서 셀은 평평한, 관찰된 구조는 따라서 SiN 멤브레인에 가장 가깝다. 코팅되지 않은 시료의 노출은 D=(1.9±0.1) x 103 e-/Å D 2(도 5B)에서세포 표면에 나타나는 밝은 구조로 이어졌다. 이러한 구조는 더 높은 용량으로 더 커졌기 때문에 D =(7.8± 0.4) x 103 e-/Å2 (도 5C, D)에서시리즈의 마지막 이미지에서 명확하게 볼 수 있었습니다. 이러한 반점은 그래 핀 코팅 샘플(도 5Figure 5E-G)에나타나지 않았다.
상기에 기재된 프로토콜을 사용하여 추가 마이크로칩을 제조및 검사하였다. 6개의 코팅및 7개의 비코팅 견본은 총으로 조사되었습니다. 코팅되지 않은 7개의 샘플 중 2개는 이러한 유물을 보여주었습니다. 코팅된 샘플 중 어느 것도 추가적인 밝은 반점을 보여주지 못했습니다.
방사선 손상의 또 다른 척도로, QDs 사이의 거리를 검사했다. 구조적 손상이 발생하면 QD 사이의 거리가 변경될 것으로 예상됩니다. 거리의 변화는 다양한 쌍 거리에 대해 D를 축적하는 다양한 QD 쌍에 대해 측정되었습니다. 도 5H는 코팅되지 않은 시료의 입자의 상대적 변화가 평균 1.3% 미만으로 유지된 반면, 코팅된 시료의 평균 상대 거리는 0.8% 미만으로 유지되었다는 것을 보여줍니다. 따라서 그래핀 코팅이 시료를 안정화시켰지만 그래핀 코팅이 없는 건조시도 현저하게 안정적이었다는 결론을 내릴 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> 그림 1: 실리콘 마이크로칩의 SiN 창에 세포 파종 및 HER2 라벨. (A)마이크로칩에 시드후 5분 동안 SKBR3 세포를 가진 SiN 창 영역의 예시적인 영상. (B)동일한 세포가 24시간 후 동일한 SiN 창에 퍼진다.(C)SKBR3 세포는 시드 후 5분 동안 시 마이크로칩에 있다. (D)24시간 후 (C)와 동일한 세포. 파종 시 칩에 세포가 너무 많기 때문에 세포가 제대로 평평해지지 않았습니다. (E)종자 후 5 분 마이크로 칩에 세포. (F)마이크로칩에 너무 적은 세포가 시드되었기 때문에 창에서 셀이 거의 보이지 않았다. (G)HER2의 QD 라벨링 후 동일한 SKBR3 세포의 DIC 이미지. (H)ED2-QD655(노란색으로 거짓 색)를 가진 SKBR3 세포의 DIC 및 해당 형광 이미지의 오버레이 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> 그림 2: 그래핀을 NaCl 크리스탈로 청소하고 전달합니다. (A)PMMA-그래핀 온 폴리머는 PMMA 그래핀을 방출하기 위해 순수한 물에 침지된다. PMMA 그래핀은 유리 슬라이드로 잡을 수 있습니다. (B)구리계 오염은 파황페이트 나트륨 용액을 사용하여 에칭하였다. 그래 핀을 청소하기 위해, 그것은 탈이온 된 물을 포함하는 비커로 전송되었다. 이 단계는 3번 반복되었습니다. PMMA 그래핀은 순수한 물에 NaCl의 포화 용액으로 옮겨졌습니다. NaCl 결정은 염액에서 그래 핀을 집어 들기 위해 사용되었습니다. (C)NaCl 크리스탈의 PMMA 그래핀은 실온에서 30분 동안 건조되었습니다. PMMA는 30 분 동안 아세톤에서 블록을 인큐베이팅하여 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">제거되었습니다.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> 그림 3: Si 마이크로칩에 시드된 세포의 그래핀 코팅. (A)그래 핀 코팅의 절차. NaCl 크리스탈의 그래핀이 수면위로 방출됩니다. 그래핀 조각은 금속 루프로 잡히고 Si 마이크로칩으로 전달됩니다. (B)마이크로칩(2.0 x 2.6mm)은 그래핀 없이 400 x 160 μm의 SiN 윈도우를 갖는다. SKBR3 세포는 어두운 반점으로 보였다. (C)물로 채워진 비커의 표면에 떠있는 그래 핀 (빨간 원). (D)금속 루프로 잡힌 그래핀. (E)그래핀이 SiN 창 위에 있도록 물방울에 부착된 마이크로칩. (F)그래 핀 코팅 후 마이크로 칩. 그래핀은 보라색 반짝이로 보였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> 그림 4: SiN 창에 그래 핀 코팅 및 비 코팅 된 SKBR3 세포의 STEM. (A)M=800x에서 획득한 그래핀 코팅 시료의 STEM M 이미지(B) M=800x.(C) B M= C80,000x 이미지에서 획득한 노단형 시료의 줄기 이미지는 A. 옐로우 라인의 파란색 사각형의 위치에 기록된 80,000x 영상을 나타내고 입자 내에서 측정된 예를 나타낸다. (D) M = 80,000x 이미지는 B. 노란색 선에서 파란색 사각형의 위치에 기록된 입자 내에서 측정된 예를 나타낸다. (E) M = D =(7.8±0.4) x 103 e-/Å2에노출된 C와 동일한 영역의 50,000x 이미지. (F) M = D와 동일한 영역의 50,000x 이미지 및 D =(7.8±0.4) x 103 e-/Å2에노출된다. 노출된 지역은 분명하게 보였다. (G)세포가 없는 부위로부터 그래핀 코팅 된 샘플의 회절 패턴. 그래 핀의 6 배 대칭은 밝은 반점으로 볼 수 있습니다. (H)그래 핀이 없는 시료의 회절 패턴이 6배의 밝은 반점을 나타내지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> 그림 5: 그래핀 코팅없이 샘플에서 발생하는 유물. (A) M = 80,000x에서 획득하고 D =(0.39± 0.02) x 102 e-/Å2에 노출된 그래 핀 코팅이 없는 시료에 대한 영역의 첫 번째 이미지.2 (B) D =(1.94± 0.1) x 103 e-/Å2(노란색 화살표)에서 발생하는 첫 번째 아티팩트가 있는 이미지. (C, D) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ Å2로획득 한 시리즈의 마지막 이미지. 유물은 밝은 반점으로 보였다. (E-G) 그래 핀 은 발생 유물없이 샘플을 코팅. (E) D = (0.39 ± 0.02) x 102 e-/Å2 (F)x 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ±.4) x 103 e-/Å2. D (H)그래 핀 코팅 및 비 코팅 된 샘플에 대한 입자 거리의 상대적 변화. 유물을 보여주는 비코팅 샘플 중 2개는(A-C)에 나타난 샘플 중 하나와 D의 두 번째 샘플의 마지막 이미지와 3개의 코팅된 샘플을 분석하였다(하나는 E-G로 도시됨). 총 10개의 QD 쌍이 250nm에서 3 μm 사이의 거리를 가진 샘플당 검사되었습니다. 상대적 변화는 한 그룹의 모든 측정평균을 반영합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 표 1: 솔루션 및 버퍼용 레시피입니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에 제출된 포유류 세포에 있는 막 단백질을 표지하고 액체 상 스캐닝 전송 전자 현미경을 위한 그래 핀으로 견본을 코팅하기 위한 프로토콜입니다. 방사선에 의한 손상에 대하여 견본의 안정성은 또한 이 프로토콜로 공부할 수 있습니다.

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

이 방법은 생물학적 샘플을 네이티브 환경에서 유지하고 전자 빔 유도 아티팩트를 감소시킵니다. 주요 장점은이 기술이 전체 세포에 적용 가능하다는 것입니다. 그래서 세포는 전자 현미경 검사의 앞에 탈수, 염색, 또는 단면될 필요가 없습니다.전체 전소 플라즈마 멤브레인의 맥락에서 암세포에 수용체를 이미지화하는 능력은 새로운 치료 접근법과 새로운 항암제의 개발로 이어질 수 있는 주요 양상이다. 세포, 그래핀 코팅 및 현미경 검사법과 함께 작업을 시연할 것이며, 세르칸 케스킨은 그래핀을 준비하는 방법을 보여줄 것입니다. 우선, 실리콘 질화물 멤브레인이 있는 PLL 및 FLP 코팅 마이크로칩을 함유한 96개의 웰 플레이트의 2개의 웰에 100마이크로리터의 셀 서스펜션을 추가하고 50마이크로리터의 혈청 프리 배지를 넣습니다.소가 마이크로칩에 부착할 수 있도록 5분간 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. 반전 된 현미경으로 마이크로 칩에 세포의 밀도를 확인하고 세포가 평평하게하고 부착 할 수있는 충분한 공간으로 창을 커버 있는지 확인합니다. 세포에 HER2에 레이블을 지정하려면 마이크로칩을 라벨링 플레이트의 첫 번째 행의 우물에 넣습니다.그런 다음 PBS BSA로 마이크로칩을 세척합니다. 항체 모방의 특이하지 않은 결합을 방지하기 위해 PBS BSA GS로 마이크로칩을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 나노 몰라 항체 모방으로 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 10 분 동안 10 분 동안 모방합니다.중합체에서 PMMA 그래핀을 제거하기 위해 PMMA 그래핀 주위의 폴리머에 몇 방울의 물방울을 피펫합니다. 그런 다음 PMMA 그래핀을 방출하기 위해 30~ 45도 각도로 물에 담급됩니다. 구리 기반 오염 물질을 식히려면 물 속에서 0.42 개의 어금니 나트륨 퍼설페이트의 50 밀리리터 용액을 prepair하십시오.표준 유리 슬라이드를 사용하여 PMMA 그래핀을 그래핀 측면을 아래로 사용하여 나트륨 퍼설페이트 용액으로 옮길 수 있습니다. PMMA 그래핀은 용액의 상단에 떠 있습니다. 하룻밤 사이에 그대로 두십시오.다음 날, 심황나트륨 용액에서 PMMA 그래핀을 깨끗한 물로 옮기. 반 시간 동안 물에 떠 보자. PMMA 그래핀에서 모든 퍼설페이트 잔류물을 제거하기 위해 총 3회 세척을 반복합니다.그런 다음 PMMA 그래핀을 염화나트륨 결정으로 옮기습니다. 페트리 접시에 물에 염화 나트륨의 포화 용액을 준비하고 아래로 그래 핀 측면과 솔루션의 상단에 PMMA 그래 핀을 전송합니다. 염화 나트륨 크리스탈을 핀셋으로 잡고 부동 PMMA 그래핀을 집어 들으세요.그런 다음 2분 동안 수직으로 유지하여 여분의 물이 흘러 나오도록 합니다. 실온에서 30분 동안 건조하게 하고 20분 동안 섭씨 100도의 오븐에서 구우세요. 물을 완전히 제거합니다.유리 페트리 접시에 아세톤을 예열하여 연기 후드의 핫 플레이트에 섭씨 약 50도예 예열합니다. 불을 피하기 위해 조심스럽게 온도를 지켜보십시오. 소금에 PMMA 그래핀을 아세톤으로 채워진 페트리 접시에 담그고 30분 동안 PMMA를 녹입니다.소금에 그래 핀을 철저히 건조하자 샘플 준비를 위해 사용하기 전에. 준비되고 라벨이 부착된 마이크로칩을 순수한 물로 씻어 버퍼에서 소금잔류를 제거하고 필터 용지에 놓습니다. 세포는 어두운 반점으로 표시되어야 합니다.면도날을 사용하여 염화 나트륨 크리스탈의 다층 그래핀을 마이크로칩의 실리콘 질화물 창에 맞는 조각으로 자른다. 염화 나트륨 결정에서 그래 핀을 제거 하여 물 비커에 찍어, 표면에 대하여 45도 각도로 결정을 기울입니다. 물 표면에서 금속 루프로 그래 핀을 잡은 다음 마이크로 칩의 상부 표면을 낮은 루프 표면으로 터치하여 마이크로 칩이 금속 루프에 달라 붙습니다.그래 핀은 마이크로 칩의 상단에 볼 수 있습니다. 스테레오현미경에서 필터 용지를 사용하여 마이크로칩에서 남은 물을 제거하여 그래핀이 실리콘 질화물 창의 모든 세포를 덮습니다. 핀셋이 있는 필터 용지에 마이크로칩을 놓습니다.그래핀은 마이크로칩에서 보라색 반짝이로 보입니다. 마이크로칩을 종이에서 페트리 접시로 옮킵니다. 파이프는 물 방울을 자유 구획 중 하나에 넣고 뚜껑을 닫아 물이 포화 된 분위기를 제공합니다.그런 다음, 파라핀 필름으로 구획 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에 냉장고에 보관하십시오. 콘덴서 렌즈를 조정하여 최소 0.2 나노미터의 프로브 크기에 대한 정렬 샘플을 사용하여 STEM을 200킬로볼트 빔 에너지로 설정합니다. 조리개를 삽입하여 180 피코암페어와 13.2 밀리라디안의 빔 수렴 반각의 프로브 전류를 설정합니다.프로젝터 렌즈 설정을 조정하여 ADF STEM 검출기 오프닝 세미 앵글 범위를 68~280밀리라디안으로 설정합니다. 그런 다음 STEM 이미지 크기를 2048픽셀로 설정하고 픽셀은 6마이크로초로 유지됩니다. 세포가 위를 향하고 전자 현미경으로 홀더를로드하는 방식으로 표준 표본 홀더에 그래 핀 코팅 된 세포로 마이크로 칩을적재합니다.800 X 배율로 개요 그림을 획득합니다. 이어서, 1.3 나노미터의 픽셀 크기로 80, 000 X에서 양자점 나노입자의 관심 영역과 이미지를 식별한다. 최적으로 시드된 세포는 여기에 표시됩니다.창은 덮여 있지만 평평하게 하고 고수할 수 있는 충분한 공간이 있습니다. 너무 많은 세포가 마이크로칩에 시드되었을 때 모든 세포가 부착할 공간이 부족했습니다. 24 시간 후에, 세포의 반 이상은 평평하지 않았습니다.너무 적은 셀이 시드되면 실리콘 질화물 창은 24 시간 후에 큰 빈 공간으로 끝납니다. 최적으로 시드된 세포의 DIC 및 형광 이미지는 HER2의 성공적인 라벨링을 보여주는 여기에서 표시됩니다. STEM은 그래핀 코팅 및 비 코팅 SKBR3 세포에서 수행되었다.800 X 배율 이미지의 인셋은 80, 000 X.퀀텀닷 나노입자가 50, 000 X 배율에서 밝은 반점으로 볼 수 있는 것으로 이미지되었다. 샘플에 전자 빔 조명의 효과를 조사하기 위해 STEM 이미지는 축적 된 전자 용량의 이미지 시리즈에서 획득되었습니다. 코팅되지 않은 및 그래핀 코팅 샘플에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.코팅되지 않은 시료의 노출은 그래핀 코팅 된 샘플중 어느 한 도 발생하지 않은 세포 표면에 나타나는 밝은 구조로 이어졌습니다. 입자 쌍의 평균 상대 거리 변화는 코팅되지 않은 샘플의 경우 1.3% 미만이고 코팅된 샘플의 경우 0.8% 미만입니다. 이 절차에 따라, 막 단백질의 다른 종류는 그밖 현미경 방법을 사용하여 전체 세포에 심을 수 있습니다.이 기술은 플라즈마 막의 조직과 단백질 간의 상호 작용에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 손상되지 않은 플라즈마 막에서 단백질을 이미지 할 수 있게합니다.

graphene-enclosure-chemically-fixed-mammalian-cells-for-liquid-phase

Research

연구

JoVE Journal

Biology

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