Name: 특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 배우세요 수생 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서 RNA 간섭 기법을 활용한 유전자 발현 조작 방법을. 이 기법은 다양한 발달 단계에서 유전자 기능을 연구하는 데 효과적인 도구입니다.

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우리는 편집 지원을 위해 선버스트 다이빙 딱정벌레와 타마라 페이스를 키우는 데 도움을 준 생물정보학 인 헤일리 토블러 (Hailey Tobler)와의 도움을 준 조쉬 베노이트 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 YT에 대한 IOS-1456757 및 IOS-1856341에 대한 국가 과학 재단에 의해 지원되었습니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

우리의 목표는 이 방법의 편집이 RNAi를 널리 사용할 수 있게 할 것입니다, 특히이 도구는 CRISPR / Cas9 기반 유전자 편집에 강력한 시너지 기술을 유지로, 그것은 연구 된 유기체의 원하는 개발 단계에 적용 될 수 있다는 장점. 이 힘을 예시하기 위하여는, 우리는 dsRNA를 태아로 그리고 다른 애벌레 단계로 주입했습니다. 계란에 주사는 배아의 발달에 영향을 미쳤다(도 2),제 2 애벌레 단계로 주사는 세 번째 애벌레 단계에 명백한 효과를 했다(도 4 및 도 6),세 번째 애벌레 단계로 주사 성인에 미치는 영향을 보여 주었다(도 5). 정확한 타이밍실험적으로 설정 해야 하는 동안, 일반적으로, 주사 는 몇 일 이내에 적용. 이 프로세스의 성공은 dsRNA 서열의 길이에 의해 영향을 받을 수 있다. 여기에서 는 200 bp이상에서 800 bp 이상으로 조금 더 사용하는 예제를 제시했습니다. 일반적으로 100~600bp 사이의 시퀀스는 오프타겟 효과를 제한하는 것이 바람직하지만, 최대 1000bp의 시퀀스는 양호한 결과22를산출한다. RNAi에 관한 한 가지 질문은이 기술을 통해 달성 할 수있는 녹다운의 지속 기간입니다. 표현형은 각 단계에서 단자이기 때문에 제시된 결과에 따라 이 문제에 대해 언급할 수 없습니다. 그러나, 그것은 이전에 RNAi 효과 일반적으로 상대적으로 긴 수명이 다는 것을 지적 되었습니다., 그리고 높은 농도 더 오래 지속 녹다운 이어질20.
이 기술의 한 가지 제한은 다른 생물보다 일부 유기체에 더 잘 작동한다는 것입니다, 그것은 우선 순위가 얼마나 잘 작동하는지 예측하는 직접적인 방법이없는 것 같다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 다른 유기체의 큰 범위에 대 한 잘 작동 발견 되었습니다. 절지동물 내에서, 이것은거미류 26,갑각류27,및 딱정벌레28에서특히 높은 성공률을 가진 곤충의 다양한 포함합니다. 추가 합병증은 표현형 엄격에 있는 다름이 dsRNA의 동일 양의 적용에도 불구하고 개별 사이에서 수시로 생기는다는 것입니다. 도 2B에도시된 바와 같이, 개별 내에서도 변형이 발생할 수 있습니다. T. marmoratus 애벌레 눈 발달에 관련 되 었던 다른 유전자를 대상으로 하는 우리의 RNAi 연구 결과에서는, 우리는 몇몇 눈이 그 외 보다는 더 가혹하게 영향을 된다는 것을 자주 발견했습니다. 이 현상은 dsRNA가 단위의 일부에 더 잘 도달할 수 있는 눈 클러스터의 상대적으로 조밀한 조직과 관련될 수 있습니다.
RNAi 실험의 성공적인 실행을 위해, 몇몇 매개 변수는 표적 유전자를 위해 최적화되는 것이 중요합니다. 예를 들어, dsRNA의 농도와 표적 유전자의 길이는결과(20)에강하게 영향을 미칠 수 있다. 또 다른 중요한 매개 변수는 주사가 실행되는 방법입니다, 이 과정은 크게 생존율에 영향을 미칠 수 있기 때문에. 배아의 경우, 우리는 배아의 중심을 표적으로 삼아 최상의 결과를 달성했습니다. 잘 배치 된 플레이트는 단일 세션에서 100 개 이상의 배아를 주입 할 수 있습니다. 애벌레의 경우 세그먼트 사이에 주사 바늘을 삽입하는 것이 중요합니다. 이러한 주사는 더 많은 dsRNA를 필요로하고, 애벌레 가용성에 따라, 여기에 우리의 주사 세트는 일반적으로 한 번에 몇 동물로 구성. 모든 주사의 경우 공기가 유기체에 유입되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.
경우에 따라, 유전자 규제 네트워크 및 유전 중복성의 피드백 루프는 일관된 녹다운에도 불구하고 RNAi 표현형의 침투에 영향을 미칠 수 있습니다. 이것은 눈에 띄는 렌즈 단백질의 매우 성공적인 녹다운을 가진 애벌레의 우리의 행동 관측에 대한 경우인 것 같다, Lens318. 우리는 qPCR을 통해 이러한 녹다운의 높은 효율을 확인했지만, 관련 표현형에서 상당한 변화가 관찰되었다. 이 결과는 RNAi 넉다운을 적절하게 정량화할 필요성을 강조합니다(옵션에 대한 자세한 내용은22참조). 결과 표현형에 관하여 명확한 우선 순위 기대가 없는 경우에, RNAi의 오프 표적 효력을 통제하는 좋은 쪽은 dsRNA의 2개의 비 겹치는 순서를 가진 동일 유전자를 표적으로 하고 일반적인 표현형에 대한 결과를 평가하는 것입니다.
유전자 편집 기술과는 달리 RNAi는 치명적인 유전자를 연구하기위한 강력한 도구이며 그렇게하는 방법에는 두 가지가 있습니다. 예를 들어, 개발 초기에 기능 상실이 치명적인 것으로 알려진 유전자의 기능적 기여에 관심이 있는 경우, 동물이 정상적으로 발달하도록 허용한 다음 나중에 개발중(즉, 성인)을 통해 유전자를 쓰러뜨리면 이러한 유전자의 기능적 조사를 달성할 수 있다. 대안적으로, 완전한 기능 상실이 치명적인 것으로 알려진 유전자는 부분적인 녹다운을 통해 조사될 수 있으며, 이는 다양한 dsRNA 농도를 주입하여 달성될 수 있다. 우리의 결과 중 일부는 곤충의 큐티클이 지나치게 부드러운24가되면치명적으로 알려진 lac2의녹다운을 보여줍니다. 도 5에 묘사 된 lac2 RNAi 딱정벌레조차도 외부 실험실 조건에서 살아남을 가능성이 낮습니다. 또 다른 치명적인 유전자는 절단되어,절지동물내의 다양한 장기 시스템에서 세포-운명 사양에 대한 근본적인 전사 인자에 대한 코드이며 드로소필라 시각시스템(29)의glia 발달과 관련이 있다. T. marmoratus 배아에서 절단 RNAi에 우리의 경험을 바탕으로, 우리는 그들의 배아 눈 발달을 완료할 수 있는 태아에 있는 유익한 눈 표현형을 불러 일으킬 수 있습니다 (공개되지 않은 관측). 여기, 더 높은 복용량 높은 치 사 율으로 이어질 표시, 낮은 복용량 관찰 및 유익한 표현형 귀 속 하는 동안.
우리의 프로토콜은 연구원이 T. marmoratus에RNAi 실험을 추구하는 데 필요한 단계를 나열할뿐만 아니라 다른 유기체, 특히 수생 생물에도 일반적으로 적용됩니다. 수생 유기체 중, 이미 물 벼룩 다프니아(30 및 새우와 같은 갑각류 안에 몇 가지 예가 있습니다)(최근 검토에 대 한 참조참조 31참조). 수생 곤충 중 충분한 기회가 있다, 그들은 모든 곤충 다양성의 약 6 %를 구성 하는 것으로 추정 되었습니다., 가능성이 이상 200,000 종32. 또한, RNAi는 이미 수중환경의표면에 서식하는 경향이 있는 물 스트라이더(33)에서 수행되었다. 게놈이 존재하지 않는 경우, 전사는 드 노보를 조립 할 수 있습니다. 이 과정이 수백 개의 뉴클레오티드의 연속을 밝히는 한 특정 유전자에 대한 dsRNA를 설계할 수 있습니다. 아가로즈에서 곤충을 고정하기위한 우리의 프로토콜은 특히 부드럽고 가단성 및 수생 생물에 대한 다른 절차에유용 할 것입니다. 종합하면 RNAi는 다른 분자 및 유전 적 도구가 제공되지 않더라도 다양한 유기체 그룹에서 유전자 발현을 조작하기위한 강력한 기술로 남아 있습니다.

특정 유전자가 다양한 특성의 진화에 기여하는 방법의 질문은 생물학에서 흥미로운 주제입니다. 지난 수십 년 동안, 선충 근 사엽다비티스 엘레간,과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터,그리고 집 마우스 무근육1과같은 몇 가지 모델 유기체에서 발달 과정의 유전적 기초를 해부하는 것과 관련하여 많은 진전이 이루어졌습니다. 최근에는 군집된 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/Cas92와 같은 강력한 유전자 편집 기술의 발명은 비모델 유기체의 유전 코드를 변경하는 기능을 제공하였다(예를 들어3,,4참조). 그 결과, 이전에 분자 기술을 통해 접근되지 않았던 다양한 유기체에 대한 유전 적 연구가 급증하고 있습니다. 특정 종에서만 표현되는 흥미로운 특성이나 특성 차이가 있는 우리 동물 왕국의 엄청난 다양성을 고려할 때, 이러한 진전은 진화 발달 생물학("evo-devo") 관련 작업을 위한 흥미로운 시기였습니다. 그러나, 비모델 유기체에 사용할 수 있는 게놈 편집 기술은 적용될 수 있는 발달 시간 점에 관하여 상대적으로 제한됩니다, 특정 유전자가 어떤 특성든지에서 재생하는 역할과 관련있는 시간적 특성을 분별하는 것을 어렵게 만듭니다. 또한, 형질 전환 기술은 종종 생존에 필수적이지 않은 유전자로 제한됩니다 (즉, 녹아웃이 치사증을 초래하지 않습니다). 따라서 유전자 편집 기술이 인기를 끌기 시작했지만, 특정 발달 시점의 다양한 유기체에 적용할 수 있는 효과적인 기술이 필요하며 부분적인 녹다운을 용이하게 할 필요가 있다(완전한 기능 상실보다는). 여기서는 유전자 편집에 대한 시너지 접근법으로서 특히 귀중한 다소 오래된 강력한 유전자 녹다운 기술5인 RNA 간섭(RNAi)에 주목합니다. 특히, 우리는 RNAi를 수중 다이빙 딱정벌레에 적용할 수 있도록 하는 절차를 개발하여 필요한 분자 서열의 획득에서부터 계란과 애벌레에 이중 좌초 RNA(dsRNA)를 성공적으로 주입하는 것까지 이 기술의 구현을 보여주는 예로서 개발했습니다.
RNAi 기반 유전자 녹다운은 dsRNA 분자가 바이러스 및 트랜스포슨6과같은 핵산 서열침을 침전시키는 것을 용이하게 하는 유기체의 타고난 방어 메커니즘을 활용한다. 간단히 말해서, dsRNA는 디커 효소에 의해 20-25 뉴클레오티드 조각으로 절단되는 세포로 채택됩니다. 이러한 조각들은 RNA 유도 침묵 복합체(RISC)의 형성을 활성화시켜, 이는 가이드 가닥을 사용하여 특정 부위에 결합하여 표적 mRNA를 억제한다. 이 과정은 궁극적으로 mRNA 분해로 이어지므로 mRNA를 각 단백질6으로변환하는 것을 방해한다. 여기에서 제출된 RNAi 기지를 둔 유전자 녹다운 기술은 그러므로 dsRNA의 주입에 의지합니다. 동물 모델의 경우, 이 기술은 원래 C. elegans7 및 D. 멜라노가스터8에서 개발되었지만 이후 비모델 유기체9,,10에서강력한 기능성 유전 도구로 부상했습니다. 일부 곤충의 매우 효과적인 특성으로 인해 RNAi는 해충 관리11에적용 될 수 있습니다.
연구 도구로서 RNAi는 비전통적인 곤충 모델에서 주요 분자 발달 경로가 어떻게 작동하는지 검사하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타뉴움의 RNAi는 특별히 모양의 날개,12, 13,14및 눈14 15,,16의발달을 예시하는 바와 같이, 그 딱정벌레의 특정 특성에 얼마나 깊이 보존된 유전자가 기여하는지 결정하는 데 중요한 역할을 해왔다., T. 카스타뉴움의 조작의 근간을 뒷받침하는 기술은17에 잘 설명되어 있으며 끈적끈적한 표면에 상대적으로 건조한 계란과 애벌레를 고정시키는 능력에 의존합니다. 그러나 이러한 고정은 Sunburst 다이빙 딱정벌레 열상모라투스와같은 수생 생물의 습한 발달 형태에 대해 가능하지 않다. 많은 비전통적인 모형 유기체에 대한 경우와 같이, 그것은 음부게놈이 부족합니다. 게놈이 없는 유기체에서 유전자 발현을 조작하기 위해, 합리적이고 비용 효율적인 첫 번째 단계는 전사를 생성하고 관련하지만 더 확립된 모델 유기체와의 서열 유사성에 Tribolium 기초하여 관심있는 발현 유전자의 퍼티블 뉴클레오티드 서열을 식별하는 것입니다. Drosophila
여기서, RNAi가 수생 유기체에서 어떻게 사용될 수 있는지 를 보여주기 위하여는, 우리는 먼저 특정 표적 유전자 서열의 확인을 허용하는 RNA 추출 및 전사 생성 및 조립을 위한 프로토콜 및 소프트웨어를 토론합니다. 그런 다음 유전자 특정 dsRNA를 합성하는 데 필요한 단계를 요약합니다. 그 후, 우리는 어떻게 계란수생 환경에서 주입될 수 있는지 설명하고 발전하는 배아를 배양하기 위한 잠복기 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 사산과정에서 애벌레를 완전히 고정하는 데 아가로즈 젤을 어떻게 사용할 수 있는지 를 보여 주며, 다양한 시술 중에 일반적으로 유용하며 다양한 절지동물에 적용될 수 있는 기술이다. RNAi가 다른 발달 단계에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주기 위하여는, 우리는 우리가 태아에 있는 눈 색소 침착 유전자 백색을 침묵하는 예가 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 태닝 유전자 laccase2(lac2)가 두 번째 애벌레 인스타 (세 번째 애벌레 인스타의 애벌레에 영향을 미치기 위해) 및 세 번째 애벌레 인스타 (성인에 영향을 미치는)동안 침묵한 예를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 dsRNA의 낮은 농도의 주입이 부분적인 녹다운으로 이끌어 낸다는 것을 보여줍니다, 이 기술은 또한 기능의 손실이 치명적인 것으로 알려져 있는 유전자에 적용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. RNA 분리 및 de novo transcriptome assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td>University Stockroom</td><td></td><td>일반적으로 연구 기관에서 현지에서 구할 수</td></tr> 있는 <tr><td>피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>크기에 따라</td><td>다른 공급업체의 제품도 동일하게 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit)Qiagen</td><td></td> <td>74804</td><td>자세한 프로토콜은 분</td></tr><tr><td>광 광도계(NnanoDrop)</td>와 함께 제공됩니다.<td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>다른 모델도 동일하게 잘</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 작동합니다<tr><td>1.2. De novo transcriptome assembly.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BUSCO.v3</td><td>https://busco.ezlab.org/</td><td></td> <td>trasncriptome 완전성을 평가하기 위해 무료로 사용할 수 있는 모든 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CLC Genomics 워크벤치</td><td>Qiagen</td><td>832021</td><td>기타 동등한 소프트웨어 패키지도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Galaxy 워크벤치</td><td>https://usegalaxy.org/</td><td></td> <td>오픈 소스 온라인 전사체 어셈블리 및 주석 파이프라인</td></tr><tr><td>NCBI BLASTx</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx</td><td></td><td>오픈 소스 온라인 정렬 및 주석 파이프라인</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2. cDNA 합성, 클로닝 & Miniprep 분리</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨염</td><td>Gibco</td><td>11593-027</td><td>다른 공급업체의 제품도 동일하게 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>LB 육수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘</td></tr> <tr><td>작동합니다.Omniscript RT (reverse trasncription) 키트</td><td>Qiagen</td><td>205111</td><td>자세한 특정 프로토콜은 One Shot&trade 키트와 함께 제공됩니다</td></tr><tr><td>. TOP10 Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>키트와 함께 상세한 특정 프로토콜이 제공됩니다.</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td><td>ThermoFischer</td><td>771471</td><td>자세한 프로토콜이 키트와 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>상세한 특정 프로토콜이 키트와 함께 제공됩니다.</td></tr><tr>셰<td>이커-인큐베이터</td><td>Labnet</td><td>211DS</td><td>다른 모델도 동일하게 잘 작동합니다</td></tr>. 분<tr><td>광 광도계(NnanoDrop)</td><td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr>PCR <td>BioRad</td><td>T100</td><td>용 열 순환기</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>TOPO TA 클로닝 키트</td><td>Invitrogen</td><td>1845069</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal 솔루션</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0941</td> 제품과 함께 제공됩니다. 다른 <td>공급업체의 제품도 동일하게 잘</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 작동합니다<tr><td>2.2 PCR 증폭 및 in vitro dsRNA 합성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>accuSpin Micro 17R</td><td>다른 모델도 동일하게 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>다른 공급업체의 제품도 동일하게 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>FastTaq DNA 중합효소, dNTPack</td><td>Roche</td><td>13873432</td> 이 키트에는 PCR MEGAclear Transcriiption 클린업 키트<td>에 필요한 모든 시약이 포함되어</td></tr> 있습니다. <tr><td></td><td>ThermoFischer</td><td>AM1908</td><td>자세한 프로토콜이 키트</td></tr><tr><td>와 함께 제공됩니다.MEGAscript T7 전사 키트</td><td>ThermoFischer</td><td>AM1334</td> 핵분해효소가 없는 물 <td>키트와 함께 상세한 특정 프로토콜이 제공됩니다</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9932</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>자세한 특정 프로토콜은</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td> 키트와 함께 제공됩니다. <td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td>3M 작업 솔루션</td></tr><tr><td>만들기 분광 광도계 (NnanoDrop)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>9836674</td><td>다른 모델도 똑같이 잘</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 작동합니다 <tr><td>< 강력 한>3. dsRNA 주입을 위한 초기 단계 T. marmoratus 배아를 수집하고 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>다른 공급업체의 제품은 증류</td></tr><tr><td>수</td><td>Fisher Scientific</td><td>9180</td><td>제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>. 겸자(Dumon #4 Biology)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11242-40</td><td>다른 공급 업체의 제품은 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>유리 캐비티 접시 (3 웰 디쉬)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>50-243-43</td><td>다른 공급 업체의 제품은 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>전자 레인지</td><td>Welbilt</td><td>턴테이블</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>천연 헤어 페인트 브러시</td><td>아마존</td><td></td><td>모든 미세 브러시는</td></tr><tr><td>P1000 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>실체 현미경</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>모든 좋은 실체 현미경이 작동합니다</td></tr><tr><td>. 전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-200-109</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>작동합니다.</td></tr><tr><td>4. 초기 단계의 dsRNA 마이크로 주입 T. marmoratus 배아</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital 카메라</td><td>Edmund optics (Qimaging)</td><td>Retiga 2000R</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. <tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. 식품 <tr><td>염료</td><td>Kroger</td><td></td><td>사용 가능한 모든 식품 염료는 작업 미세</td></tr><tr><td>습도 챔버</td><td></td><td></td><td>뚜껑이 있는 플라스틱 상자를 가져다가 70% 에탄올로 살균하고 건조시킵니다</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Labline</td><td>203</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>주입 완충액</td><td></td><td></td><td>참조 #22에 따라 1mL 준비 : 믹스 10 &마이크로; 0.1 M 인산나트륨 완충액의 L, 100 &micro; 0.5 M 염화칼륨 용액의 L, 100 &마이크로; L의 식용 염료 및 790 &micro; 이중 증류수의 L. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>세포 내 미세 주입 시스템(Picospritzer)</td><td>Parker</td><td>052-0500-900</td><td>현재 모델 III을 사용할 수 있지만 이전 모델도</td></tr><tr><td>마이크로 바늘 홀더</td><td>A-M 시스템</td><td>672441</td><td>다른 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>미세 주입 바늘(1.2mm x 0.68mm, 4인치)</td><td>A-M 시스템</td><td>603000</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr>. 마이크로 <tr><td>매니퓰레이터</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-024-R</td><td>모든 품질의 미세 조작기는</td></tr><tr><td>인산 나트륨</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-80-7</td><td>10 mL의 1 M 작업 용액을 만들기 위해 : 1.2 g의 인산 나트륨 분말을 이중 증류수 10 mL에 넣고 맑은 용액이 얻어질 때까지 혼합합니다</td></tr><tr><td>P-1000 마이크로 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td>풀러 설정: 히트 575, 풀 60, 벨로시티 75, 지연 110, 압력 700.</td></tr><tr><td>P10 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>P1000 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr>염화<td>칼</td>륨 <td>Fischer scientific</td><td>7447-40-7</td><td>0.5M 염화칼륨 용액 100mL를 만들려면 : 이중 증류수 100mL에 염화칼륨 결정 3.73g을 넣고 맑은 용액이 얻어질 때까지 혼합합니다.</td></tr><tr><td>인산나트륨 완충액 (0.1M)</td><td></td><td></td><td>이 완충액 0.1M 10mL를 만들려면 : 1M 인산나트륨 이염기성 용액 8.5mL와 1M 인산나트륨 용액 1.5mL를 혼합합니다. pH 측정기로 pH를 확인하고 실온에서 pH 7.6으로 적절하게 조정합니다.</td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염 기성</td><td>Fischer scientific</td><td>7558-79-4</td><td>10 mL의 1 M 작업 용액을 만들려면 : 1.42 g의 인산 나트륨 이염기성 분말을 10 mL의 이중 증류수에 첨가하고 맑은 용액이 얻어질 때까지 혼합</td></tr>합니다. 실<tr><td>체 현미경</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>모든 좋은 실체 현미경이 작동합니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>.<강한>5. dsRNA 주사를 위한 T. marmoratus 유충 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>9012-36-6</td><td>다른 공급업체의 제품은 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>겸자(Dumon #4 Biology)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11242-40</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>다른 공급업체의 제품도 똑같이 잘</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 작동합니다<tr><td><강함>6. T. marmoratus 유충의 dsRNA 미세 주입</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>주입 완충액(10개)</td><td></td><td></td><td>섹션 4</td></tr><tr><td>미세 주입 바늘(1.2mm x 0.68mm, 4인치)</td> 참조<td>AM 시스템</td><td>603000</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>. 주사기</td><td>A-M 시스템</td><td>603000</td><td>다른 모델도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>마이크로 니들 홀더</td><td>A-M 시스템</td><td>672441</td><td>다른 제품들도 똑같이 잘 작동합니다</td></tr><tr><td>P-1000 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td>풀러 설정: 열 575, 당김 60, 속도 75 지연 110, 압력 700.</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Microsocope Central</td><td>10446293</td><td>좋은 실체현미경이라면 누구나 작동합니다</td></tr></tbody></table>.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 rna 간섭

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA 간섭(RNAi)은 mRNA 분해를 통해 유전자 발현의 표적 감소를 허용하는 강력한 기술로 남아 있다. 이 기술은 다양한 유기체에 적용 가능하며 종이 풍부한 순서인 Coleoptera(딱정벌레)에서 매우 효율적입니다. 여기에서, 우리는 새로운 유기체에서 이 기술을 개발하기 위한 필요한 단계를 요약하고 수생 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus의 다른 발달 단계에 그것의 응용프로그램을 설명합니다. 표적 유전자 서열은 알려진 유전체학 또는 드 노보와 가까운 상대에 대한 전사의 조립을 통해 비용 효율적으로 얻을 수 있다. 후보 유전자 복제는 단일 공통 프라이머를 사용하는 모든 유전자에 대해 이중 좌초 RNA(dsRNA)의 합성을 허용하는 특정 복제 벡터(pCR4-TOPO 플라스미드)를 활용한다. 합성된 dsRNA는 나중에 발달 프로세스를 위한 초기 발달 프로세스 또는 애벌레를 위한 태아 로 주입될 수 있습니다. 그런 다음 RNAi가 아가로즈의 고정화를 사용하여 수생 유충에 주입될 수 있는 방법을 설명합니다. 이 기술을 입증하기 위해 RNAi 실험의 몇 가지 예를 제공하여 예측된 표현형으로 특정 녹다운을 생성합니다. 구체적으로, 선탠 유전자 락케이스2에 대한 RNAi는 애벌레와 성인 모두에서 큐티클 번개로 이어지며, 눈 색소 침착 유전자를 위한 RNAi는 안구에서 색소 침착의 번개/부족을 일으킵니다. 또한, 키 렌즈 단백질의 넉다운은 광학 결핍과 먹이를 사냥하는 능력을 감소케하는 애벌레로 이어집니다. 결합, 이러한 결과는 단지 전사 데이터베이스와 유기체의 형태학적 패턴과 행동 특성을 조사하기위한 도구로 RNAi의 힘을 예시.

상술한 프로토콜을 사용하여, 우리는 3개의 다른 유전자, 즉 백색, 락케이스2(lac2) 및 Lens3(표 1)를선버스트 다이빙 딱정벌레 T. 마마라투스의다양한 발달 단계에서 쓰러뜨렸다.lac2 우리는 배아 발생 중 매우 초기 단계에서 dsRNA를 주입하여 T. marmoratus에서 RNAi를 수행(도 1A). 일부 배아는 공정에서 살아남지 못하고 괴사(도1B)를돌리기 때문에 남은 배아를 건강하게 유지하기 위해 제거해야 합니다. 여기에서 예시된 것은 백색 유전자에 대하여 dsRNA의 주사입니다. 이 유전자는 Drosophila에서 안료(23)의전구체의 섭취 및 저장에 관여하는 3개의 ATP 결합 카세트(ABC) 수송기 중 하나로 잘 알려져 있다. 따라서 기능 상실로 인해 안색되지 않은 백색 눈 표현형이 발생합니다. 우리의 결과는 T. marmoratus 태아에 있는 정형 하 백색 유전자를 표적으로 하는 dsRNA의 주사가 새로 떠오르는 애벌레에 있는 눈 색소침착의 손실로 이끌어 낸다는 것을 보여줍니다. 이 경우 야생 형 애벌레는 심하게 색소된 눈을 특징으로하며, 흰색의 RNAi 녹다운은 다양한 수준의 감소와 눈 안료의 완전한 제거로 이어집니다. 전반적으로, 우리는 살아남은 태아의 34%에서 눈 착색에 있는 적어도 몇몇 감소를 관찰했습니다 (n = 35). 도 2A는 대조군 개인과 약간 밝은 눈 색깔을 가진 개인을 비교합니다. 도 2B는 개별에서 더 심한 녹다운을 보여 주며, 클러스터의 복부 눈(Eyes 2-5)이 완전히 색소화된 반면, 등쪽 눈은 여전히 약간의 색소 침착을 보여줍니다. 이러한 차이는 녹다운의 효율성이 지역적으로 변화할 수 있는 방법을 강조하며, 이는 조밀한 조직에서 dsRNA 침투의 효능의 차이와 관련이 있을 수 있습니다. 또 다른 개별은 모든 눈에서 본질적으로 완전한 안료 손실을 보여줍니다(그림 2C).
T. marmoratus의애벌레 단계에서 RNAi가 얼마나 잘 작동하는지 조사하기 위해, 우리는 탄닌 유전자 lac2를 제 3 의 별로 몰트로 인해Figure 3며칠 전에 두 번째 인스타 애벌레로 표적으로 하는 dsRNA를 주입하고 제 3 의 별 애벌레의 큐티큘러 착색에 미치는 영향을 평가했습니다. Lac2는 단백질을 산화적으로 유도하여 불용성, 단단하고 어둡게 만드는 페놀로시다제의 일종입니다. 밀가루 딱정벌레 T. 카스타뉴움에서 녹다운은 낮은 복용량에서 밝은 색깔의 개인으로 이끌어 내는 것으로 보였지만 고용량24에서치명적인 것으로 간주됩니다. 그림 4는 이 치료법이 밝은 색상의 선버스트 다이빙 딱정벌레 애벌레로 이어진다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 본 실험에서, 살아남은 주입된 애벌레의 75%(n=12)는 색소침착을 감소하였다(대조군내 0%에 비해). 도 4A는 비교적 온화한 탈색을 가진 개별을 나타내고, 도 4C는 표피의 어두운 착색이 거의 없는 T. marmoratus 애벌레의 머리를 보여줍니다. 탈색은 이러한 애벌레에 대한 전형적인 중앙 어두운 패터닝에 특히 분명했지만,이 패턴은 제어 주입 된 개인(도 4B)에서명확하게 볼 수 있었습니다. 또한, 도 4D에묘사된 바와 같이 꼬리 기관체의 번개가 관찰되었다. lac2 dsRNA가 제3의 인스타 애벌레로 주입된 경우, 가벼운 성인 개인이 얻어졌다(도5). 낙엽 딱정벌레의 날개는 특이한 부드러움으로 인해 다소 변형되어 있습니다.
형태학적 특성을 변경하는 것 외에도 RNAi를 사용하여 행동에 영향을 미치는 유전자를 대상으로 할 수 있습니다. 이를 입증하기 위해, 우리는 주요 렌즈 단백질 코딩 유전자에 대하여 RNAi를, Lens318,제 3 성급 애벌레 눈의 광학 적특성에 영향을 미치기 위하여 제2 별 애벌레로 주입했습니다. 여기서 관찰되는 렌즈에 미치는 영향은 T. marmoratus 애벌레의 눈이 이 전환에서 주요 눈 성장을 겪기 때문에 가능성이 높으며, 이는 또한렌즈(25)의주요 광학 변화를 수반한다. 이 실험에서 RNAi 넉다운은 매우 효율적이였습니다. qPCR을 통한 검증은 100% 성공률을 보였습니다. 13명의 시험된 개별 중 12명은 대조군 개인의 발현 수준의 10% 미만으로 쓰러졌으며, 나머지 개인은 대조군 수준의 17%(미공개 관찰)의 발현 수준을 갖는 것으로 나타났다. 현상 수준에서, 일부 개인은 심각하게 장애가 또는 먹이 캡처의 무능력했다, 반복적으로 매우 가까운 거리에서 먹이를 접근하지만 지속적으로 오버 샷 개인에 대한 그림 6에 설명된 바와 같이.
표 1: 화이트, 락2 및 Lens3 단백질을 위한 프라이머 서열 및 앰플리콘. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61477/Table1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig01.jpg"> 그림 1: 배아 주사의 그림. (A)dechorionated 배아는 아가로즈 플레이트에 줄지어 있고 dsRNA와 식품 염료 함유 주입 버퍼로 채워진 미세 주입 바늘을 사용하여 그들의 센터 근처에 주입. 스케일 바는 500 μm을 나타냅니다. (B)더 심한 넉다운을 가진 개인. 주입된 배아는 습도 챔버에 보관되고 표현형을 채점하고 죽은 개인을 제거하기 위해 매일 모니터링됩니다 (갈색으로 변함). 배율 막대는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig01large.jpg" target="_blank">5mm를 나타냅니다.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig02.jpg"> 그림 2: 완전히 발달된 배아의 예로, 백색에 대하여 dsRNA로 주입되었다. (A)눈 색소 침착의 감소를 가진 개인의 비교(왼쪽) 및 제어 주입 된 개별 (오른쪽). E1-E6은 눈 1-6을 참조하십시오. (B)더 심한 녹다운 표현형을 가진 개인은 때때로 클러스터 내의 눈 중 일부가 다른 사람보다 녹다운에 의해 더 심각하게 영향을 받는다는 것을 보여줍니다. (C)눈 색소 침착의 거의 완전한 손실을 가진 개인. 스케일 바는 200 μm을 나타냅니다. 패널 B와 C는 동일한 축척으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig03.jpg"> 그림 3: 애벌레 주사의 그림. (A)꼬리 첨탑이 아가로즈를 제거한 2%의 아가로즈에 내장하여 고정된 여러 애벌레. (B)그 팁이 두 세그먼트 사이의 미세 멤브레인을 관통 할 수 있도록 배치 된 사출 용액을 포함하는 마이크로 전극. (C)주입 후 주사 부위에 보이는 청색 사출 염료. 배율 막대는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig03large.jpg" target="_blank">1cm를</a> 나타냅니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig04.jpg"> 도 4: 랑카2용 RNAi는 제3의 인스타 애벌레에서 큐티클 착색을 감소시켜 제2인스타 애벌레에 적용한다. (A)대조군 주입 개인(상단)과 비교했을 때 lac2 RNAi 개별(아래)에서 착색의 비교적 가벼운 손실. 스케일 바는 5mm를 나타낸다.(B)헤드의 중앙에 특징적인 어두운 색 패턴을 보여주는 대조군 개별의 헤드. (C)중앙 머리 착색의 거의 완전한 손실로 이어지는 lac2의 상대적으로 심각한 넉다운. (D)제어 주입 개인(상단)과 비교했을 때 lac2 RNAi 개별(아래)의 주요 꼬리 표절에서 착색의 손실. B\u2012D의 스케일 바는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig04large.jpg" target="_blank">1mm를 나타냅니다.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig05.jpg"> 그림 5: 락카2용 RNAi는 제3의 인스타 애벌레에 적용되어 성인의 표피 색이 감소시됩니다. 녹다운 개인(왼쪽)은 컨트롤(오른쪽)과 비교할 때 매우 부드러운 엘리트라가 특징입니다. 배율 막대는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig05large.jpg" target="_blank">5mm를 나타냅니다.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61477/61477fig06.jpg"> 그림 6: 먹이 포획의 결핍으로 이어지는 주요 렌즈 단백질의 넉다운. (A-C). RNAi를 통해 광학 적자를 유도한 Sunburst 다이빙 딱정벌레 애벌레가 먹이(모기 애벌레)를 포획할 수 없었던 세 가지 예. 대표적인 스틸 이미지는 특징적인 먹이 캡처의 비디오 녹화에서 선택되었습니다. (D)먹이 잡기 애벌레 를 제어합니다. 모든 축척 막대는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61477/61477fig06large.jpg" target="_blank">2cm를</a> 나타냅니다.

RNA 간섭은 특정 발달 단계에서 유전자 발현을 조작하기 위한 널리 적용가능하고 강력한 기술입니다. 여기서, 우리는 수중 다이빙 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서이 기술을 구현하기 위한 필요한 단계를 기술합니다, 구조 또는 행동에 영향을 미치는 유전자의 녹다운에 유전자 의 취득에서.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

유전자 편집이 비 모델 유기체의 분자 유전학을 연구하는 데 인기를 끌고 있더라도 RNAi는 여전히 강력한 시너지 도구로 남아 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 발달 단계에 적용 할 수 있다는 것입니다. 또한 부분 적인 녹다운이 전체 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.절차의 성공은 DSR의 주입과 최소한의 해를 갖는 것에 의존합니다. 이것은 연습이 필요하므로 올바르게 얻기 위해 몇 번의 시도가 필요하다면 낙담하지 마십시오. 마이크로 주입을 위한 초기 단계 배아를 준비하기 위하여는, 먼저 끓는 20% 아가로즈를 작은 페트리 접시에 붓고 액체 아가로즈의 표면에 3개의 1~2밀리미터 넓은 플라스틱 튜브를 놓습니다.아가로즈가 고화되면 한 쌍의 무딘 집게를 사용하여 튜브를 제거하고 500 마이크로리터의 오토클레이브 증류수로 그 결과 들여쓰기를 덮습니다. 수집 용기가 준비되면 미세한 천연 헤어 페인트 브러시를 사용하여 딱정벌레 중첩 부위에서 5 개의 8 시간 된 T.marmoratus 배아를 스테레오 현미경으로 오토 클레이브 증류수로 채워진 유리 캐비티 접시로 옮긴다. 현미경과 미세 해부 집게를 사용하여 양쪽에서 각 배아의 초리온을 파악하고 초리온을 찢어 서 태아가 조직에서 부드럽게 미끄러질 수 있도록 합니다.수집된 모든 배아로부터 두 초리온 층을 모두 제거한 후 페인트브러시를 사용하여 유리 캐비티 접시에서 배아를 준비된 아가로즈 플레이트의 홈으로 조심스럽게 이송한다. 유전자 특정 이중 좌초 RNA를 가진 초기 단계 배아를 먼저 바늘 펄러에 미세 주입 바늘을 준비하고 스테레오 현미경을 사용하고 날카로운 가장자리에 각 팁을 깰 집게를 찾을 수 있습니다. 얼음에 관심있는 정제 된 재고 이중 좌초 RNA를 던진 후, 결과 용액에 10X 주입 버퍼의 마이크로 리터 를 추가하고 10 마이크로 리터에 용액의 비닐 볼륨을 가지고 이중 증류수를 사용합니다.P10 파이펫을 사용하여 제조된 미세 주입 바늘 중 하나를 작동 이중 좌초 RNA 용액으로 채우고 압력 배출 기술을 활용하는 마이크로 주입 시스템에 연결된 마이크로 니들 홀더에 바늘을 로드합니다. 마이크로 주입 시스템과 가압 공기 공급을 켜고 마이크로 주입 시스템의 마이크로 밸브를 사용하여 사각 인치당 15 파운드의 압력으로 분사 압력을 설정한 다음 시간 조정 노브를 사용하여 사출 기간을 초로 설정합니다. 주사 바늘을 보정하기 위해 T.marmoratus 배아를 위해 공기중으로 주입할 때 바늘 끝에서 형성되는 유체 버블의 부피를 평가하여 100~200미크론의 최적의 버블 크기를 사용한다.주사 바늘은 최적의 거품이 약 3 초의 주입 지속 시간으로 평방 인치 당 압력의 15 파운드에서 달성 될 수 있다면 좋은 품질의. 바늘이 설치되면 바늘이 45 60도 각도로 배아에 접근하는 배아의 아가로즈 플레이트에 바늘을 정렬할 수 있습니다. 마이크로 조작기를 사용하여 마이크로 니들을 천천히 움직여 팁이 한 배아의 중간 표면에 닿을 때까지 조심스럽게 바늘을 앞으로 움직여 배아의 표면을 관통합니다.일단 바늘이 배아 내부에 있으면 마이크로 인젝터 주입 버튼을 조심스럽게 눌러 이중 좌초 RNA의 1 ~2 나노 리터를 배아로 전달합니다. 모든 RNA가 전달되었을 때 배아가 파열되는 원인이되지 않고 천천히 배아에서 바늘을 철회한다. 성공적으로 주입된 배아는 주사 부위에 착색된 반점이 존재하여 확인할 수 있다.모든 배아가 신중하게 주입되었을 때 4 ~5 일 동안 14 시간 빛 10 시간 암흑 주기로 설정 된 섭씨 25도의 습도 챔버에 접시를 배치합니다. 입체적으로 보이는 녹다운 표현형을 식별하기 위해 스테레오 현미경하에서 매일 배아 발달 진행 상황을 모니터링한다. 고해상도 디지털 카메라를 사용하여 개발 프로세스를 문서화합니다.잠복기 동안 다른 생존 배아에 미생물 오염의 확산과 건조및 확산을 피하기 위해 죽은 배아를 제거하고 매일 아가로즈 플레이트에 물을 보충하십시오. 애벌레를 수집하기 전에 먼저 작은 페트리 접시에 60 ~70섭씨 2 %의 액체 아가로즈를 추가합니다. 아가로즈가 고화되면 무딘 집게를 사용하여 애벌레 당 하나의 얕은 단을 만들어 아가로즈에 주입하고 유충 배양 컵에서 물을 부드럽게 배출한다.마취 후 부드러운 끝 집게를 사용하여 유충을 홈에 목과 몸체가있는 고정 판에 조심스럽게 배치하지만 아가로즈 표면 위에있는 꼬리를 조심스럽게 배치합니다. 모든 애벌레가 배치되었을 때, 각 용암을 여전히 액체이지만 위험하게 뜨겁지 않은 아가로즈 두께의 아가로즈 층으로 덮어 실수로 필요한 경우 커버한 모든 이야기. 이중 좌초 RNA 미세주입을 위해 마이크로니들및 유전자 특이적 이중 좌초 RNA 작업 용액을 입증한 바와 같이 한다.수동으로 제어되는 미세 주입 주사기의 플런저를 다시 드래그하고 바늘을 미세 주입 시스템에 로드합니다. 주입 부위가 비교적 평평한 각도로 미세 주입 바늘의 궤적과 정렬되는 등 고정 된 유충을 스테레오 현미경 아래에 배치합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘 끝을 유충으로 조심스럽게 이동하고 천천히 조심스럽게 주사기에 압력을 가하여 필요에 따라 바늘의 유색 주입 유체의 움직임에 따라 주입 압력을 조절합니다.모든 RNA가 주입되면 아가로즈에서 유충을 풀고 애벌레를 25~28°C의 실온 수와 14시간 빛 10시간 암흑 주기로 배치한다. 이 대표적인 분석에서 세 가지 다른 유전자는 태양 버스트 다이빙 딱정벌레 T.marmoratus의 다양한 발달 단계에서 쓰러졌다. RNA 간섭은 배아 발생의 아주 초기 단계에서 이중 좌초 RNA를 주입하여 입증된 바와 같이 수행됩니다.일부 배아는 그 과정에서 살아남지 못하고 괴사를 돌립니다. 이러한 이미지에서는 개인을 제어하고 약간 밝은 눈 색깔을 가진 개인을 관찰 할 수 있습니다. 이 개인에서, 클러스터의 더 많은 복부 거짓말이 완전히 색소 침착하지만, 할 동맹국은 여전히 약간의 색소 침착을 보여주는 더 심각한 녹다운.여기에 모든 눈에 본질적으로 완전한 안료 손실을 가진 다른 개인의 예가 표시됩니다. Lac2는 유충에서 쓰러진 덜 색소 큐티클, 조직의 특이한 부드러움으로 인해 다소 변형된 날개를 가진 가벼운 성인 개인도 얻어졌다. 매일 주입된 동물을 면밀히 관찰하고 죽은 동물을 즉시 제거하기 위해 날카롭게 보아야 합니다.이 기술의 힘은 많은 다른 유기체의 유전자에 적용 될 수 있다는 것입니다. 이 기술은 또한 널리 성공적으로 진화 발달 생물학에 적용되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.

Zebrafish 태아의 mRNA와 Morpholino의 안티 센스 Oligonucleotides의 Microinjection.

RNA 간섭은 유전자의 기능을 분석하는 매우 효과적인...

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

RNA 간섭 (RNAi의) 기반의 유전자 녹다운 기술은 Tribolium 연구의 핵심이다. 여기서 우리는 Tribolium의 castaneum 우리의 애벌레의 RNAi 기술에 대한 개요를 제공합니다. 애벌레의 RNAi 연구자들이 다양한 상황에서 유전자의 기능을 연구 할 수 있도록, 기능 상실 표현형에 대한 빠른 액세스를 제공하는 간단하지만 강력한 기술이다.

레드 밀가루 딱정벌레의 애벌레 RNA 간섭, Tribolium castaneum

RNA interference (RNAi)는 유전자 기능을 밝히는 데 매우 유용한 도구입니다. 그러나 성체 이전 단계에서 RNAi를 사용하여 유전자를 표적으로 하는 능력은 주요 인간 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae에서 제한됩니다. 번데기 발달 중 직접 주입을 통해 유전자 기능을 감소시키는 RNAi 프로토콜에 대해 설명합니다.

에 RNAi의 트리거 배달<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</em&gt; 번데기

트랜스 제닉 조작 게놈 편집 기능적 유전자 및 시스 - 규정 요소의 역할을 테스트하기 위해 중요하다. 여기에 (TOL2 매개 형광 리포터 유전자 구조, TALENs 및 CRISPRs 포함) 유전자 변형의 발생에 대한 자세한 미세 주입 프로토콜은 긴급 모델 물고기의 큰가시 고기에 대한 표시됩니다.

Threespine 큰가시 고기과에 형질 전환 및 게놈 편집에 대한 미세 주입

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

여기서, 우리는 NASOnia vitripennis에 있는 효율적인 pupal 및 성인 주사를 위한 방법을 태아 micro주입에 접근하는 대안으로, RNA 간섭 (RNAi) 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 유전자 녹아웃을 통해 RNA 침묵을 사용하여 관심있는 유전자의 기능적 분석을 가능하게 하는 방법을 기술합니다.

나소니아 vitripennis에서 RNAi와 CRISPR 유전자 편집을위한 푸팔과 성인 주사

우리는 청색 꼬리 댐을 사용하여 주문 오도나타 (잠자리와 담석)의 곤충에 전기 포기 매개 RNA 간섭에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(이쉬누라 세네갈렌시스: 코나그리니대 : 지고피테라) 및 파이드 스키머 드래곤 플라이(Pseudothems zonata:...

오도나타에서 전기 기화 매개 RNA 간섭 방법

배우세요 수생 딱정벌레 Thermonectus marmoratus에서 RNA 간섭 기법을 활용한 유전자 발현 조작 방법을. 이 기법은 다양한 발달 단계에서 유전자 기능을 연구하는 데 효과적인 도구입니다.

특정 발달 시점에서 유전자 발현을 조작하기 위한 강력한 도구로 수생 딱정벌레의 RNA 간섭

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