Name: 설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 학습하세요 산소 유도 망막병증 모델을 통해 설치류에서 허혈성 망막 질환을 연구하는 방법을. 이 모델은 신생아 망막병증과 당뇨병성 망막병증 연구에 활용되며, 혈관신생을 정량화하여 치료 후보 물질을 평가할 수 있습니다.

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마리안 칼스버그, 앤 마리 하파니에미, 피비 파르타넨, 앤 칸쿠넨에게 훌륭한 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 핀란드 아카데미, 피비키키 및 사카리 솔베르크 재단, 탐페레 결핵 재단, 핀란드 의학 재단, 피르칸마 병원 지구 연구 재단 및 탐페레 대학 병원 연구 기금에 의해 지원되었다.

여기에 설명된 프로토콜은 핀란드 국립 동물 윤리위원회(프로토콜 번호 ESAVI/9520/2020 및 ESAVI/6421/04.10.07/2017)의 승인을 받았습니다.
1. 실험 동물 및 마우스 OIR 모델 유도
참고: 시간 제동 동물(예: 일반적으로 사용되는 C57BL/6J 마우스)을 사용하여 같은 날에 새끼를 낳습니다. 예를 들어, 129균제(129S1/SvImJ 또는 129S3/SvIM) 수유 댐을 사용하여 초옥시아 유도 중 및 후 새끼를 간호합니다. 또는 피로로 인해 간호 댐을 교체해야 하는 경우를 대비하여 추가 수유 댐이 있는지 확인하십시오. C57BL/6J 마우스/댐을 사용할 때 각 댐에 대한 쓰레기 크기를 6-7마리로 제한합니다(새끼가 체중 증가가 제한되는 경향이 있는 것보다 더 큰 경우)16.
<ol><li>과옥증 유도 전후, 그리고 희생시 동물의 무게를 기록한다.</li>
	<li>케이지 바닥에 충분한 음식이 있는지 확인하여 댐이 음식에 쉽게 접근할 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>여과 시스템을 사용하지 않을 때 여분의CO2를 흡수하기 위해 챔버 의 바닥에 색상 표시기와 소다 라임을 추가합니다.</li>
	<li>챔버 내부의 습도와 온도를 모니터링하고 습도를 40~65% 사이로 유지합니다. 챔버의 바닥에 물을 접시를 배치하여 필요한 경우 챔버의 습도를 증가 (예를 들어, 페트리 접시).</li>
	<li>O2 센서를 100% O2 및 일반 실내 공기로 보정합니다.</li>
	<li>P7 마우스를 챔버에 넣고 O2 레벨을 75%로 설정합니다. P12까지 5 일 동안 챔버에 마우스를 유지합니다. 과옥증 유도 중에 챔버를 열지 마십시오. O2 실린더의 가스 압력을 확인하고 필요할 때 실린더를 교체하십시오. 유도 중에 동물을 모니터링합니다.</li>
	<li>마우스 케이지를 챔버에서 꺼내 모든 새끼의 무게를 측정합니다. 각 실험 그룹이 새끼에 유사한 무게 분포를 가지고 있도록 무게를 기반으로 새끼를 그룹화.</li>
</ol>2. 실험 동물 및 쥐 OIR 모델 유도 (반 폐쇄 시스템 사용)
참고: 시간 제동 된 동물을 사용하여 같은 날에 태어난 새끼를 얻습니다. 쥐 OIR의 경우, 쥐 모델에서 충분한 NV 유도를 얻기 위해 약 18 새끼 / 댐 증가 쓰레기 크기를 사용합니다. 여러 쓰레기에서 풀 새끼는 각 쓰레기에 충분한 새끼를 얻기 위해.
<ol><li>유도 전후, 그리고 희생시에 동물의 무게를 기록한다.</li>
	<li>케이지 바닥에 충분한 음식이 있는지 확인하여 댐이 음식에 쉽게 접근할 수 있도록 하십시오.</li>
	<li>여과 시스템을 사용하지 않을 때 여분의CO2를 흡수하기 위해 챔버 의 바닥에 색상 표시기와 소다 라임을 추가합니다.</li>
	<li>챔버 내부의 습도와 온도를 모니터링합니다. 챔버 바닥에 실리카 젤을 추가하여 여분의 습도 (여러 수의 쥐에서 생성)를 흡수하십시오.</li>
	<li>O2 센서를 100% N2 및 일반 실내 공기로 보정합니다.</li>
	<li>P0 (출생 후 몇 시간)에서 챔버에 쥐를 배치합니다. O2 레벨을 50%로 설정하고 O2 실린더를 챔버에 연결하여 24시간 동안 연결합니다. 그 후 설정을 10% O2로 전환하고 질소(N2) 실린더를 챔버에 24시간 동안 연결한다. 14일 동안 24시간 사이클링을 50%에서 10% O2 레벨로 계속 합니다.</li>
	<li>연구 기간 동안 동물의 가스 소비와 웰빙을 모니터링합니다. 50/10% O2 사이의 변경 중에 챔버를 열고 필요한 경우 더 많은 음식과 물을 추가합니다. 유도 하는 동안 동물을 청소 하는 동물의 새장을 변경 합니다.</li>
	<li>쥐 케이지를 챔버밖으로 꺼내 모든 새끼의 무게를 측정합니다. 각 실험 그룹이 새끼에 유사한 계량 분포를 가지고 있도록 무게를 기반으로 새끼를 그룹화합니다.</li>
</ol>3. 약물 관리 (선택 사항)
참고: OIR에서 일반적으로 사용되는 약물 투여 경로는 쥐에 대한 P12-P14에서 인트라비티 트리트먼트 (ivt), 쥐에 대한 P14입니다. 실험 설정에 따라 치료 일을 결정합니다. 새끼의 여러 쓰레기가 실험에 사용되는 경우, 모든 쓰레기에서 동물을 가지고 치료 그룹을 분할. 바람직하게는, 한 눈에만 약물을 주입하고, 대조군으로서 반대측 눈을 유지한다.
<ol><li>동물의 무게를 측정하고 꼬리 및 / 또는 귀에 식별 표시를합니다.</li>
	<li>주사용 마취(예: 케타민과 메데토미딘, 30 mg/kg 및 마우스용 0.4 mg/kg) 또는 흡입 마취(이소플루란 2-3.5% 이소플루란 및 200-350mL/min 공기)로 동물을 마취시합니다. 발가락을 꼬집어 마취의 깊이를 확인합니다. 치료 하는 동안 난방 패드에 동물을 유지 합니다.</li>
	<li>국소 마취의 경우 눈꺼풀에 진통제 한 방울을 바르습니다. 쥐와 쥐가 P14 주위에 눈을 뜨면서 ivt를 수행하기 전에 집게로 눈꺼풀을 조심스럽게 엽니 다. 각막에 진통제(예를 들어, 옥시부프로카인 염산염)를 발라주세요.</li>
	<li>ivt 주입을 수행하기 전에 요오드 한 방울을 적용하십시오.</li>
	<li>ivt 주입을 위해 33-34 G 바늘이 부착된 유리 주사기를 사용한다. 눈꺼풀을 아래로 누르고 집게로 안구를 갈아 누릅니다. 시신경을 가리키는 45° 각도 바늘에서 약45° 각도 바늘로 주사 후방을 하십시오.</li>
	<li>1.0 μL 이상을 인트라비티 공간에 주입하지 마십시오. 주입된 용액의 역류를 피하기 위해 약물을 주입 한 후 30 s에 대한 바늘을 제자리에 유지하십시오.</li>
	<li>바늘을 제거한 후 출혈이나 망막 손상과 같은 합병증에 대해 눈 (예를 들어 안과)을 검사하십시오. 주사 후 각막 위에 항생제 연고를 발라주세요. 참고: 마우스의 ivt 주입 부피는 0.5 - 1.0 μL이어야 합니다.</li>
	<li>마취를 반전시면(예: 메데토미딘(2.5 mg/kg)에 대한 α2-길항제와 함께 강아지를 케이지로 되돌려 놓습니다. 연구가 끝날 때까지 쓰레기를 정상적으로 보관하십시오.</li>
</ol>4. 생체 내 이미징 및 전세 전세 (선택 사항)
<ol><li>원하는 경우, 혈관 신생 반응 동안 망막에서 발생하는 변화를 기록하기 위해 후속 기간 동안 살아있는 동물에 생체 내 이미징을 수행하십시오. 예를 들어, 형광 혈관 조영술(FA) 또는 스캐닝 레이저 공초점 현미경검사법(19)을 수행하여 혈관을 시각화한다(도4). 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영(SD-OCT)을 사용하여 생체 내에서 망막 층을 시각화합니다(그림4).</li>
	<li>원하는 경우, 전하 (ERG)(도 5)를사용하여 OIR 유도 후 상이한 망막 세포 집단의 기능적 변화를 조사한다.</li>
</ol>5. 조직 수집 및 망막 플랫 마운트의 준비
참고: 원하는 연구 가설에 따라 조직을 수집합니다. 마우스의 경우, 예를 들어 P12(과옥상 후 혈관-말살을 연구하기 위해) 또는 저산소 기간(P13-P17)에서 샘플을 수집한다. 샘플링의 가장 일반적인 시점인 P17에서 마우스 OIR 샘플을 수집하여 NV 양에서 피크를 감지합니다. 쥐 OIR에서, P18-P21에서 샘플을 수집하여 가장 높은 양의 NV(도3)를관찰한다.
<ol><li>샘플링하기 전에 동물의 무게를 측정합니다.</li>
	<li>망막 혈관을 표시하려면 심층 마취 된 동물이 FITC-dextran과 함께 트랜스 카디널리 퍼질 수 있습니다. (또는, 나중에 이솔렉틴으로 망막 플랫 마운트를 얼룩).</li>
	<li>마취 약물 (예 : 케타민과 메데토미딘의 혼합물, 300 mg / kg 및 쥐의 경우 4 mg / kg) 또는 CO2 흡입을 사용하여 동물을 희생하십시오.</li>
	<li>구부러진 집게로 안구 뒤로 잡고, 눈 주위의 조직을 자르고, 궤도에서 눈을 들어 올려 동물의 눈을 수집합니다.</li>
	<li>1-4 h에 대해 갓 만든 4 % 파라 포름 알데히드 (인산염 완충식식염, PBS)에서 안구를 배양합니다. 고정을 제거하고 PBS로 3 x 10 분 눈알을 씻으시다. 망막을 즉시 해부하거나 +4°C에서 PBS에 저장합니다. 주의: Paraformaldehyde는 흡입에 의해, 피부와 접촉하고 삼키는 경우에 유독합니다. 안전 데이터 시트를 읽고 작업하기 전에 문의해 주십시오. 참고: 전체 안구의 단면이 이루어지는 경우 망막 분리를 피하기 위해 샘플링 또는 조직 처리의 단계 동안 안구에 압력을 가하지 마십시오.</li>
	<li>망막 플랫 마운트를 준비하여 NV의 양과 AV의 크기를 정량화합니다. 대안적으로, 안구/망막을 공수학, 또는 RNA 또는 단백질 분석을 처리한다. 마이크로 가위와 집게를 사용하여 스테레오 현미경으로 망막을 해부합니다.<ol>
<li>PBS에 안구를 놓고 바늘 (23G)으로 림푸스에서 안구를 촉촉하게 유지하고 눈알을 구멍을 뚫고 휘감이 있는 마이크로 가위로 팔다리를 잘라 홍채와 각막을 제거합니다.</li>
		<li>조심스럽게 clera와 망막 사이에 가위의 끝을 배치하고 시신경을 향해 clera를 잘라. 안구의 반대편에서도 똑같이 하고 망막 컵이 노출될 때까지 조심스럽게 클레라를 잘라내거나 찢습니다. 망막 컵에서 렌즈를 꺼내 컵에 PBS를 추가합니다.</li>
		<li>망막을 손상시키지 않고 모든 히알로이드 혈관, 유리체 및 파편을 제거하십시오. 망막 컵에 PBS를 추가하여 망막을 씻으시면 씻습니다. 꽃과 같은 구조를 만들기 위해 직선 마이크로 가위로 망막에 4 개의 절개 (12, 3, 6 및 9시)를 수행하십시오. 선택적으로, 샘플을 장착하기 전에 수술 블레이드로 절단을합니다. 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 망막을 잘 접시에 올려 염색합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>내피 세포의 표면을 얼룩지게 하는 이솔록틴 B4를 사용하여 망막 혈관에 라벨을 붙입니다(동물이 FITC-dextran으로 퍼프지지 않은 경우). 망막 버퍼(10% NGS + TBS의 0.5% 트리톤)에서 망막을 1h로 배양하고 10분 동안 TBS에서 1% NGS + 0.1% 트리톤으로 세척합니다. 빛으로부터 보호되는 동안 1% NGS + 0.1% 트리톤에서 형광염 염료 컨쥬게이트 이솔렉틴 B 4(5-10μg/ml)로 망막을 배양한다. 참고: 원하는 경우 특정 항체를 사용하여 염증 세포 및 pericytes와 같은 다른 세포에 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>망막 3x를 10분 동안 1% NGS + TBS의 0.1% 트리톤으로 씻고 현미경 슬라이드에서 망막을 들어 올려 위쪽으로 향합니다. 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 망막을 조심스럽게 펴고 남은 히알로이드 용기 나 파편을 제거하십시오. 커버 슬립에 마운팅 미디엄을 넣고 망막 위에 놓습니다. 망막을 +4°C에 저장하고 빛으로부터 보호하십시오.</li>
</ol>6. 플랫 마운트 분석
<ol><li>10배 의 객관적인 형광 현미경을 사용하여 망막 플랫 마운트의 이미지를 가져 가라. 피상혈관 신경총과 전리혈관에 초점을 맞춥니다. 전체 망막을 캡처하고 타일 스캔을 병합하는 타일 스캔 이미지를 확인</li>
	<li>이미지 처리 프로그램을 사용하여 AvA, NV 영역 및 총 망막 영역을 측정하여 이미지를 정량화합니다(재료 표참조).<ol>
<li>무료 손 그리기 도구를 사용하여 AVA 및 총 망막 영역을 그리고 선택 도구를 사용하여 신생 영역을 선택합니다. 이 소프트웨어는 픽셀에 대한 관심 영역을 측정하며 AVA 및 NV 영역(픽셀단위로 표현됨)을 사용하여 전체 망막 영역과 관련하여 백분율을 계산할 수 있습니다. 또한 일부 소프트웨어 도구는 NV를 정량화할 수 있습니다. 참고: 최근 딥 러닝 신경망을 이용한 OIR 이미지의 주요 가치의 정량화를 위한 오픈 소스, 완전 자동화 된 프로그램이 도입되었으며 망막 AVA 및 NV (예 : https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21의재현 가능한 정량화를위한 신뢰할 수있는 도구를 제공합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>개별 세포 집단의 면역조직화학적 검출을 위해 항체를 사용하는 경우, 원하는 경우 망막 플랫 마운트에서 스테인드 셀(microglia, 도 2B)의수를 정량화한다.</li>
</ol>7. 통계
<ol><li>학생의 테스트 또는 단방향 ANOVA에 의해 일반적으로 분산된 데이터를 분석한 다음 Dunnett 또는 Tukey의 여러 비교 테스트가 적절히 수행됩니다. Mann-Whitney U 테스트 또는 Kruskal Wallis 테스트와 같은 비파라메트릭 테스트를 사용하여 일반적으로 분산되지 않는 데이터에 대해 사용하십시오. P&05 수준에서 통계적으로 유의한 차이를 고려하십시오.</li>
</ol>

저자 마리아 베테투파, 박사, 니나 예스켈라이넨, 마크 세라다- 기메네즈, 박사, 루비나 타파는 실험리카 회사의 직원입니다.
저자 Giedrius Kalesnykas, 박사, 직원 (사장 및 최고 경영자) 및 이 조에 사용되는 전임상 OIR 모델을 고용 계약 연구 서비스를 제공하는 실험가 회사의 주주입니다.
테로 예르비넨, M.D., 박사, 하넬 레 우시탈로-예르비넨, M.D., 박사, 공개 할 것이 없다.

질병 표현형의 중증도는 마우스와 쥐 OIR모델(23)의균주와 공급업체 모두에 의존한다. 이것은 병리학 발달에 있는 넓은 genotypic 가변성이 있다는 것을 건의합니다. 일반적으로, 색소 설치류는 알비노 보다 더 심각한 표현형을 개발. 예를 들어, 알비노 BALB/c의 망막 혈관은 과옥증 후 급속히 변조되고24전혀NV를 개발하지 않는다. 유사하게, 쥐에서, 색소 브라운 노르웨이 쥐는 알비노 스프라그 Dawley (SD) 쥐25보다더 심각한 병리학을 보여줍니다. SD 쥐는 일반적으로 사용되는 변형, 그리고 OIR 표현형에 공급 업체 관련 차이 변형 내에서 보고 되었습니다. 예를 들어, 찰스 강에서 SD 쥐는 할란 또는 지빅 밀러23에서쥐보다 훨씬 더 많은 NV를 생산하고 있습니다. C3H/HeJ 마우스는, 차례로 망막 변성1(Rd1)유전자에 돌...

안정적이고 재현 가능한 실험 모델은 혈관 신생 안구 질환의 병리학을 연구하고 이러한 치명적인 질병에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 필요합니다. 병리학적 혈관신생은 습한 노화 관련 황반 변성(AMD)과 미숙아(ROP), 증식성 당뇨병 성 망막병증(PDR) 및 망막 정맥 폐색(RVO)1,2,3,4의망막병증의 망막병증을 위한 특징이다. 인간과 설치류 망막은 인간과 설치류 망막이 혈관화되는 마지막 조직 중 하나이기 때문에 유사한 발달 패턴을 따릅니다. 망막 혈관이 완전히 발달하기 전에 망막은 히알로이드 혈관에서 영양 공급을 받는데, 이는 망막 혈관이1,2를개발하기 시작할 때 회귀한다. 인간에서는 망막 혈관 발달이 출생 전에 완료되는 반면 설치류에서는 망막 혈관의 성장이 출생 후에 발생합니다. 망막 혈관 발달은 설치류에서 산후에서 발생하기 때문에 혈관 신생2,3을연구하기에 이상적인 모델 시스템을 제공한다. 신생아 설치류는 완전한 혈관 망막 발달이 3 차 산후 주4의말까지 달성 될 때까지 점차적으로 발생하는 혈관 망막을 가지고 있습니다. 신생아 마우스의 성장 혈관은 플라스틱, 그들은 hyperoxia 자극 동안 회귀를겪는다 5.
ROP는 1,250 g6,7의밑에 출생 무게를 가진 미숙아의 거의 70%에 영향을 미치기 때문에, 서양 국가에 있는 유년기 실명에 대한 주요한 원인입니다. ROP는 망막 혈관이 정상 성장을 완료하기 전에 태어난 미숙아에서 발생합니다. ROP는 2단계로 진행한다: 단계 I에서, 조산은 망막 혈관 성장을 지연시키는 단계 II에서, 개발망티나의 미완성 혈관화는 새로운 및 비정상적인 혈관 성장을 자극하는 혈관신생 성장 인자의 발현을 유도하는 저산소증을 일으킨다8. OIR 모델은 ROP 및 기타 허혈성 망막증의 병리학을 연구하고 새로운 약물 후보2,3,9를테스트하는 데 널리 사용되는 모델입니다. 그것은 널리 안구뿐만 아니라 비 안구 질환에 대한 잠재적 인 항 혈관 유발 약물에 대한 개념 증명 연구를 수행하기위한 재현 가능한 모델로 간주됩니다. 두 설치류 모델 즉, 마우스와 쥐 OIR는 모델 유도 및 질병 표현형이 다릅니다. 쥐 모델은 ROP 표현형을 보다 정확하게 모방하지만 마우스 모델은 망막 신생 혈관화 (NV)를 위한 보다 강력하고 빠르며 재현 가능한 모델을 제공합니다. 마우스 모델에서 NV는 중앙 망막으로 발전합니다. 이러한 병리학적 판독은 PDR, RV 및 발출 AMD와 같은 많은 허혈성 망막병증뿐만 아니라 암과 같은 비안구, 혈관신생 질환에 대한 약리효능 연구에서 중요합니다. 더욱이, 유전자 조작 (형질전환 및 녹아웃) 마우스의 가용성은 마우스 OIR 모델을 더 인기있는 옵션으로 만든다. 그러나 마우스나 쥐 OIR 모델은 인간 질환에서 전형적인 망막 섬유증을 생성하지 않습니다.
높은 산소 수준이 1950년대10,11년에 ROP의 발달에 기여했다는 이해는 동물 모형의 발달로 이끌어 냈습니다. 망막 혈관에 산소의 효과에 대한 첫 번째 연구는 1950년 12,13,14및 1990 년대까지 OIR 모델에 많은 정제가 있었다. 1994년 스미스 외(Smith) 등의 연구는 히알로이도병증과망막병증(15)을분리하는 현재 마우스 OIR 모델에 대한 표준을 세웠다. 코너 등(2009)에 의해 혈관 소성 및 병리학적 NV를 정량화하는 방법의 폭넓은 채택은 그 인기를 더욱 높였다16. 이 모델에서, 마우스는 P7에서 5일 동안 75%의 산소(O2)에배치되고, 그 다음으로 5일 동안 노목성 조건에서 배치된다. P7에서 P12까지의 Hyperoxia는 망막 중앙망막에서 회귀하는 망막 혈관을 일으키는 원인이 됩니다. 노목학적 조건으로 돌아오면 혈관 망막이 저산소가됩니다(도 1A). 바낭 중앙 망막의 저산소 자극으로 인해 망막 혈관 중 일부는 유리체쪽으로 싹이 나고, 전리동맥 NV를 형성하여2,3. 이 터프트는 미숙하고 과과성입니다. P17에서 NV 피크의 양이 재생됩니다. 망막은 완전히 재변되고 NV는 P23 - P25(그림 2A)2,3에의해 완전히 회귀된다.
쥐 OIR 모델 (O2의다양한 수준을 사용하여) 먼저 80 % 및 40 %에서 O2 수준이 80 % 이하보다 더 발음 NV를 일으키는 것을 보여주는 1990 년대에 설명되었다 80% O2 상수 노출17. 나중에 O2가 과옥시아 (50 %)에서 순환되는 간헐적 저산소증 모델이 발견되었습니다. 저산소증(10-12%)으로 인해 80/40% O2 모델18보다더 많은 NV가 발생합니다. 50/10% 모델에서 쥐 새끼는 24시간 동안 50%에 노출되고, 10% O2에서24시간 동안 노출됩니다. 이러한 주기는 P14까지 계속되며, 쥐 새끼가 노목학적조건(도 1B)으로반환될 때 계속됩니다. 인간 ROP 환자에서와 마찬가지로, 쥐 모델에서, 변기 부위는 미성숙한 망막 혈관 신경총(도3)으로인해 망막 주변으로 발전한다.
두 모델 모두에서 일반적으로 정량화되는 주요 매개 변수는 AVA 및 NV의 크기입니다. 이러한 파라미터는 전형적으로 내피 세포가4,16으로표지되는 망막 플랫 마운트로부터 분석된다. 이전에는 전리동맥 NV의 양이 혈관 또는 혈관 세포 핵을 내부 제한 막 이상으로 유리체로 확장하여 망막 단면으로부터 평가하였다. 이 방법의 주요 제한은 AVA를 정량화할 수 없다는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>33 게이지, 스몰 허브 RN 니들</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05, 10mm, 25°C;, PS4</td><td>유리체강내 주사용</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>이미지 분석용</td></tr><tr><td>에어 펌프 air100</td><td>Eheim GmbH & Co. KG.</td><td>143207</td><td>흡입 마취용</td></tr><tr><td>마취 유닛 410 AP</td><td>Univentor Ltd.</td><td>2360309</td><td>흡입 마취용</td></tr><tr><td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td><td>VWR International Ltd</td><td>22666.362</td><td>모델 유도 중 CO2 제어용</td></tr><tr><td>Attane Vet 1000 mg/g</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 17 05 79</td><td>흡입 마취용</td></tr><tr><td>브러시</td><td></td><td></td><td>플랫 마운트 준비용</td></tr><tr><td>이산화탄소 가스</td><td></td><td></td><td>희생용</td></tr><tr><td>Celeris D430 ERG 시스템</td><td>Diagnosys LLC</td><td>121</td><td>in vivo ERG</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>Greiner Bio-One International GmbH</td><td>664 160</td><td>플랫 마운트 준비용</td></tr><tr><td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 08 78 96</td><td>마취용</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15165452</td><td>플랫 마운트 준비용</td></tr><tr><td>O2 제어 InVivo 캐비닛, Aninal Filtrarion 시스템 및 제습기</td><td>Coy 실험실 제품</td><td></td><td>질병 모델 유도를 위한 폐쇄 시스템, 반폐쇄 시스템</td></tr><tr><td>E702 O2 센서</td><td>선택 사항 BioSphenix, Ltd.</td><td>E207, 1801901</td><td>산소 수준 측정용</td></tr><tr><td>Envisu R2200 스펙트럼 도메인 광간섭 단층 촬영(SD-OCT)</td><td>Bioptigen, Inc.</td><td>BPN000668</td><td>in vivo 이미징 Eye</td></tr><tr><td>spears</td><td>Beaver-Visitec International, Inc.</td><td>0008685</td><td>유리체강내 주사 및 in vivo 이미징</td></tr>용 <tr><td>Flexilux 600LL 콜드 광원</td><td>Mikron</td><td>11140</td><td>유리체강내 주사 또는 조직 채취용</td></tr><tr><td>플루오레세인 나트륨 염</td><td>Merck KGaA</td><td>F6377-100G</td><td>in vivo 이미징용</td></tr><tr><td>가스 배기 장치(+이중 3방향 밸브, 마우스 및 쥐 안면 마스크, UNOsorb 필터)</td><td>UNO Roestvaststaal BV</td><td>GEX 17015249</td><td>흡입 마취용</td></tr><tr><td>유리 주사기, 모델 65 RN</td><td>Hamilton Company</td><td>7633-01</td><td>유리체강내 주사용</td></tr><tr><td>HRA2 망막 혈관 조영기(FA)</td><td>Heidelberg Engineering GmbH</td><td>Spec-KT-05488</td><td>in vivo 이미징용</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>I21411</td><td>망막 혈관 구조 라벨링용 플랫 마운트</td></tr><tr><td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td><td>Intervet International BV</td><td>vnr 51 14 85</td><td>마취용</td></tr><tr><td>약용 산소 가스</td><td></td><td></td><td>질병 모델 유도</td></tr><tr><td>마우스 C57BL/6JRj</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>또한 다른 변형 가능</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>플랫 마운트 준비용</td></tr><tr><td>Minims Povidone 요오드 5% (단위)</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>vnr 24 11 304</td><td>유리체강내 주입용</td></tr><tr><td>질소 가스</td><td></td><td></td><td>질병 모델 유도용(쥐)</td></tr><tr><td>Oftan Chlora 10 mg/g</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 01 11</td><td>유리체강내 주사용</td></tr><tr><td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 43</td><td>in vivo ERG</td></tr><tr><td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 50</td><td>유리체강내 주사용</td></tr><tr><td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 04 12 36</td><td>in vivo 이미징용</td></tr><tr><td>ProOx Model 110 O2 컨트롤러 및 동물 챔버</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>803</td><td>질병 모델 유도용, 반폐쇄 시스템, 폐쇄형 시스템</td></tr><tr><td>ProOx 모델 P360 O2 컨트롤러 및 동물 챔버</td><td>선택 사항 BioSphenix, Ltd.</td><td>538</td><td>질병 모델 유도, 반폐쇄 시스템, 폐쇄 시스템</td></tr><tr><td>Rats CD (SD)</td> <td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>또한 다른 변형 가능</td></tr><tr><td>되돌리기 5 mg / mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 13 04 97</td><td>마취 반전</td></tr><tr><td>실리카겔</td><td></td><td></td><td>모델 유도 중 습도 조절</td></tr> 용 <tr><td>Systane Ultra 10ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2050250</td><td>눈의 수분 공급용</td></tr><tr><td>Systane Ultra 장치 0.7ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2064871</td><td>눈 수분 공급용</td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1343-9108</td><td>플랫 마운트 준비용</td></tr><tr><td>VENTI-Line VL 180 PRIME 건조 오븐</td><td>VWR</td><td>VL180S 170301</td><td>실리카겔 건조용</td></tr><tr><td>VisiScope SZT350 실체 현미경</td><td>VWR</td><td>481067</td><td>유리체강내 주사 또는 조직 채취용</td></tr></tbody></table>

설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

허혈성 망막증에 일반적으로 사용되는 모델 중 하나는 산소 유발 망막병증 (OIR) 모델입니다. 여기에서 우리는 마우스와 쥐 둘 다에 있는 OIR 모형 유도 및 그것의 판독을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 망막 신생 혈관화는 중구 성 새끼를 hyperoxia (마우스) 또는 hyperoxia 및 저산소증 (쥐)의 교대 수준을 노출시킴으로써 OIR에서 유도됩니다. 이 모형의 1 차적인 판독은 망막에 있는 신생혈관 (NV) 및 avascular (AVA) 지역의 크기입니다. 생체 내이 전임상 은 잠재적인 항 혈관 신생 약물의 효능을 평가하거나 유전자 조작 된 동물을 사용하여 망막 혈관 신생에서 특정 유전자의 역할을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델에는 실험을 설계할 때 고려해야 할 OIR 유도에 약간의 변형 및 공급업체별 변형이 있습니다.

모델의 주요 결과는 혈관 표현형입니다 : AVA의 크기와 NV의 양. 마우스 OIR 모델에서, 혈관 투약은 중앙 망막(도2A)에서발생하며, 쥐 모델에서는 주변, 즉 인간ROP(22)와 유사하게개발된다. 이는 마우스가 아옥시아에 노출될 때 피상적 혈관 신경총이 이미 개발되었지만 쥐 모델에서는 망막이 OIR 유도(P0)의 시점에서 바탈구이기 때문이다. 전황 신생 혈관화는 혈관 영역, 즉 마우스의 중앙 망막 및 쥐 의 주변 부근에서 발생합니다(도 2A 및 도 3A).
단면 또는 평평한 마운트를 이용한 조직학적 분석은 OIR 망막의 형태학적 변화 또는 관심 있는 세포 유형의 존재, 예를 들어 염증세포(도<strong class="xf...

산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 및 증식 성 당뇨병 망막증의 망막병증과 같은 허혈성 망막 질환을 모델링하고 신생아 질환에 대한 항 혈관 신생 약물을 평가하는 개념 증명 연구의 모델로 사용될 수 있다. OIR는 정량화 될 수있는 망막에서 견고하고 재현 가능한 신생 혈관화를 유도합니다.

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

개발 후, 산소에 의한 망막병증 모델은 신생혈관 망막 질환의 전임상 연구에서 널리 사용되게 되었습니다. 저산소증에 대한 반응으로 병리학적 혈관 신생을 연구하는 모델로 사용되었습니다. 이 모델의 주요 장점은 재현 가능하고 쉽게 정량화할 수 있는 강력한 신경혈관 반응을 유도한다는 것입니다.이 모델은 가능한 치료 후보의 효과를 연구하기 위한 전임상 모델로 사용할 수 있습니다. 미숙아 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 습성 연령 관련 황반변성과 같은 여러 인간 질병에 대한 관련 모델로 간주됩니다. 저산소증 유도 전후와 희생 당시의 동물의 체중을 기록하십시오.케이지 바닥에 음식이 충분한지 확인하고 여과 시스템을 사용하지 않을 때 과도한 이산화탄소를 흡수하기 위해 챔버 바닥에 색상 표시기가 있는 소다 라임을 추가하십시오. 챔버 내부의 습도와 온도를 모니터링하고 습도를 40%에서 65% 사이로 유지하십시오.필요한 경우 바닥에 물이 담긴 접시를 놓아 챔버의 습도를 높입니다. 일반 실내 공기와 100% 산소로 산소 센서를 보정합니다.그런 다음 P7 마우스를 챔버에 넣고 산소 수준을 75%로 설정합니다.P12까지 5일 동안 마우스를 챔버에 보관하고 유도 중에 동물을 모니터링합니다. 완료되면 챔버에서 마우스를 꺼냅니다. 동물의 무게를 측정하고 꼬리나 귀에 식별 표시를 합니다.동물을 마취한 후 발가락 꼬집기를 수행합니다. 약간의 반사 작용은 허용됩니다. 치료하는 동안 동물을 발열 패드에 보관하십시오.IVT 주사를 위해 33-34 게이지 바늘이 있는 유리 주사기를 사용하십시오. 요오드 한 방울을 바르고 눈꺼풀을 아래로 누르고 집게로 안구를 잡습니다. 주사를 변연계 뒤쪽으로 약 45도 각도로 시신경을 가리키도록 합니다.주입된 용액의 역류를 방지하기 위해 약물을 주입한 후 30초 동안 바늘을 제자리에 유지하십시오. 바늘을 제거한 후 출혈이나 망막 손상과 같은 합병증이 있는지 눈을 검사합니다. 주사 후 눈 위에 항생제 연고를 바릅니다.원하는 경우, 추적 관찰 기간 동안 살아있는 동물에 대한 생체 내 이미징을 수행하여 혈관 형성 반응 동안 망막에서 발생하는 변화를 기록합니다. 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography)을 사용하여 in vivo에서 망막층을 시각화할 수 있습니다. 눈 주위의 조직을 자르고 구부러진 집게로 안구 뒤를 잡고 안와에서 눈을 들어 올려 동물의 눈을 수집합니다.갓 만든 여과된 4%파라포름알데히드에 안구를 1-4시간 동안 배양합니다. 고정액을 제거하고 PBS로 10분 동안 안구를 3회 세척합니다. 망막을 즉시 절개하거나 섭씨 4도의 PBS에 보관하십시오.신생혈관화의 양과 무혈관 영역 또는 AVA의 크기를 정량화하기 위해 망막 편평 마운트를 준비합니다. 마이크로 가위와 집게를 사용하여 실체 현미경으로 망막을 해부합니다. PBS에 안구를 넣어 촉촉하게 유지하고 23게이지 바늘로 윤기 가장자리에 구멍을 뚫은 다음 구부러진 마이크로 가위로 가장자리 주위를 잘라 홍채와 각막을 제거합니다.가위 끝을 RPE와 신경 망막 사이에 조심스럽게 놓고 RPE 맥락막 공막 복합체를 시신경 쪽으로 자릅니다. 안구의 다른 쪽에도 똑같이 합니다. 그런 다음 망막 컵이 드러날 때까지 조직을 부드럽게 자르거나 찢습니다.망막 컵에서 렌즈를 빼내고 컵에 PBS를 추가합니다. 망막을 손상시키지 않고 모든 히알로이드 혈관, 유리체 및 파편을 제거합니다. 스트레이트 마이크로 가위로 망막을 4개 절개하여 꽃과 같은 구조를 만듭니다.부드러운 페인트 브러시나 전사 피펫을 사용하여 염색을 위해 웰 플레이트로 옮깁니다. 망막 혈관 구조에 내피 세포의 표면을 염색하는 이소렉틴 B4로 표시합니다. 망막을 차단 버퍼에서 1시간 동안 배양하고 TBS에서 1%NGS와 0.1% 트리톤으로 10분 동안 세척합니다.빛으로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 밀리리터당 5-10마이크로그램의 형광 염료가 접합된 이소렉틴 B4로 망막을 배양합니다. 다음 날에는 TBS에 1%NGS와 0.1%Triton으로 1회 10분씩 망막을 3회 세척합니다. 망막을 현미경 슬라이드에 놓고 망막 안쪽이 위를 향하도록 합니다.그런 다음 부드러운 붓을 사용하여 망막을 조심스럽게 펴고 남아 있는 히알로이드 혈관이나 부스러기를 제거합니다. 샘플 위에 장착 매체를 추가하고 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다. 망막은 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 보관하십시오.10X 대물렌즈가 있는 형광 현미경을 사용하여 망막 편평한 마운트를 이미지화합니다. 표재성 혈관신경총(superficial vascular plexus)과 망막 전(pre-retinal neovascularization)에 초점을 맞춘다. 타일 스캔 이미지를 만들어 전체 망막을 캡처하고 타일 스캔을 병합합니다.이미지 처리 프로그램을 사용하여 AVA, 신생혈관형성 면적 및 전체 망막 면적을 측정하여 이미지를 정량화합니다. 자유형 그리기 도구를 사용하여 AVA와 전체 망막 면적을 그리고 선택 도구를 사용하여 신생혈관 영역을 선택합니다. 마우스 산소유발 망막병증 모델에서는 중앙 망막에서 혈관 소멸이 발생합니다.쥐 모델에서는 인간의 ROP와 유사하게 주변부에서 발달합니다. 망막 전단계 신생혈관형성은 무혈관 영역, 특히 마우스의 중앙 망막과 쥐의 말초 근처에서 발생합니다. 단면 또는 플랫 마운트를 사용한 조직학적 분석을 수행하여 OIR 망막의 형태학적 변화 또는 관심 세포 유형(예: 염증성 세포)의 존재를 평가할 수 있습니다.선택적으로, OIR 추적 기간 동안 비침습적 생체 내 이미징을 수행할 수 있습니다. 망막 및 히알로이드 혈관 구조는 플루오레세인 혈관 조영술로 시각화할 수 있으며 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영을 사용하여 망막의 구조적 변화를 평가할 수 있습니다. 기능적 변화는 망막전파검사로 측정할 수 있습니다.수용성 VEGF-트랩인 애플리버셉트는 OIR에서 신생혈관 재생과 생리학적 혈관재생을 모두 억제합니다. P14에 고용량의 애플리버셉트를 주입한 OIR 눈은 치료되지 않은 눈보다 망막 AVA가 훨씬 더 컸으며, 이는 애플리버셉트가 저산소증으로 인한 생리적 망막 혈관 재생도 차단한다는 것을 시사합니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 사전에 실험에 적합한 깔짚 크기를 고려하고 산소실에 있는 댐과 새끼의 안녕을 모니터링하는 것을 잊지 마십시오.출생 후 체중 증가가 모델의 결과에 영향을 미친다는 점을 고려하십시오. 이 모델에서 얻은 망막 샘플은 면역조직화학, 유전자 또는 단백질 발현 분석과 같은 분석 방법에 사용할 수 있으며 분자 수준에서 망막에 대한 잠재적인 치료 후보의 효과를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

쥐의 망막은 오랫동안 뇌에 접근 창으로 인정을 받고있다. 이 기술 문서에서 우리는 허혈성 손상 후 중추 신경계 내에서 혈관 재생의 실패로 이어질 메커니즘을 연구하는 산소에 의한 망막 병증의 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. 기술 시스템은 망막과 중추 신경계 내에서 기능 혈관의 재성장을 촉진하는 전략을 탐구하는 무력화 할 수 있습니다.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

이 프로토콜의 목적은 화학적 랫트 후부 시신경에 허혈 손상을 유도하는 것이다. 이 모델은 후방 허혈성 시신경 병증의 병태 생리에 대한 연구 및이를위한 치료 적 접근 방법과 다른 광섬유에 중요한 신경 병증,뿐만 아니라 다른 CNS 허혈성 질환이다.

광 화학적으로 유도 된 후방 허혈성 시신경 병증의 쥐 모델

이 문서에서는 마우스에서 안압 상승으로 망막 허혈 - 재관류 손상을 유도하는 절차를 설명합니다. 안압 상승으로 망막 허혈 - 재관류 손상은 망막 신경 혈관 기기의 인간 질병에 대한 잠재적 인 세포 메커니즘과 치료를 조사하는 연구를 가능하게 망막에 손상 산소와 영양 공급에 의해 특징 인간의 병리를 모델링하는 역할을한다.

안압 상승을 통해 망막 허혈 - 재관류 손상의 마우스 모델

여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 망막 및 안구 구조를 시각화하기 위해 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)을 사용하는 방법을 설명합니다.

광학 간섭 단층 촬영을 사용한 설치류 모델에서 안구 질환의 생체 내 구조 평가

여기서, 우리는 간단한 봉합사 및 클램프를 사용하여 일시적인 양측 공통 경동맥 폐색에 의한 망막 허혈의 마우스 모델을 설명합니다. 이 모델은 심혈관 비정상으로 인한 망막 허혈의 병리학적 메커니즘을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

과도 양측 공통 경동맥 폐색에 의해 유도된 허혈성 망막 손상의 뮤린 모델

이 프로토콜은 망막 플랫 마운트 마우스의 제조 및 면역형광 염색 및 분석을 위한 상세한 방법을 기술한다. 마우스 새끼를위한 fluorescein 안저 혈관 조영술 (FFA)의 사용 및 이미지 처리도 자세히 설명되어 있습니다.

산소 유발 망막병증 마우스 모델에서 망막 혈관의 동적 성장 모니터링

여기에서는 장미 벵골을 사용한 망막 정맥 폐색에 최적화된 프로토콜과 유전자 변형 균주에서 재현성을 극대화하기 위한 권장 사항과 함께 레이저 유도 망막 영상 현미경 시스템에 대해 설명합니다.

가변성을 제한하기 위한 망막 정맥 폐색 마우스 모델의 최적화

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

여기에서는 망막 정맥 폐색(RVO) 연구에서 형광 혈관 조영술(FA) 및 광학 간섭 단층 촬영(OCT) 이미지에 대한 세 가지 데이터 분석 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

이 프로토콜은 전방삽관 삽입 및 안압 상승을 통해 망막 허혈을 유도한 다음 안압 정상화를 통해 재관류를 시작하여 마우스 눈의 망막 허혈-재관류 손상을 모델링합니다.

Induction of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in a Mouse Eye Model

학습하세요 산소 유도 망막병증 모델을 통해 설치류에서 허혈성 망막 질환을 연구하는 방법을. 이 모델은 신생아 망막병증과 당뇨병성 망막병증 연구에 활용되며, 혈관신생을 정량화하여 치료 후보 물질을 평가할 수 있습니다.

설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

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