Name: MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 학습하세요 MCF7 세포 단층층에서 공초점 현미경과 ImageJ를 이용한 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 지수 정량화 방법을. 이 기법은 암 생물학 연구에서 세포 형태학과 기계적 특성 분석에 활용됩니다.

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이 작품은 보조금 번호 2014/14/M/NZ1/00437에서 폴란드 국립 과학 센터에 의해 지원되었다.

1. 준비 단계
<ol><li>컨서적 단층층을 얻기 위한 세포 시딩<ol>
<li>시드하기 전에 4웰 챔버 슬라이드의 웰을 콜라겐 I(또는 다른 ECM 성분)로 코팅합니다. 콜라겐 I 코팅의 경우, 상용 프로토콜을 따르십시오 : 8 μg /cm2의농도에서 https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html.</li>
		<li>4웰 챔버 슬라이드의 한 웰에 400,000 개의 세포를 시드하십시오.</li>
		<li>염색 하기 전에 24h(또는 실험 종점에 따라 더 이상) 세포를 배양하고, 37°C, 5% CO2에서인큐베이터에서. 이 단계는 세포 세포 접촉의 성숙과 단층의 형성을 허용합니다.</li>
		<li>광학, 반전 된 현미경을 사용하여 통합 (약 90 %가 필요함) 및 단층의 일반적인 상태를 확인하십시오. 세포가 떠 있거나 스트레스를 받는 경우 진행하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면역형광 염색 참고: 셀은 선택 프로토콜로 염색할 수 있습니다. 여기서, 면역형광은 이전에 설명된4와같이 수행되었다.<ol>
<li>초점 접착 분석을 위해, 선택의 초점 접착 단백질로 세포를 얼룩 (이 프로토콜 paxillin에서). 셀-세포 접합 단백질을 선택한 세포 모양 분석 얼룩(이 프로토콜에서 데모소말 단백질 플라코글로빈).</li>
		<li>프로시저의 경우 달리 지정하지 않는 한 지정된 솔루션의 0.5mL을 사용합니다.</li>
		<li>PBS에서 4% 포름알데히드에서 30분 동안 세포를 얼음으로 고정합니다.</li>
		<li>0.1 M 염화암모늄(PBS)을 10분 간 배양하여 자동 형광을 해소합니다.</li>
		<li>30분(퍼메아빌리제이화)에 0.5% 트리톤 X-100(PBS)을 추가합니다.</li>
		<li>1 시간 동안 TBS-T에서 5 % 우유 (또는 1 % BSA)로 차단하십시오.</li>
		<li>하룻밤 4 °C에서 1 차 항체와 인큐베이션 (안티 팍실린 : 토끼, 1:250, 안티 플라코글로빈 : 토끼, 1:400)</li>
		<li>30 분 동안 이차 항체가있는 인큐베이션 (알렉사 플루어 594 염소 안티 토끼, 1:500, 1:500)</li>
		<li>300 nM DAPI를 1-5분 동안 켜진 스테인은 빛으로부터 보호합니다. 참고: 선택적으로, 형광 성 남염 접합체 (conc. 1:400)를 가진 actin의 추가 염색이 수행 될 수있다; phalloidin는 이차 항체와 같은 단계에서 추가되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>공초점 이미징<ol>
<li>공초점 현미경(예: 자이스 LSM800)을 사용하여 단일 Z 슬라이스의 이미지를 가져 가라. 참고: 선택적 액틴 염색은 적절한 초점 평면을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 피질 작용체 염색은 액틴 응력 섬유가 기질 부위, 기판 부근에 존재하는 동안, 도 1에도시된 바와 같이 정량부위에 존재한다.</li>
		<li>초점 접착 이미징<ol>
<li>기판에 가까운 기저 영역에서 초점 접착 분석을 위해 Z 슬라이스를 선택합니다.</li>
			<li>사용 가능한 가장 높은 숫자 조리개와 목표를 사용합니다(63x N.A.: 1.4). 참고: FA의 모양은 매우 구체적이며 쉽게 알아볼 수 있습니다. 따라서, 세포 아래 초점 평면에서 스캔을 시작 하 고 천천히 그들을 향해 스캔 하는 것이 좋습니다., 파 가 명확 하 게 볼 때까지. 이미지 분석은 더 균일한 경향이 비전의 작은 필드에서 더 정확할 것입니다, 그러나 이것은 더 적은 세포가 보기의 한 필드에 계산될 것이라는 것을 의미합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>세포 세포 접촉 화상 진찰<ol>
<li>40배 또는 63배 의 목표를 사용합니다.</li>
			<li>핵 염색 및 선호하는 접합 단백질 염색을 위한 채널을 선택합니다.</li>
			<li>단층의 정량 영역에서 셀 형상 분석을 위해 Z 슬라이스를 선택합니다.</li>
			<li>적어도 3개의 다른 시야(200-400 세포)에 대한 사진을 찍습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 이미지 분석
참고: 제공된 매크로는 ImageJ 버전 1.50f 또는 최신 버전에서 최적으로 작동합니다. 신호 대 잡음 비율이 높고 저평가된 픽셀이 없는 이미지만 정량화하는 데 사용합니다. 설명된 방법에는 수동 매개변수 조정이 필요한 단계가 포함됩니다. 따라서 블라인드 분석/맹목적인 실험 설정이 권장됩니다. 이미지 파일 이름을 암호화하기 위해 "블라인드 분석 도구"(https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools 사용 가능)와 같은 ImageJ 플러그인을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>초점 접착 분석 참고: 다음 방법에 대한 권장 입력 파일은 .tiff 형식으로 저장된 8비트 그레이스케일로 표시되는 FA 이미지입니다.<ol><li>ImageJ를 사용하여 이미지를 엽니다.</li>
		<li>이미지의 배율을 픽셀로설정(분석 | 설정 배율;; 배율을 제거하고 전역 옵션을 확인합니다).</li>
		<li>측정 옵션에 파일 이름과 ROI 영역포함(분석 | 측정 설정...); 영역 및 표시 레이블 옵션을 확인합니다.</li>
		<li>배경 을 뺍니다(프로세스 | 배경을 뺍니다. 롤링 볼 반경 매개변수를 50픽셀로 설정합니다. 슬라이딩 포물선형 옵션을 확인하십시오). 의사 변색 RGB 이미지의 경우 : 분할 RGB 채널, F가 열리고, 닫기 남은 채널채널로 채널을 떠나(이미지 | 색상 | 분할 채널).</li>
		<li>가장 작은 관심 영역(ROI)의 영역을 결정합니다. 프리핸드 또는 다각형 선택을 사용하여 가장 작은 단일 초점 접착을 설명하고 해당 영역을 측정합니다(분석| 측정). 임의로 선택한 몇 가지 이미지(총 20개의 ROI)에서 다른 ROI(FA)에 대해 이 단계를 반복합니다. 얻은 결과의 평균을 계산하고 저장합니다. 참고: 이 단계는 주어진 이미지 집합을 처음으로 분석하는 경우에만 필요합니다(특정 세포주, 특정 세포외 매트릭스 구성 요소로 코팅 슬라이드, 다른 배양 조건).</li>
		<li>다음 방법 중 하나를 사용하여 이미지를 바이너리로 변환합니다.<ol>
<li>전역 임계값설정(이미지 | 조정 | 임계값; 기본값, B&amp;W 및 다크 배경 옵션을 확인하거나 임계값을 수동으로 조정하거나 자동으로 설정합니다.)</li>
			<li>로컬 임계값 설정(이미지 | 조정 | 자동 로컬 임계값...; 방법을 판살카르로 설정하고 검은색 배경 옵션에서 흰색 개체를 확인합니다. 다음으로, 이미지를 반전(편집 | 반전).</li>
		</ol></li>
		<li>ROI의 수와 영역을 측정합니다. 분석 선택 | 입자 분석; 픽셀 단위, 결과 표시, 결과 지우기 및 요약 옵션, 크기 매개 변수설정, 낮은 경계는 단계 2.1.5에서 가장 작은 RO의 평균을 사용합니다. 상부 경계는 일반적인 세포 영역의 25%로 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>데이터 전송(이미지 이름, FA 수, 총 및 평균 영역, 각각 슬라이스, 카운트, 총 면적, 평균 크기포함)을 요약 창에서 선택한 데이터 관리 프로그램에 연결합니다.</li>
		<li>DAPI 염색 핵을 계산하여 이미지당 세포 수를 결정합니다. 카운트는 수동으로 수행 할 수 있습니다(플러그인 | 분석 | 셀 카운터)또는 다음과 같은 사용 가능한 프로토콜에서와 같이: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.</li>
		<li>또는, FA 계산을 용이하게하려면, 첨부 된 ImageJ 매크로 (FAs.ijm)를 사용합니다.<ol>
<li>ImageJ 소스 파일 폴더에 있는 플러그인 또는 매크로 폴더에 매크로와 함께 .ijm 파일을 이동합니다.</li>
			<li>2.1.4 단계에서 설명된 바와 같이 가장 작은 ROI영역을 결정합니다.</li>
			<li>매크로 파일 열기(플러그인 | 매크로 | 편집...</li>
			<li>매크로를 실행하기 전에 세 변수의 값을 설정: 단계 2.1.4 동안 획득 한 숫자로 area_of_the_smallest_region_of_interest 채우기 값. threshold_type 값을 수동 또는 자동으로설정합니다.</li>
			<li>변경 내용을 저장합니다(매크로를 사용할 준비가 되어 있어야 합니다).</li>
			<li>ImageJ 패널에서 매크로를 호출하거나 바로 가기를 만듭니다. 매크로는 표준 열린 대화 상자 창에서 시작합니다. 처리할 이미지를 선택합니다. 참고: 수동 임계값 조정의 경우 임계값 값에 대한 수동 확인이 필요합니다(임계값 대화 상자 창에서 적용 단추를 사용하여 변경 내용을 수락하지 말고 대신 작업 필수 사용자 지정 대화 창을 사용하십시오). 매크로로 작업하여 얻은 결과는 2.1.8 단계(요약 대화 상자에 포함)에 설명된 결과와 동일합니다. 또한 수동 임계값 조정의 경우 낮은 임계값 수준이 Log 대화 상자 창에 표시되며, 이 값을 사용하면 필요한 경우 나중에 얻은 결과를 재현할 수 있습니다. 추가 피규어 S1및 S2는 FAs.ijm 매크로에 대한 교육 데이터 집합으로 포함되었습니다.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>셀 형상 분석<ol>
<li>수동<ol>
<li>ImageJ 또는 유사한 함수 집합이 있는 다른 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니다(ImageJ에 관련된 추가 지침). 메뉴 분석에서 선택하여 측정할 매개변수를 선택 | 나타나는 상자에 측정값 과 똑딱 모양 설명자 를 설정합니다.</li>
			<li>Freehand 선택 아이콘을 사용하여 접합 단백질(들)으로 표시된 셀 테두리를 수동으로 설명합니다. 선택한 매개 변수는 각 셀에 대해 자동으로 계산됩니다. 편집을 클릭하여 각 셀을 요약한 후 결과를 저장 | 선택 | 관리자에 추가합니다. 중단 없는 테두리가 있는 완전하고 완전히 보이는 셀만 계산해야 합니다.</li>
			<li>시야의 모든 셀이 윤곽을 작성하면 ROI 관리자의 왼쪽 상자에 나타나는 모든 숫자(셀에 해당)를 표시하고 측정값을 클릭하여 결과 상자에 결과가 나타나고 선택한 스프레드시트로 전송할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>자동 참고: 셀 형상 설명자(CSI, 종횡비, 원도, 견고성)의 정량화를 용이하게 하기 위해 ImageJ 매크로가 이 문서(CSI.ijm)에 준비되고 부착되었습니다. 매크로는 주로 MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ) 5라는 ImageJ 플러그인을기반으로합니다. 매크로는 다음 단계를 실행합니다: 1) 이미지의 각 테두리의 확장은 10개의 검정 픽셀[MorpholibJ]에 의해 확장됩니다. 2) 팽창과 침식의 라운드 - 형태 필터 [MorpholibJ]; 3) 형태학적 세분화에 의한 세포 경계의 이진 이미지 생성[MorpholibJ]; 4) 세포 경계의 팽창; 5) 픽셀 값의 반전; 6) 이미지에 있는 세포의 영역 및 둘레의 선택 및 측정의 생성; 및 7) 설명된 셀및 ImageJ ROI 선택 항목으로 이미지를 새 파일에 저장합니다.<ol>
<li>매크로가 있는 .ijm 파일을 ImageJ 소스 파일 폴더에 있는 플러그인 또는 매크로 폴더로 이동합니다. ImageJ 패널에서 매크로를 호출하거나 바로 가기를 만듭니다.</li>
			<li>새 데이터 집합을 정량화하기 전에 가장 작고 가장 큰 관심 영역의 값을 결정합니다. 이미지에서 가장 작고 가장 큰 셀의 몇 가지 (3-10) 예의 윤곽선 (freehand 또는 다각형 선택) 다음 해당 영역을 측정(| 분석 측정).</li>
			<li>또는 기본 설정(크기 제한이 0으로 설정되고 상한이 무한대로 설정됨)으로 매크로를 실행하면 매크로가 완료될 때까지 기다렸다가 셀 크기 경계 설정 옵션을 선택합니다. 레이블을 클릭하여 가장 작고 가장 큰 셀의 영역을 측정한 다음 ImageJ ROI 관리자에서 측정을 누릅니다. the_smallest_cell 변수와 the_biggest_cell 변수의 값을 설정합니다. 변경 내용을 저장하고 모든 매크로 대화 창을 닫고 매크로를 다시 실행합니다. 참고: 매크로는 ROI 크기 경계를 설정하지 않고 사용할 수 있지만 부적절한 셀 조각이나 셀 클러스터를 측정할 가능성이 크게 증가하기 때문에 권장되지 않습니다.</li>
			<li>표준 열린 대화 상자 창으로 매크로를 시작합니다. 처리할 이미지(회색축)를 선택합니다.</li>
			<li>결과를 분석합니다. 매크로에서 제공하는 출력은 결과 테이블(셀 라벨, 이미지 레이블, 셀 영역 [픽셀2],셀 둘레 [픽셀2],원형 [CSI], 종횡비, 둥글림, 견고성), 설명된 셀및 ROI 선택 목록(결과 하위 폴더에 새 파일에 저장됨)으로 구성됩니다. 결과 테이블은 사용자의 클립보드에 자동으로 복사됩니다. 참고: 추가 수치 S3 및 S4는 CSI.ijm 매크로에 대한 교육 데이터 집합으로 포함되었습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 정량화
<ol><li>FA의 정량화<ol>
<li>세포/핵당 평균 FA 수와 평균 FA 크기를 계산합니다. 참고: 일부 세포주에 대 한 별개의 세포에서 별도로 FA를 계산하는 것이 가능 하다. 강력한 세포 세포 접점을 갖는 세포주 접촉체의 경우 MCF7과 같은 단층층으로 성장하며, 세포당 단일층으로 성장하며, 세포당 FA의 수 와 크기는 전체 이미지에서 핵의 수에 의해 계수하는 FA로부터 얻은 값을 분할하여 계산될 수 있다.</li>
		<li>인구(실험 그룹)간의 잠재적 차이의 통계적 유의성을 평가합니다. 데이터의 분포 와 분산에 따라 두 개의 서로 다른 그룹을 비교하기 위해 학생 t 테스트(일반 분포) 또는 비파라메트릭 U-테스트(Mann-Whitney)를 사용합니다. 여러 그룹을 비교하기 위해 적절한 포스트 혹 테스트와 함께 편도 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis를 사용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 형상 분석<ol>
<li>셰이프 설명자 계산<ol>
<li>수동 분석: 수식을 사용하여 적절한 영역 및 둘레에서 측정된 각 셀에 대한 스프레드시트에서 셀 셰이프 인덱스(CSI, 원형 또는 셀 형상이라고도 함)를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61461/61461equ01.jpg"> 참고: CSI는 값을 1(원형)에서 0(길쭉한 값)으로 가정합니다. 다양한 셀 셰이프(동일한 영역)와 해당 각 CSI의 예는 도 2에나와 있습니다. 자동화된 분석에서 셰이프 설명자 값(아래 등록 및 정의)은 자동으로 계산되고 결과 상자에 나타납니다. (1) CSI = 4π*영역/(둘레)2 (2) AR = 주요 축/미축 (3) 둥글림 = 4*영역/π*(주요 축)2 (4) 견고성 = 영역/볼록 영역</li>
		</ol>
</li>
		<li>세포 모양 분포의 히스토그램<ol>
<li>세포 형상 분포를 순환(CSI)의 히스토그램으로 플롯합니다. 그들의 CSI 값에 따라 셀을 분류 (최소 200-400 셀에 대 한 계산), 10 균일 한 간격 중 하나에 (범위: 0-1, 빈 너비: 0.1). 히스토그램은 모든 범주의 셀 수를 표시합니다. 참고: 일반적인 MCF7 세포 층의 형상 분포를 보여주는 히스토그램은 약 0.7-0.8 CSI의 피크를 나타낸다. 세포의 모양이 일부 요인에 의해 왜곡되는 경우 (예를 들어 G2 / M 위상 체포를 일으키는 원인이 되는 paclitaxel 치료와 그 결과 더 많은 세포가 둥글다) 그것은 히스토그램에 반영되어야한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>누적 배포 플롯<ol>
<li>셀 모양 변경(또는 분포의 다른 변화)에서 통계적으로 중요한 차이를 평가하는 가장 좋은 방법이기 때문에 각 셀라인에 대한 누적 CSI 분포를 비교합니다. 예를 들어, 그것은 FA의 변화 분포를 추적하기 위해 적용 할 수있다.</li>
			<li>누적 분포 함수(CDF)를 계산하여 분포를 비교합니다. CDF는 지정된 CSI 값(X 축에 플롯) 모든 값이 이 CSI 값(Y 축에 플롯된)과 덜 또는 동일한 백분율(또는 상대 수)을 할당합니다. 따라서 CSI 값이 높아지면 이 값과 덜 또는 동일한 값 집합의 백분율도 높아집니다. CDF는 선택한 통계 소프트웨어또는 수동으로 계산할 수 있습니다.</li>
			<li>통계 분석을 위해 콜고모로프-스미르노프 비파라메트릭 테스트를 사용하십시오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+closure+of+circular+wounds+through+coordinated+collective+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Search+Results%22%5BJournal%5D)">Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion.</a> Search Results. 13 (1), 016006(2016).</li>
<li>Ilina, O., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+collective+cell+migration+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of collective cell migration at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).</li>
<li>Ladoux, B., Mege, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+collective+cell+behaviours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of collective cell behaviours.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).</li>
<li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microscopy+identifies+bisphenol+AP%2C+a+bisphenol+A+analog%2C+as+a+novel+AR+down-regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator.</a> Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).</li>
<li>Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoLibJ%3A+integrated+library+and+plugins+for+mathematical+morphology+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).</li>
<li>Balcerak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAX1+impact+on+collective+cell+migration%2C+cell+adhesion%2C+and+cell+shape+is+linked+to+the+regulation+of+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).</li>
<li>Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+analysis+of+cell%2C+nucleus+and+focal+adhesion+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology.</a> PLoS One. 13 (3), 0195201(2018).</li>
<li>Fokkelman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adhesome+screen+identifies+critical+modulators+of+focal+adhesion+dynamics%2C+cellular+traction+forces+and+cell+migration+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour.</a> Scientific Reports. 6, 31707(2016).</li>
<li>Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+quantitative+analysis+of+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions.</a> MethodsX. 1, 56-59 (2014).</li>
<li>Kim, D. H., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+size+uniquely+predicts+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion size uniquely predicts cell migration.</a> FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).</li>
<li>Pincus, Z., Theriot, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+quantitative+methods+for+cell-shape+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis.</a> Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Texture-based+segmentation+and+a+new+cell+shape+index+for+quantitative+analysis+of+cell+spreading+in+AFM+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images.</a> Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).</li>
<li>Tong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+micropatterning+reveals+the+modulatory+effect+of+cell+shape+on+proliferation+through+intracellular+calcium+transients%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).</li>
<li>Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+cytoskeletal+alignment+independent+of+fluid+shear+stress+on+micropatterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).</li>
</ol>

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세포 세포 및 세포 기질 접착은 상피 세포의 고유 특성을 구성하고 조직 형태 발생 및 심방 발생에 중요한 역할을한다. 성인 조직에서 세포 층의 기계적 특성의 적절한 조절은 항상성을 유지하고 종양 진행 및 전이와 같은 병리학적 반응을 예방하는 데 중요합니다. 초점 접착의 크기와 수는 세포 기질 접착강도에 따라 달라지며, 세포 모양은 수축력에 따라 다르며 세포-세포 접촉의 상태와 관련이 있다.
여기서, 우리는 면역 형광에 의해 염색된 세포 구조의 면적, 수 및 형상의 두 가지 간단한 방법을 설명하며, 이 경우 초점 접착및 세포 층의 전체 세포를 설명한다. 그러나 제안된 도구는 선택한 구조의 정량화를 위해 용도를 변경할 수 있습니다. 이러한 분석의 주요 문제는 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 품질입니다. 이러한 방법은 세포 배양 장치 및 공초점 현미경을 갖춘 모든 표준 실험실에서 구현될 수 있다. 그(것)들은 측정한 파라미터에 있는 다름 (자연 또는 특정 처리에 의해 유도되는) 특...

상피 세포 단층은 세포 세포 및 세포 기질 접착뿐만 아니라 수축력 및 장력이 중요한 매개 변수를 나타내고 적절한 균형이 단위1,,2,,3의전반적인 무결성에 기여하는 집단으로서 작용한다. 따라서 이러한 매개 변수를 평가하는 것은 셀 레이어의 현재 상태를 설정하는 방법을 나타냅니다.
여기서 설명된 2개의 방법은 지지체, 상피 세포의 컨런트 단층층의 2차원 분석을 나타낸다(이 경우 MCF7 유방암 세포주). 분석은 Z축의 다른 영역의 공초점 이미지(단일 Z-슬라이스)를 사용하여 수행됩니다. 세포 형상 측정을 위한 초점 접착(FA) 측정 및 정량 영역을 위한 기판 근처의 기저 영역. 제시된 방법은 비교적 간단하며 표준 실험실 기술과 오픈 소스 소프트웨어가 필요합니다. 공초점 현미경 검사는 이 프로토콜에 충분하므로 보다 전문적인 TIRF(총 내부 반사 형광) 현미경 검사를 사용하지 않고 수행할 수 있습니다. 따라서 프로토콜은 비교적 표준 실험실 설정에서 구현될 수 있습니다. 방법의 정확도는 제한적이지만 초점 접착 및 세포 모양의 기본 차이를 구별 할 수 있습니다.
여기서 설명된 두 가지 방법은 ImageJ를 사용하여 수행된 세포 배양, 면역스테인링, 공초점 이미징 및 이미지 분석과 같은 표준 실험 절차로 구성됩니다. 그러나 적절한 기능을 갖춘 모든 이미지 처리 소프트웨어를 사용할 수 있습니다. 제시된 방법은 약리학 처리 또는 최소한의 유전 수정에 의해 가해진 변경을 추적하고 비교할 수 있습니다. 이러한 메서드의 제한된 정밀도로 인해 명확한 값을 얻는 것은 권장되지 않습니다. 많은 이미지의 측정을 용이하게하기 위해 두 개의 자동화 된 매크로가 포함되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32740</td><td>염소 안티 토끼, 1:500</td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>BioShop</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>송아지 피부의 콜라겐</td><td>Sigma</td><td>C9791-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:10000 (H2O에 1 mg/mL 저장), 핵산 염색</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270-136</td><td></td></tr><tr><td>Junction plakoglobin</td><td>Cell Signaling</td><td>2309S</td><td>rabbit, 1:400</td></tr><tr><td>Laminar-flow cabinet class 2</td><td>Alpina</td><td></td><td>standard equipment</td></tr><tr><td>MCF7-basedHAX1KD cell line</td><td>바르샤바의 국립 종양학 연구소(National Institute of Oncology)에서 확립된 세포주, 문헌 [Balcerak et al., 2019</td><td></td><td>MCF7 cell line withHAX1knockdown</td></tr><tr><td>MCF7 cell line (CONTROL)</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td>epithelial, adherent breast cancer cell</td></tr><tr><td>line Olympus CK2 light microscope Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paxillin</td><td>Abcam</td><td>ab32084</td><td>rabbit, 1:250, Y113</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-TRITC conjugate</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>1:400 (DMSO에 5 mg/mL 재고), actin 라벨링</td></tr><tr><td>PTX</td><td>Sigma</td><td>T7402-1MG</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash; NaCl</td><td>시그마</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TBST &ndash; Trizma base</td><td>시그마</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>시그마</td><td>9002-93-11</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM800 컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mcf7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

Quantification of Cell-Substrate Adhesion Area and Cell Shape Distributions in MCF7 Cell Monolayers

여기에 제시된 방법은 여러 개의 적절하게 스테인드 된 공초점 이미지에서 컨런트 셀 단층의 일부 매개 변수를 정량화 : 초점 접착의 수와 크기의 함수로 기판에 접착, 및 세포 모양, 세포 모양 인덱스 및 기타 모양 설명자가 특징입니다. 초점 접착은 팍실린 염색에 의해 시각화되었고 세포 세포 경계는 접합 플라코글로빈과 액틴으로 표시되었다. 세포 배양 및 염색 방법에 대한 방법은 표준이었다; 이미지는 단일 초점 평면을 나타냅니다. 이미지 분석은 공개적으로 이용 가능한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 제시된 프로토콜은 단층의 초점 접착력의 수와 크기와 세포 형상 분포의 차이를 정량화하는 데 사용되지만, 염색될 수 있는 다른 뚜렷한 세포 구조의 크기와 형상의 정량화를 위해 재사용될 수 있다(예를 들어, 미토콘드리아 또는 핵). 이러한 매개 변수를 평가하는 것은 세포 모양에 영향을 미치는 세포 접착력 및 actomyosin 수축도를 포함하여 부착 된 세포 층에서 동적 힘의 특성화에 중요합니다.

초점 접착 분석 HAX1 유전자의 녹다운은 이전에 초점접착6에영향을 미치는 것으로 나타났다. 세포는 콜라겐 I 코팅 표면에 대해 48시간 동안 MCF7 대조구및 MCF7 세포의 HAX1 녹다운(HAX1 KD)을 이용한 3개의 독립적인 실험으로부터 초점 접착 단백질 팍실린으로 염색된 공초점 현미경(기저 부위의 단일 평면 초점/Z 슬라이스의 이미지)을 사용하여 수배하였다.HAX1 각 세포주로부터 약 2,000-2,500개의 세포로부터의 피전에 대해 설명된 프로토콜을 사용하여 정량화하였다. 가장 작은 초점 접착에 대한 평균 값은 50픽셀(픽셀2)으로설정되었습니다. 최종 번호가 매겨진 윤곽선과 원본 이미지와 함께 FA 윤곽선의 오버레이를 포함하여 ImageJ가 포함된 FA 카운트의 대표적인 이미지는 그림 3A의두 셀...

이 기사는 1) 초점 접착의 크기와 수 및 2) 세포 형상 지수및 MCF7 세포의 컨런트 단층의 공초점 이미지로부터의 분포를 정량화하는 것을 설명합니다.

MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

The methods presented here quantify some parameters of confluent adherent cell monolayers from multiple appropriately stained confocal images: adhesion to ...

이 프로토콜을 사용하면 2차원 이미지에서 세포 내 구조의 영역, 둘레 및 모양을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 빠르고 쉽고 표준 실험실 설정과 공초점 현미경만 필요하며 오픈 소스 소프트웨어를 사용합니다. 절차를 시연하는 것은 안나 발세락, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다.4웰 콜라겐 1코팅 챔버 슬라이드에서 잘 배양 배지의 0.5 밀리리터에서 5번째 세포에 4회 10번 을 시드하여 섭씨 37도 및 이산화탄소 인큐베이터 5도에서 24시간 배양한다. 다음 날 아침, 광학 반전 현미경을 사용하여 최소 90% 이상의 컨컬리 단층의 존재를 확인하고 공초점 현미경을 사용하여 단일 Z 슬라이스 이미지를 얻습니다. 초점 접착 해석의 경우 ImageJ에서 이미지를 열고 분석, 설정 축척, 스케일 제거 및 전역을 선택하여 이미지 배율을 픽셀단위로 설정합니다.측정 옵션에 대한 파일 이름과 관심 영역영역을 포함하려면 측정을 분석하고 설정하고 영역을 확인하고 라벨 옵션을 표시합니다. 배경을 빼려면 프로세스를 선택하고 배경을 뺍니다. 롤링 볼 반경을 50픽셀로 설정하고 슬라이딩 포물선형을 확인합니다.관심 영역의 가장 작은 영역을 확인하려면 가장 작은 단일 초점 접착을 설명하고 분석 및 측정을 클릭하여 영역을 측정합니다. 최소 20개의 관심 영역이 선택 및 측정된 경우, 획득된 결과의 평균을 계산하고 저장합니다. 상반신경계를 일반적인 셀 영역의 25%로 설정합니다.이미지를 바이너리로 연결하려면 이미지를 클릭하고 조정 및 임계값을 클릭하고 기본값, 흑백 및 어두운 배경을 확인합니다. 관심 영역의 수와 영역을 측정하려면 파티클을 분석하고 분석하고 픽셀 단위를 확인하고 결과를 표시하고 결과를 지우고 요약합니다. 조각, 개수 및 총 면적 평균 크기 데이터를 요약 창에서 선택한 데이터 관리 프로그램으로 전송합니다.초점 접착 정량화를 위해 초점 접착 ImageJ 매크로를 열고 가장 작은 관심 영역의 영역인 관심 영역의 영역으로 입력합니다. 임계값 유형 값을 수동 또는 자동값으로 설정하고 변경 내용을 저장합니다. 그런 다음 ImageJ에서 매크로를 호출하고 처리할 이미지를 선택합니다.수동 셀 형상 해석의 경우 적절한 이미지 처리 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고 측정할 매개 변수를 선택합니다. 프리핸드 선택 도구를 사용하여 선택되는 접합 단백질로 셀 테두리를 수동으로 설명합니다. 선택한 매개 변수는 각 셀에 대해 자동으로 계산됩니다.모든 셀이 설명되면 편집, 선택 및 관리자에 추가합니다. 중단없는 테두리가 있는 완전히 보이는 셀만 선택해야 합니다. 측정을 하려면 관심 관리자 영역의 왼쪽 상자에 나타나는 모든 숫자를 표시하고 측정을 클릭합니다.결과는 결과 상자에 표시되며 선택한 스프레드시트로 가져올 수 있습니다. 자동화된 세포 분석은 많은 수의 세포의 정량화를 용이하게 합니다. 모든 새 셀 유형에 대해 먼저 매크로를 실행하여 매개 변수를 설정합니다.매크로가 완료되면 셀 크기 경계를 설정합니다. 가장 작고 가장 큰 셀의 레이블을 클릭하고 측정값을 클릭합니다. 가장 작은 셀과 가장 큰 셀 변수의 값을 설정하고 변경 내용을 저장합니다.매크로 창을 모두 닫고 회색 조율로 처리할 이미지를 선택합니다. 그런 다음 매크로를 다시 실행합니다. 매크로는 셀 모양 인덱스, 종횡비 및 관심 영역 목록 데이터를 포함하는 결과 테이블을 제공합니다.여기서, 대조군과 녹다운 세포주 모두에 대한 원본 이미지와 함께 최종 번호가 매겨진 윤곽선 및 초점 접착 윤곽의 오버레이를 포함하여 ImageJ로 계산된 초점 접착의 대표적인 이미지를 관찰할 수 있다. 이 분석에 도시된 바와 같이, 녹다운 세포는 세포세포 조절에 비해 크기가 큰 접착력뿐만 아니라 세포당 더 많은 수의 접착력을 보여 주었다. 이러한 이미지에서, 치료되지 않은 및 화학요법 처리된 세포 단층의 대표적인 영역이 표시됩니다.윤곽도 세포는 그들의 세포 모양 인덱스 값에 따라 특징지어졌으며, 예를 들어 이 분석에서는 치료되지 않은 대조군과 비교하여 약물 처리 된 세포에 대한 마지막 빈및 주요 피크의 평탄화의 증가를 보여주는 분석. 그런 다음 각 세포 배양에 대해 주파수 분포및 누적 분포를 생성할 수 있습니다. 단층의 그레이스케일 이미징은 12개의 시야에서 512개의 세포의 분석 및 정량화를 허용하여 세포 형상 지수의 상대주파수 분포를 드러냈다.이 프로토콜이 작동하려면 최상의 품질의 이미지를 사용하는 것이 중요합니다. 적절한 세포 파종, 염색 및 이미징은 충분한 실험 품질의 이미지를 보장해야 합니다.

quantification-cell-substrate-adhesion-area-cell-shape-distributions

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

우리는 invadopodia로 인한 매트릭스 저하를 시각화를위한 형광 젤라틴으로 코팅 현미경 coverslips를 생산을위한 원형 방법을 설명합니다. 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 전산 기술이 혼합 된 인구 내에 전체 미세 필드를 포함한 다세포 그룹에 대한 하나의 세포 매트릭스 proteolysis의 결과 수준을 정량화를 위해 제공됩니다.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

여기서, 우리는 지속적으로 셀 기판 임피던스와 생균 영상 분석에 의해 비 침습성 방식으로 높은 시간 해상도를 가진 세포 부착 및 디 - 접착 공정을 정량화하는 프로토콜을 제시한다. 이러한 접근은 매트릭스 수정 및 접착 의존성 시그널링 이벤트들이 시간적인 관계에 의해 트리거 세포 접착 / 디 접착 공정의 역학을 보여준다.

매트릭스 수정에 의해 유도 된 세포 접착 및 탈 부착의 실시간 변화를 측정 셀 기판 임피던스와 라이브 세포 이미징을 사용하여

우리는 내피 세포 단층 내에서 접착 세포의 실제 수를 정량화할 수 있는 시험관 내 방법을 보고합니다.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

세포 분화를 모두 매트릭스 조성물과 기판의 재료 특성을 포함한 미세 환경 요인의 호스트에 의해 조절된다. 우리는 여기에 세포 분화 및 미세 환경 콘텍스트의 함수로서 생체 역학적 세포 기질 상호 작용 모두를 평가 견인력 현미경과 함께 세포의 마이크로 어레이를 이용하는 방법을 설명한다.

세포 분화 및 견인 힘의 상관 관계 분석을위한 높은 처리량 세포 마이크로 어레이 플랫폼

이 연구는 유틸리티 양적 세포 막 확장 측정 및 셀의 접착 능력의 상관 관계의 용이성을 보여 줍니다. 대표적인 예로 우리 보여 여기 그 Dickkopf 관련 단백질 3 (DKK3) 증가 lobopodia 형성을 촉진 하 고 adrenocortical 암 접착 력 셀 세포 생체 외에서.

세포 막 확장 하 고 공부 하는 암 세포 접착 역동성에 있는 그들의 역할의 특성

HMCA 기반 이미징 접시 침공 분석 결과 성능을 위해 제공 됩니다. 이 접시는 spheroids 3 차원 (3D) 종양의 형성과 기질 (ECM)에 암 세포의 측정을 촉진 한다. 침공 분석 결과 정량화 자동 분석 함으로써 이루어집니다.

암 세포 침입과 반대로 전이성 마약 히드로 마이크로-챔버 배열 (HMCA)를 사용 하 여 심사 분석-플레이트를 기반으로

여기서, 우리는 림프절 (LN) 저온 절에 접착제 종양 세포의 정량화를 허용하는 간단하고 저렴한 방법을 설명합니다. LN 부착 종양 세포는 가벼운 현미경 검사법에 의해 용이하게 규각되고 형광 기반 방법에 의해 확인되며, LN parenchyma에 종양 세포 결합 친화도를 드러내는 접착 지수를 제공합니다.

림프절 저온 절에서 종양 세포 접착의 정량화

이 프로토콜은 빠른 세포 롤링 접착 중에 접착 이벤트를 이미지화하기 위해 접착 발자국 분석기를 수행하는 실험 절차를 제시합니다.

접착 발자국 분석에 의한 세포 압연의 이미징 분자 접착

학습하세요 MCF7 세포 단층층에서 공초점 현미경과 ImageJ를 이용한 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 지수 정량화 방법을. 이 기법은 암 생물학 연구에서 세포 형태학과 기계적 특성 분석에 활용됩니다.

MCF7 세포 단층층의 세포 기판 접착 영역 및 세포 모양 분포의 정량화

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