특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭
2020년 5월 29일
RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.
유전자 편집이 비 모델 유기체의 분자 유전학을 연구하는 데 인기를 끌고 있더라도 RNAi는 여전히 강력한 시너지 도구로 남아 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 발달 단계에 적용 할 수 있다는 것입니다. 또한 부분 적인 녹다운이 전체 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
절차의 성공은 DSR의 주입과 최소한의 해를 갖는 것에 의존합니다. 이것은 연습이 필요하므로 올바르게 얻기 위해 몇 번의 시도가 필요하다면 낙담하지 마십시오. 마이크로 주입을 위한 초기 단계 배아를 준비하기 위하여는, 먼저 끓는 20% 아가로즈를 작은 페트리 접시에 붓고 액체 아가로즈의 표면에 3개의 1~2밀리미터 넓은 플라스틱 튜브를 놓습니다.
아가로즈가 고화되면 한 쌍의 무딘 집게를 사용하여 튜브를 제거하고 500 마이크로리터의 오토클레이브 증류수로 그 결과 들여쓰기를 덮습니다. 수집 용기가 준비되면 미세한 천연 헤어 페인트 브러시를 사용하여 딱정벌레 중첩 부위에서 5 개의 8 시간 된 T.marmoratus 배아를 스테레오 현미경으로 오토 클레이브 증류수로 채워진 유리 캐비티 접시로 옮긴다. 현미경과 미세 해부 집게를 사용하여 양쪽에서 각 배아의 초리온을 파악하고 초리온을 찢어 서 태아가 조직에서 부드럽게 미끄러질 수 있도록 합니다.
수집된 모든 배아로부터 두 초리온 층을 모두 제거한 후 페인트브러시를 사용하여 유리 캐비티 접시에서 배아를 준비된 아가로즈 플레이트의 홈으로 조심스럽게 이송한다. 유전자 특정 이중 좌초 RNA를 가진 초기 단계 배아를 먼저 바늘 펄러에 미세 주입 바늘을 준비하고 스테레오 현미경을 사용하고 날카로운 가장자리에 각 팁을 깰 집게를 찾을 수 있습니다. 얼음에 관심있는 정제 된 재고 이중 좌초 RNA를 던진 후, 결과 용액에 10X 주입 버퍼의 마이크로 리터 를 추가하고 10 마이크로 리터에 용액의 비닐 볼륨을 가지고 이중 증류수를 사용합니다.
P10 파이펫을 사용하여 제조된 미세 주입 바늘 중 하나를 작동 이중 좌초 RNA 용액으로 채우고 압력 배출 기술을 활용하는 마이크로 주입 시스템에 연결된 마이크로 니들 홀더에 바늘을 로드합니다. 마이크로 주입 시스템과 가압 공기 공급을 켜고 마이크로 주입 시스템의 마이크로 밸브를 사용하여 사각 인치당 15 파운드의 압력으로 분사 압력을 설정한 다음 시간 조정 노브를 사용하여 사출 기간을 초로 설정합니다. 주사 바늘을 보정하기 위해 T.marmoratus 배아를 위해 공기중으로 주입할 때 바늘 끝에서 형성되는 유체 버블의 부피를 평가하여 100~200미크론의 최적의 버블 크기를 사용한다.
주사 바늘은 최적의 거품이 약 3 초의 주입 지속 시간으로 평방 인치 당 압력의 15 파운드에서 달성 될 수 있다면 좋은 품질의. 바늘이 설치되면 바늘이 45 60도 각도로 배아에 접근하는 배아의 아가로즈 플레이트에 바늘을 정렬할 수 있습니다. 마이크로 조작기를 사용하여 마이크로 니들을 천천히 움직여 팁이 한 배아의 중간 표면에 닿을 때까지 조심스럽게 바늘을 앞으로 움직여 배아의 표면을 관통합니다.
일단 바늘이 배아 내부에 있으면 마이크로 인젝터 주입 버튼을 조심스럽게 눌러 이중 좌초 RNA의 1 ~2 나노 리터를 배아로 전달합니다. 모든 RNA가 전달되었을 때 배아가 파열되는 원인이되지 않고 천천히 배아에서 바늘을 철회한다. 성공적으로 주입된 배아는 주사 부위에 착색된 반점이 존재하여 확인할 수 있다.
모든 배아가 신중하게 주입되었을 때 4 ~5 일 동안 14 시간 빛 10 시간 암흑 주기로 설정 된 섭씨 25도의 습도 챔버에 접시를 배치합니다. 입체적으로 보이는 녹다운 표현형을 식별하기 위해 스테레오 현미경하에서 매일 배아 발달 진행 상황을 모니터링한다. 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 개발 프로세스를 문서화합니다.
잠복기 동안 다른 생존 배아에 미생물 오염의 확산과 건조및 확산을 피하기 위해 죽은 배아를 제거하고 매일 아가로즈 플레이트에 물을 보충하십시오. 애벌레를 수집하기 전에 먼저 작은 페트리 접시에 60 ~70섭씨 2 %의 액체 아가로즈를 추가합니다. 아가로즈가 고화되면 무딘 집게를 사용하여 애벌레 당 하나의 얕은 단을 만들어 아가로즈에 주입하고 유충 배양 컵에서 물을 부드럽게 배출한다.
마취 후 부드러운 끝 집게를 사용하여 유충을 홈에 목과 몸체가있는 고정 판에 조심스럽게 배치하지만 아가로즈 표면 위에있는 꼬리를 조심스럽게 배치합니다. 모든 애벌레가 배치되었을 때, 각 용암을 여전히 액체이지만 위험하게 뜨겁지 않은 아가로즈 두께의 아가로즈 층으로 덮어 실수로 필요한 경우 커버한 모든 이야기. 이중 좌초 RNA 미세주입을 위해 마이크로니들및 유전자 특이적 이중 좌초 RNA 작업 용액을 입증한 바와 같이 한다.
수동으로 제어되는 미세 주입 주사기의 플런저를 다시 드래그하고 바늘을 미세 주입 시스템에 로드합니다. 주입 부위가 비교적 평평한 각도로 미세 주입 바늘의 궤적과 정렬되는 등 고정 된 유충을 스테레오 현미경 아래에 배치합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘 끝을 유충으로 조심스럽게 이동하고 천천히 조심스럽게 주사기에 압력을 가하여 필요에 따라 바늘의 유색 주입 유체의 움직임에 따라 주입 압력을 조절합니다.
모든 RNA가 주입되면 아가로즈에서 유충을 풀고 애벌레를 25~28°C의 실온 수와 14시간 빛 10시간 암흑 주기로 배치한다. 이 대표적인 분석에서 세 가지 다른 유전자는 태양 버스트 다이빙 딱정벌레 T.marmoratus의 다양한 발달 단계에서 쓰러졌다. RNA 간섭은 배아 발생의 아주 초기 단계에서 이중 좌초 RNA를 주입하여 입증된 바와 같이 수행됩니다.
일부 배아는 그 과정에서 살아남지 못하고 괴사를 돌립니다. 이러한 이미지에서는 개인을 제어하고 약간 밝은 눈 색깔을 가진 개인을 관찰 할 수 있습니다. 이 개인에서, 클러스터의 더 많은 복부 거짓말이 완전히 색소 침착하지만, 할 동맹국은 여전히 약간의 색소 침착을 보여주는 더 심각한 녹다운.
여기에 모든 눈에 본질적으로 완전한 안료 손실을 가진 다른 개인의 예가 표시됩니다. Lac2는 유충에서 쓰러진 덜 색소 큐티클, 조직의 특이한 부드러움으로 인해 다소 변형된 날개를 가진 가벼운 성인 개인도 얻어졌다. 매일 주입된 동물을 면밀히 관찰하고 죽은 동물을 즉시 제거하기 위해 날카롭게 보아야 합니다.
이 기술의 힘은 많은 다른 유기체의 유전자에 적용 될 수 있다는 것입니다. 이 기술은 또한 널리 성공적으로 진화 발달 생물학에 적용되었습니다.
개요
이 기사는 수생 다이빙 딱정벌레인 Thermonectus marmoratus에서 RNA 간섭(RNAi)의 사용에 대해 상세히 설명하고, 다양한 발달 단계에 걸친 응용을 강조합니다. 이 절차는 이중 가닥 RNA를 준비하여 주입하여 유전자 노크다운을 달성하고, 구조 및 행동과 관련된 유전자 기능을 연구할 수 있게 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 유전학
- 발생 생물학
배경
- RNA 간섭은 유전자 발현을 조작하는 강력한 기술입니다.
- 유기체의 다양한 발달 단계에 적용할 수 있습니다.
- 유전자의 부분적 노크다운을 통해 기능 연구가 가능합니다.
- 성공은 정밀한 미세 주입 기술에 의존합니다.
연구 목적
- T. marmoratus에서 RNAi 기술을 시연합니다.
- 유전자 노크다운을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.
- 딱정벌레의 구조 및 행동에 대한 유전자 조작의 영향을 탐구합니다.
사용된 방법
- 미세 주입을 위한 배아 준비.
- 유전자 특이적 이중 가닥 RNA 주입.
- 배아 발달 및 표현형 변화 모니터링.
- 고해상도 이미징을 사용한 결과 문서화.
주요 결과
- 주사 부위의 색칠된 반점으로 확인된 성공적인 주사.
- 노크다운 표현형을 위한 배아 발달 모니터링.
- 세 가지 다른 유전자가 다양한 발달 단계에서 타겟팅되었습니다.
- 비모델 유기체에서 RNAi의 효과를 입증했습니다.
결론
- RNAi는 T. marmoratus에서 유전자 기능을 연구하는 실행 가능한 방법입니다.
- 성공적인 유전자 노크다운을 위해 신중한 기술이 필수적입니다.
- 이 방법은 유전학 연구를 위해 다른 비모델 유기체에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
RNA interference (RNAi) enables targeted gene knockdown across developmental stages in non-model organisms, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The technique provides quantitative phenotypic readouts that help prioritize therapeutic hypotheses and reduce biological uncertainty before lead identification. Its applicability to organisms with limited genomic resources expands the scope of preclinical models for pathway clarification and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function through stage-specific knockdown to clarify target roles in morphological and behavioral pathways.
- Operational Value: Uses cost-effective transcriptome assembly and common primer systems to generate dsRNA for any gene, reducing target validation timelines.
- Predictive Value: Generates observable phenotypes (e.g., cuticle lightening, eye depigmentation, hunting deficiency) that link genotype to function, supporting go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable phenotypic outputs (e.g., pigment loss, optical defects) suitable for high-content screening workflows.
- Reproducibility: Relies on standardized microinjection protocols and immobilization techniques to ensure consistent dsRNA delivery across developmental stages.
- Scalability: Compatible with embryo and larval injection, enabling parallel testing of multiple genes across time points.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Phenotypic readouts in larval hunting behavior and cuticle formation provide mechanistic insights applicable to neurodevelopmental and structural disorder models.
- Translational Continuity: Supports progression from gene knockdown in invertebrate models to validation in vertebrate systems through conserved pathways (e.g., pigmentation, lens development).
- Risk Mitigation: Partial knockdown capability allows titration of gene suppression to model hypomorphic alleles and assess therapeutic windows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for genes involved in development, pigmentation, and sensory function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene interrogation via temporal knockdown to de-risk targets before assay development.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible dsRNA injection and immobilization, yielding quantifiable phenotypic endpoints.
- Analytics: Generates measurable outputs (e.g., pigment intensity, larval motility, cuticle hardness) that facilitate comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects gene function in T. marmoratus to conserved biological processes, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for functional genomics in non-model organisms, reducing reliance on established genetic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic clarity through stage-specific knockdown, reducing ambiguity in target biology and pathway involvement.
- Operational Value: Standardizes gene suppression workflows via agarose immobilization and microinjection, enhancing reproducibility across labs.
- Strategic Value: Improves target prioritization by linking gene suppression to observable phenotypes, increasing confidence in preclinical advancement.
- Portfolio Impact: Enables early de-risking of targets in understudied organisms, supporting expansion of target space and novel mechanism exploration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, embryo/larva handling, and dsRNA synthesis.
- Dependent on microinjection systems, agarose preparation tools, and stereo microscopy for precise delivery.
- Necessitates standardization of injection pressure, duration, and needle calibration across operators.
- Involves adaptation of immobilization protocols for different developmental stages and species.
- Limited by embryo survival rates and technical skill, requiring optimization for consistent knockdown efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:37
Early stage T. marmoratus Embryo Preparation
1:58
Early Stage T. marmoratus Embryo Double Stranded RNA (dsRNA) Microinjection
5:04
T. marmoratus Larva Preparation
5:58
T. marmoratus Larva dsRNA Microinjection
7:05
Results: Representative Effects of RNA Interference in Aquatic Beetles at Different Developmental Time Points
8:18
Conclusion
