액체 상 전자 현미경 검사를 위한 화학적으로 고정된 포유류 세포의 그래핀 인클로저

이 방법은 생물학적 샘플을 네이티브 환경에서 유지하고 전자 빔 유도 아티팩트를 감소시킵니다. 주요 장점은이 기술이 전체 세포에 적용 가능하다는 것입니다. 그래서 세포는 전자 현미경 검사의 앞에 탈수, 염색, 또는 단면될 필요가 없습니다.

전체 전소 플라즈마 멤브레인의 맥락에서 암세포에 수용체를 이미지화하는 능력은 새로운 치료 접근법과 새로운 항암제의 개발로 이어질 수 있는 주요 양상이다. 세포, 그래핀 코팅 및 현미경 검사법과 함께 작업을 시연할 것이며, 세르칸 케스킨은 그래핀을 준비하는 방법을 보여줄 것입니다. 우선, 실리콘 질화물 멤브레인이 있는 PLL 및 FLP 코팅 마이크로칩을 함유한 96개의 웰 플레이트의 2개의 웰에 100마이크로리터의 셀 서스펜션을 추가하고 50마이크로리터의 혈청 프리 배지를 넣습니다.

소가 마이크로칩에 부착할 수 있도록 5분간 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. 반전 된 현미경으로 마이크로 칩에 세포의 밀도를 확인하고 세포가 평평하게하고 부착 할 수있는 충분한 공간으로 창을 커버 있는지 확인합니다. 세포에 HER2에 레이블을 지정하려면 마이크로칩을 라벨링 플레이트의 첫 번째 행의 우물에 넣습니다.

그런 다음 PBS BSA로 마이크로칩을 세척합니다. 항체 모방의 특이하지 않은 결합을 방지하기 위해 PBS BSA GS로 마이크로칩을 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 200 나노 몰라 항체 모방으로 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %에서 10 분 동안 10 분 동안 모방합니다.

중합체에서 PMMA 그래핀을 제거하기 위해 PMMA 그래핀 주위의 폴리머에 몇 방울의 물방울을 피펫합니다. 그런 다음 PMMA 그래핀을 방출하기 위해 30~ 45도 각도로 물에 담급됩니다. 구리 기반 오염 물질을 식히려면 물 속에서 0.42 개의 어금니 나트륨 퍼설페이트의 50 밀리리터 용액을 prepair하십시오.

표준 유리 슬라이드를 사용하여 PMMA 그래핀을 그래핀 측면을 아래로 사용하여 나트륨 퍼설페이트 용액으로 옮길 수 있습니다. PMMA 그래핀은 용액의 상단에 떠 있습니다. 하룻밤 사이에 그대로 두십시오.

다음 날, 심황나트륨 용액에서 PMMA 그래핀을 깨끗한 물로 옮기. 반 시간 동안 물에 떠 보자. PMMA 그래핀에서 모든 퍼설페이트 잔류물을 제거하기 위해 총 3회 세척을 반복합니다.

그런 다음 PMMA 그래핀을 염화나트륨 결정으로 옮기습니다. 페트리 접시에 물에 염화 나트륨의 포화 용액을 준비하고 아래로 그래 핀 측면과 솔루션의 상단에 PMMA 그래 핀을 전송합니다. 염화 나트륨 크리스탈을 핀셋으로 잡고 부동 PMMA 그래핀을 집어 들으세요.

그런 다음 2분 동안 수직으로 유지하여 여분의 물이 흘러 나오도록 합니다. 실온에서 30분 동안 건조하게 하고 20분 동안 섭씨 100도의 오븐에서 구우세요. 물을 완전히 제거합니다.

유리 페트리 접시에 아세톤을 예열하여 연기 후드의 핫 플레이트에 섭씨 약 50도예 예열합니다. 불을 피하기 위해 조심스럽게 온도를 지켜보십시오. 소금에 PMMA 그래핀을 아세톤으로 채워진 페트리 접시에 담그고 30분 동안 PMMA를 녹입니다.

소금에 그래 핀을 철저히 건조하자 샘플 준비를 위해 사용하기 전에. 준비되고 라벨이 부착된 마이크로칩을 순수한 물로 씻어 버퍼에서 소금잔류를 제거하고 필터 용지에 놓습니다. 세포는 어두운 반점으로 표시되어야 합니다.

면도날을 사용하여 염화 나트륨 크리스탈의 다층 그래핀을 마이크로칩의 실리콘 질화물 창에 맞는 조각으로 자른다. 염화 나트륨 결정에서 그래 핀을 제거 하여 물 비커에 찍어, 표면에 대하여 45도 각도로 결정을 기울입니다. 물 표면에서 금속 루프로 그래 핀을 잡은 다음 마이크로 칩의 상부 표면을 낮은 루프 표면으로 터치하여 마이크로 칩이 금속 루프에 달라 붙습니다.

그래 핀은 마이크로 칩의 상단에 볼 수 있습니다. 스테레오현미경에서 필터 용지를 사용하여 마이크로칩에서 남은 물을 제거하여 그래핀이 실리콘 질화물 창의 모든 세포를 덮습니다. 핀셋이 있는 필터 용지에 마이크로칩을 놓습니다.

그래핀은 마이크로칩에서 보라색 반짝이로 보입니다. 마이크로칩을 종이에서 페트리 접시로 옮킵니다. 파이프는 물 방울을 자유 구획 중 하나에 넣고 뚜껑을 닫아 물이 포화 된 분위기를 제공합니다.

그런 다음, 파라핀 필름으로 구획 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에 냉장고에 보관하십시오. 콘덴서 렌즈를 조정하여 최소 0.2 나노미터의 프로브 크기에 대한 정렬 샘플을 사용하여 STEM을 200킬로볼트 빔 에너지로 설정합니다. 조리개를 삽입하여 180 피코암페어와 13.2 밀리라디안의 빔 수렴 반각의 프로브 전류를 설정합니다.

프로젝터 렌즈 설정을 조정하여 ADF STEM 검출기 오프닝 세미 앵글 범위를 68~280밀리라디안으로 설정합니다. 그런 다음 STEM 이미지 크기를 2048픽셀로 설정하고 픽셀은 6마이크로초로 유지됩니다. 세포가 위를 향하고 전자 현미경으로 홀더를로드하는 방식으로 표준 표본 홀더에 그래 핀 코팅 된 세포로 마이크로 칩을적재합니다.

800 X 배율로 개요 그림을 획득합니다. 이어서, 1.3 나노미터의 픽셀 크기로 80, 000 X에서 양자점 나노입자의 관심 영역과 이미지를 식별한다. 최적으로 시드된 세포는 여기에 표시됩니다.

창은 덮여 있지만 평평하게 하고 고수할 수 있는 충분한 공간이 있습니다. 너무 많은 세포가 마이크로칩에 시드되었을 때 모든 세포가 부착할 공간이 부족했습니다. 24 시간 후에, 세포의 반 이상은 평평하지 않았습니다.

너무 적은 셀이 시드되면 실리콘 질화물 창은 24 시간 후에 큰 빈 공간으로 끝납니다. 최적으로 시드된 세포의 DIC 및 형광 이미지는 HER2의 성공적인 라벨링을 보여주는 여기에서 표시됩니다. STEM은 그래핀 코팅 및 비 코팅 SKBR3 세포에서 수행되었다.

800 X 배율 이미지의 인셋은 80, 000 X.퀀텀닷 나노입자가 50, 000 X 배율에서 밝은 반점으로 볼 수 있는 것으로 이미지되었다. 샘플에 전자 빔 조명의 효과를 조사하기 위해 STEM 이미지는 축적 된 전자 용량의 이미지 시리즈에서 획득되었습니다. 코팅되지 않은 및 그래핀 코팅 샘플에 대한 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.

코팅되지 않은 시료의 노출은 그래핀 코팅 된 샘플중 어느 한 도 발생하지 않은 세포 표면에 나타나는 밝은 구조로 이어졌습니다. 입자 쌍의 평균 상대 거리 변화는 코팅되지 않은 샘플의 경우 1.3% 미만이고 코팅된 샘플의 경우 0.8% 미만입니다. 이 절차에 따라, 막 단백질의 다른 종류는 그밖 현미경 방법을 사용하여 전체 세포에 심을 수 있습니다.

이 기술은 플라즈마 막의 조직과 단백질 간의 상호 작용에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 손상되지 않은 플라즈마 막에서 단백질을 이미지 할 수 있게합니다.