설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형

개발 후, 산소에 의한 망막병증 모델은 신생혈관 망막 질환의 전임상 연구에서 널리 사용되게 되었습니다. 저산소증에 대한 반응으로 병리학적 혈관 신생을 연구하는 모델로 사용되었습니다. 이 모델의 주요 장점은 재현 가능하고 쉽게 정량화할 수 있는 강력한 신경혈관 반응을 유도한다는 것입니다.

이 모델은 가능한 치료 후보의 효과를 연구하기 위한 전임상 모델로 사용할 수 있습니다. 미숙아 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 습성 연령 관련 황반변성과 같은 여러 인간 질병에 대한 관련 모델로 간주됩니다. 저산소증 유도 전후와 희생 당시의 동물의 체중을 기록하십시오.

케이지 바닥에 음식이 충분한지 확인하고 여과 시스템을 사용하지 않을 때 과도한 이산화탄소를 흡수하기 위해 챔버 바닥에 색상 표시기가 있는 소다 라임을 추가하십시오. 챔버 내부의 습도와 온도를 모니터링하고 습도를 40%에서 65% 사이로 유지하십시오.필요한 경우 바닥에 물이 담긴 접시를 놓아 챔버의 습도를 높입니다. 일반 실내 공기와 100% 산소로 산소 센서를 보정합니다.

그런 다음 P7 마우스를 챔버에 넣고 산소 수준을 75%로 설정합니다.P12까지 5일 동안 마우스를 챔버에 보관하고 유도 중에 동물을 모니터링합니다. 완료되면 챔버에서 마우스를 꺼냅니다. 동물의 무게를 측정하고 꼬리나 귀에 식별 표시를 합니다.

동물을 마취한 후 발가락 꼬집기를 수행합니다. 약간의 반사 작용은 허용됩니다. 치료하는 동안 동물을 발열 패드에 보관하십시오.

IVT 주사를 위해 33-34 게이지 바늘이 있는 유리 주사기를 사용하십시오. 요오드 한 방울을 바르고 눈꺼풀을 아래로 누르고 집게로 안구를 잡습니다. 주사를 변연계 뒤쪽으로 약 45도 각도로 시신경을 가리키도록 합니다.

주입된 용액의 역류를 방지하기 위해 약물을 주입한 후 30초 동안 바늘을 제자리에 유지하십시오. 바늘을 제거한 후 출혈이나 망막 손상과 같은 합병증이 있는지 눈을 검사합니다. 주사 후 눈 위에 항생제 연고를 바릅니다.

원하는 경우, 추적 관찰 기간 동안 살아있는 동물에 대한 생체 내 이미징을 수행하여 혈관 형성 반응 동안 망막에서 발생하는 변화를 기록합니다. 스펙트럼 영역 광간섭 단층촬영(optical coherence tomography)을 사용하여 in vivo에서 망막층을 시각화할 수 있습니다. 눈 주위의 조직을 자르고 구부러진 집게로 안구 뒤를 잡고 안와에서 눈을 들어 올려 동물의 눈을 수집합니다.

갓 만든 여과된 4%파라포름알데히드에 안구를 1-4시간 동안 배양합니다. 고정액을 제거하고 PBS로 10분 동안 안구를 3회 세척합니다. 망막을 즉시 절개하거나 섭씨 4도의 PBS에 보관하십시오.

신생혈관화의 양과 무혈관 영역 또는 AVA의 크기를 정량화하기 위해 망막 편평 마운트를 준비합니다. 마이크로 가위와 집게를 사용하여 실체 현미경으로 망막을 해부합니다. PBS에 안구를 넣어 촉촉하게 유지하고 23게이지 바늘로 윤기 가장자리에 구멍을 뚫은 다음 구부러진 마이크로 가위로 가장자리 주위를 잘라 홍채와 각막을 제거합니다.

가위 끝을 RPE와 신경 망막 사이에 조심스럽게 놓고 RPE 맥락막 공막 복합체를 시신경 쪽으로 자릅니다. 안구의 다른 쪽에도 똑같이 합니다. 그런 다음 망막 컵이 드러날 때까지 조직을 부드럽게 자르거나 찢습니다.

망막 컵에서 렌즈를 빼내고 컵에 PBS를 추가합니다. 망막을 손상시키지 않고 모든 히알로이드 혈관, 유리체 및 파편을 제거합니다. 스트레이트 마이크로 가위로 망막을 4개 절개하여 꽃과 같은 구조를 만듭니다.

부드러운 페인트 브러시나 전사 피펫을 사용하여 염색을 위해 웰 플레이트로 옮깁니다. 망막 혈관 구조에 내피 세포의 표면을 염색하는 이소렉틴 B4로 표시합니다. 망막을 차단 버퍼에서 1시간 동안 배양하고 TBS에서 1%NGS와 0.1% 트리톤으로 10분 동안 세척합니다.

빛으로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 밀리리터당 5-10마이크로그램의 형광 염료가 접합된 이소렉틴 B4로 망막을 배양합니다. 다음 날에는 TBS에 1%NGS와 0.1%Triton으로 1회 10분씩 망막을 3회 세척합니다. 망막을 현미경 슬라이드에 놓고 망막 안쪽이 위를 향하도록 합니다.

그런 다음 부드러운 붓을 사용하여 망막을 조심스럽게 펴고 남아 있는 히알로이드 혈관이나 부스러기를 제거합니다. 샘플 위에 장착 매체를 추가하고 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다. 망막은 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 보관하십시오.

10X 대물렌즈가 있는 형광 현미경을 사용하여 망막 편평한 마운트를 이미지화합니다. 표재성 혈관신경총(superficial vascular plexus)과 망막 전(pre-retinal neovascularization)에 초점을 맞춘다. 타일 스캔 이미지를 만들어 전체 망막을 캡처하고 타일 스캔을 병합합니다.

이미지 처리 프로그램을 사용하여 AVA, 신생혈관형성 면적 및 전체 망막 면적을 측정하여 이미지를 정량화합니다. 자유형 그리기 도구를 사용하여 AVA와 전체 망막 면적을 그리고 선택 도구를 사용하여 신생혈관 영역을 선택합니다. 마우스 산소유발 망막병증 모델에서는 중앙 망막에서 혈관 소멸이 발생합니다.

쥐 모델에서는 인간의 ROP와 유사하게 주변부에서 발달합니다. 망막 전단계 신생혈관형성은 무혈관 영역, 특히 마우스의 중앙 망막과 쥐의 말초 근처에서 발생합니다. 단면 또는 플랫 마운트를 사용한 조직학적 분석을 수행하여 OIR 망막의 형태학적 변화 또는 관심 세포 유형(예: 염증성 세포)의 존재를 평가할 수 있습니다.

선택적으로, OIR 추적 기간 동안 비침습적 생체 내 이미징을 수행할 수 있습니다. 망막 및 히알로이드 혈관 구조는 플루오레세인 혈관 조영술로 시각화할 수 있으며 스펙트럼 영역 광 간섭 단층 촬영을 사용하여 망막의 구조적 변화를 평가할 수 있습니다. 기능적 변화는 망막전파검사로 측정할 수 있습니다.

수용성 VEGF-트랩인 애플리버셉트는 OIR에서 신생혈관 재생과 생리학적 혈관재생을 모두 억제합니다. P14에 고용량의 애플리버셉트를 주입한 OIR 눈은 치료되지 않은 눈보다 망막 AVA가 훨씬 더 컸으며, 이는 애플리버셉트가 저산소증으로 인한 생리적 망막 혈관 재생도 차단한다는 것을 시사합니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 사전에 실험에 적합한 깔짚 크기를 고려하고 산소실에 있는 댐과 새끼의 안녕을 모니터링하는 것을 잊지 마십시오.

출생 후 체중 증가가 모델의 결과에 영향을 미친다는 점을 고려하십시오. 이 모델에서 얻은 망막 샘플은 면역조직화학, 유전자 또는 단백질 발현 분석과 같은 분석 방법에 사용할 수 있으며 분자 수준에서 망막에 대한 잠재적인 치료 후보의 효과를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.