루프 매개 이소르말 증폭을 사용하여 관개물에서 피토프토라 캡시 검출
2020년 6월 25일
현장이나 실험실에서 분석할 수 있는 루프 매개 이더스말 증폭(LAMP) 분석과 결합된 필터 종이 DNA 추출 방법을 사용하여 수원에서 피토프토라 캡시 동물원을 검출하는 방법을 개발했습니다.
식물 병원균 검출은 식물 성 질병 관리에 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 일반적인 수인성 전투기 병원균으로 인한 관개 수질 오염을 위한 신속한 검출 방법을 제공한다. 이 기술을 사용하여, Phytophthora capcici와 같은 특정 병원체는 현장에 남아있는 동안 관개 물의 우리의 큰 양에서 처리되고 급속하게 검출될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 오웬 허드슨, 내 실험실에서 석사 학생, 수미야 왈리울라, 박사 Pingxi G의 실험실에서 박사 후 연구원은 관개 물에 현장 Phytophthora capcici 검출을위한 펌프와 필터를 설정하는 것입니다. 핸드 펌프에 연결된 튜브에 여과 플라스크를 부착하고 여과 플라스크의 입에 고무 스토퍼에 부흐너 깔때기를 장착합니다. 그런 다음 15 미크론 고정 크기와 함께 적절한 크기의 필터 용지를 깔때기에 장착합니다.
물 샘플을 얻으려면 대상 소스에서 관개 수를 수집합니다. 물은 소량의 파편을 가질 수 있지만 상당한 퇴적물이나 토양은 없습니다. 수동 펌프를 사용하여 깔때기를 통해 물을 끌어 당기는 흡입을 만드는 동안 깔때기 내부의 필터 용지 위에 50 ~1000 밀리리터의 테스트 물을 천천히 붓습니다.
모든 물이 여과된 경우 집게를 사용하여 깔때기에서 필터 용지를 제거합니다. 그리고 멸균 가위를 사용하여 종이를 작은 조각으로 자른다. 실온에서 5분 동안 1.5 밀리리터 튜브에 추출 버퍼 400 마이크로리터에 8-12개의 종이를 담급합니다.
소용돌이 또는 그렇지 않으면 분당 10 초 동안 종이를 동요. 인큐베이션이 끝나면 집게를 사용하여 가능한 한 적은 버퍼로 용지를 제거합니다. 그리고 필터 종이 조각의 다음 세트와 라이센스를 반복합니다.
필터 종이 샘플에서 DNA 추출을 위해 단백질라제 K20 마이크로리터와 마이크로리터 RNA당 10나노그램의 마이크로리터를 샘플에 첨가하고 3분마다 소용돌이 또는 흔들림으로 실온에서 15분 동안 용액을 배양합니다. 인큐베이션이 끝나면 500 마이크로리터의 마그네틱 비드를 결합 버퍼에 넣고 시료에 넣고 흔들어 잘 섞는다. 실온에서 5분 후, 상체를 제거하고 폐기하기 전에 튜브와 마그네틱 분리기 랙을 2분간 놓습니다.
자기 분리기에서 튜브를 제거하고 500 마이크로리터의 세척 버퍼에서 구슬을 적극적으로 다시 중단하십시오. 30초 후에 튜브를 자석으로 돌려보내서 2분 정도 기다린 후 상체를 폐기합니다. 500 마이크로리터의 워시 버퍼와 80%에탄올의 500마이크로리터로 세척을 반복합니다.
그리고 공기는 실온에서 15 분 동안 자기 비드 펠릿을 구동합니다. 인큐베이션이 끝나면 1분 동안 파이펫팅을 사용하여 용출 버퍼 50 마이크로리터에서 구슬을 다시 정지한 후 2분 동안 튜브를 자석에 다시 배치하여 상골의 수집을 허용합니다. 테이블에 표시된 대로 LAMP 프라이머 믹스를 준비한 후, 추출된 DNA 1마이크로리터와 이중 증류수 9마이크로리터의 용암 램프 마스터믹스의 프라이머 믹스 12.5 마이크로리터를 PCR 튜브에 추가하고 1개의 양수 및 1개의 음수 대조군을 설정한다.
모든 샘플을 섭씨 64도 의 열 블로그에 45분 동안 배양하거나, 인큐베이션 끝에 있는 지니 3증폭기, 각 증폭된 시료의 5마이크로리터를 1%아가로즈 젤에 적재하고 자외선 이미징 기계에서 생성된 밴드를 이미지화한다. 칼로리 염료를 사용한 경우 색상 변경을 보고 결과를 양수 또는 음수로 결정합니다. 휴대용 증폭 기기를 사용한 경우 화면의 증폭 그래프를 보고 결과를 확인합니다.
64도에서 LAMP 분석을 실행하는 광학 시간은 45분이며, 검출에 긍정적이었던 가장 낮은 농도는 40분까지 증폭되지 않고 고농도는 20분으로 증폭됩니다. 증폭은 핵산 얼룩으로 표지된 1%아가로즈 젤에서 확인할 수 있다. 상시 상시 바와 같이 종래의 PCR은 LAMP보다 40배 덜 민감하다.
밀리리터 농도당 제3동물원에 4.8배 10배 의 검출 이 분석에서, 물 샘플은 Tift 카운티, 조지아에서 상업 야채 생산에 사용되는 일곱 연못에서 수집되었다. 그 중 3개는 긍정적인 램프 결과를 보여주었습니다.
그러나 기존의 PCR에 의해 샘플을 테스트했을 때, 동물원포기는 세 가지 양성 샘플 중 하나에서만 검출되었습니다. 이 표에서는 감도, 시간, 필수 준비, 재료 및 비용과 같은 변수를 사용하는 검출 방법의 차이점이 요약됩니다. LAMP는 테스트 된 방법 중 가장 비용이 많이 드는 방법이며, 또한 기존의 PCR 증폭에 비해 증폭을 위해 30 ~ 60 분만 필요로하는 가장 빠릅니다.
밀접하게 관련 된 UMI 종자 병원체에서 추출 된이 프로토콜 DNA를 사용 하 여 어떤 샘플에 대 한 검출 결과, 프라이머의 특이성을 확인. 오염을 제한하기 위해 LAMP 튜브에 추출 된 DNA를 추가 할 때 샘플 물을 너무 빨리 붓지 않도록하십시오. 다른 수인성 병원균이 특정 프라이머 세트를 개발한 후에는 여과 및 램프 산 방법을 다른 병원균에 맞게 조정할 수 있습니다.
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개요
본 연구는 필터 종이 DNA 추출 방법과 LAMP 분석을 사용하여 관개수 내 Phytophthora capsici 유주자의 신속한 검출 방법을 제시합니다. 이 기술은 현장 분석을 가능하게 하여 적시에 식물 질병 관리를 용이하게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 식물 병리학
- 환경 미생물학
- 현장 진단
배경
- Phytophthora capsici는 작물에 영향을 미치는 중요한 수매성 병원체입니다.
- 관개수 내 병원체의 조기 검출은 질병 관리에 중요합니다.
- 기존 방법은 시간이 많이 소요되고 실험실 환경이 필요합니다.
- 본 연구는 현장 친화적인 검출 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 관개수 내 Phytophthora capsici의 신속한 검출 방법을 개발합니다.
- 적시 개입을 위한 현장 병원체 분석을 가능하게 합니다.
- 식물 질병 관리 실천의 효율성을 개선합니다.
사용된 방법
- 필터 종이 DNA 추출 방법.
- 고리 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석.
- 펌프 및 필터 시스템을 사용한 현장 설치.
- 여과 플라스크 및 적절한 필터 종이 사용.
주요 결과
- 이 방법은 Phytophthora capsici의 신속한 검출을 가능하게 합니다.
- 실험실 장비 없이 현장 분석이 가능합니다.
- 많은 양의 수를 처리하는 데 효과적임을 입증했습니다.
- 관개수 품질 관리 개선에 기여합니다.
결론
- 개발된 방법은 수매성 병원체 검출에 효율적입니다.
- 식물 질병 관리에서의 적시 의사결정을 지원합니다.
- 다양한 현장 조건에서의 추가 검증을 권장합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Rapid detection of waterborne plant pathogens in irrigation systems enables early intervention in agricultural biotechnology pipelines. This method supports target validation by confirming pathogen presence in environmental samples, reducing false negatives in disease risk assessment. The approach enhances predictive confidence in crop protection strategies by providing actionable data for go/no-go decisions in field trials and seed treatment efficacy studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific detection of Phytophthora capsici zoospores in complex environmental matrices, supporting hypothesis testing for oomycete pathogenicity.
- Operational Value: Filters large volumes of irrigation water (50-1000 mL) to concentrate low-abundance targets, improving assay sensitivity for downstream applications.
- Translational Value: Colorimetric LAMP readout allows naked-eye interpretation, facilitating rapid decision-making in field-based screening programs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Detects DNA at 1.2 x 10² zoospores/mL, 40 times more sensitive than conventional PCR, enabling reliable low-titer pathogen screening.
- Operational Value: Eliminates need for laboratory infrastructure, supporting decentralized assay deployment in agricultural research stations.
- Reproducibility Value: No cross-amplification with closely related species ensures specificity, reducing false positives in multiplex screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Detects pathogen in irrigation ponds linked to commercial vegetable production, establishing disease-relevant system validity.
- Operational Value: Protocol adaptation potential for other waterborne pathogens supports platform reuse across multiple target validation campaigns.
- Risk Mitigation Value: Early detection in water sources enables preemptive management, reducing crop failure risk in preclinical field trials.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-translational continuum by enabling environmental surveillance that informs target selection and assay readiness in agricultural biotechnology.
- Discovery Biology: Confirms presence of target pathogen in natural reservoirs, supporting biological de-risking of therapeutic or protective compound hypotheses.
- Screening: Generates quantitative DNA outputs from filtered samples, enabling comparison of intervention efficacy across treatment groups.
- Analytics: LAMP amplification time correlates with pathogen load, providing a semi-quantitative readout for dose-response modeling.
- Translational Research: Field validation in commercial irrigation systems bridges lab findings to real-world disease pressure scenarios.
- Enterprise Reuse: Filter paper and LAMP components are adaptable to other pathogens, supporting scalable implementation across crop protection programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity and sensitivity improve target validation confidence, reducing mechanistic ambiguity in pathogen-host interaction studies.
- Operational Value: On-site completion in 30-60 minutes accelerates screening timelines compared to lab-based PCR workflows.
- Strategic Value: Lower cost and faster turnaround enable higher sampling frequency, improving surveillance density in large-scale agricultural operations.
- Portfolio Impact: Early pathogen detection informs risk-adjusted advancement of biologics or chemical candidates in crop protection pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology and field sampling techniques for accurate water collection and filtration.
- Needs portable heat block or isothermal amplification device (e.g., Genie III) for LAMP incubation at 64°C.
- Standardization of filter paper pore size (8-10 µm) and elution volume critical for reproducible pathogen recovery across sites.
- Adaptation to other pathogens necessitates species-specific LAMP primer design and validation against non-target organisms.
- Environmental inhibitors in turbid water may require dilution or additional purification steps to maintain amplification efficiency.
