Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

이것은 성인 신경 발생 분야의 핵심 프로토콜입니다. 여기에서는 성공적인 염색을 달성하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 기술은 조직 무결성을 보존하면서 분열 중인 세포에서 동시 발현되는 특정 단백질을 동시에 식별할 수 있도록 합니다.

조직 항체와 상태를 미리 검사하는 것이 좋습니다. 중요한 단계는 막 투과화, 신중한 DNA 변성, 차단 및 세척 단계 시간 테스트입니다. 이 기술을 표준화하는 것은 새로운 실험실에서 어려운 일입니다.

설치류에서 티미딘 유사체의 시약 준비 및 투여는 성공적인 결과에 매우 중요합니다.티미딘 유사체 BrdU 투여의 경우, 하복강을 고정시켜 실험용 쥐를 제지하고 23게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 새로 준비된 킬로그램당 50mg의 BrdU 용액을 복강내 주입합니다. 적절한 실험 종말점에서 뇌를 채취하고 뇌를 동결하여 저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하여 40마이크로미터 두께의 코로나 절편을 획득할 수 있도록 하고 절편을 채취 순서대로 극저온 보호 용액의 24웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 배치합니다. 모든 섹션이 수집되면 샘플을 섭씨 영하 20도에서 최대 몇 달 동안 보관하십시오.

BrdU 염색을 평가하기 위해 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체와 함께 과산화효소 반응을 사용하여 샘플이 실온에 도달할 때까지 극저온 보호 용액의 슬라이스를 0.1몰 PBS로 옮기고 세척당 새로운 0.1몰 PBS로 10분 동안 조직을 세 번 헹굽니다. 마지막 세척 후, 실온에서 30분 동안 내인성 과산화효소 차단 용액에 절편을 배양한 다음 0.1몰 PBS에서 10분 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 섭씨 37도에서 20분 동안 2개의 몰 염산에서 섹션을 배양한 다음 0.1 몰 붕산염 완충액에서 10분 동안 헹굽니다.

얼음처럼 차가운 0.1몰에서 3회 세척한 후 PBS+차단 용액을 넣어 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양한 후 섭씨 4도에서 PBS+의 마우스 Anti-BrdU 1차 항체로 하룻밤 동안 배양합니다. 0.1몰 PBS를 3회 세척한 후 실온에서 PBS+에서 적절한 마우스 비오틴화된 2차 항체로 샘플을 2-4시간 동안 배양합니다. 세척 후 ABC 용액으로 실온에서 1시간 동안 단면을 처리한 다음 0.1몰 PBS 세척을 3회 수행합니다.

마지막 세척 후 슬라이스를 DAB-Peroxidase Substrate Solution으로 옮겨 슬라이스가 짙은 회색이 될 때까지 2-10분 동안 배양합니다. 양성 세포를 시각화할 수 있는 경우, 15분 동안 수돗물을 3회 세척한 후 0.1몰 PBS를 3회 세척하여 샘플을 헹굽니다. 마지막 세척 후 부드러운 브러시를 사용하여 젤라틴 슬라이드에 슬라이스를 조심스럽게 장착하고 실온에서 밤새 공기 건조합니다.

다음날 아침에는 영구 장착 매체를 사용하여 샘플 위에 커버 슬립을 놓습니다. BrdU 양성 세포를 정량화하려면 먼저 현미경에서 4배 배율을 사용하여 치상회를 식별하고 Z축을 따라 과립 세포층에서 BrdU 표지 핵을 주의 깊게 검색합니다. 치상회(dentate gyrus) 전체에서 세포를 검색하기 위한 간격 섹션을 선택한 후 모든 BrdU 양성 세포를 계산합니다.

표지된 핵의 형태는 세포가 얼마나 많은 BrdU를 포함했는지에 따라 달라질 수 있습니다. Z축을 천천히 이동하여 동물당 최소 10개의 절편과 군집을 통합하는 그룹당 최소 5개의 동물에서 모든 핵을 정량화합니다. 이미지 디콘볼루션의 경우 회절점 확산 함수 3D 플러그인을 열고 필요한 모든 데이터를 입력한 다음 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다.

그런 다음 DeconvolutionLab2 플러그인을 열고 일치하는 Z 스택 이미지와 PSF 파일을 해당 창 슬롯으로 드래그합니다. 디콘볼루션 알고리즘과 반복 횟수를 선택하고 실행을 클릭합니다. 디콘볼루션된 이미지를 단일 Z 스택 이미지로 결합하려면 이미지 및 스택을 선택하고 Z 프로젝트를 클릭합니다.

프로젝션 유형 메뉴에서 Max Intensity를 선택합니다. 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다. RGB 이미지를 만들려면 Image and Color를 선택하고 Merge Channels를 클릭하여 드롭다운 메뉴에서 해당 이미지를 원하는 컬러 채널로 설정합니다.

그런 다음 복합 만들기 상자를 선택 취소합니다. 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다. 모든 채널 이미지가 생성되면 두 개 이상의 이미지 파일을 열고 각 이미지 파일에 대해 다른 색상 채널을 선택하여 RBG 이미지를 만듭니다.

이 이미지에서는 BrdU 표지된 세포가 있는 대표적인 치상회(dentate gyrus) 절편을 관찰할 수 있습니다. 이러한 절편의 확대된 이미지에서 관찰된 바와 같이, 표지된 세포는 강렬한 어두운 염색을 보여줍니다. 참고로, 신체 활동을 하지 않은 통제된 쥐와 신체 활동에 노출된 실험군 사이에는 BrdU 양성 세포 수에서 상당한 차이가 있으며, 이는 신체 활동이 성체 치상회에서 세포 증식을 증가시킨다는 것을 입증한 다른 보고된 결과와 일치합니다.

이 프로토콜을 시도할 때는 새로 준비된 용액을 사용하고 조직을 부드럽게 다루십시오. 해마는 이를 통해 치료할 때 슬라이드의 나머지 부분과 분리되기 쉽고 놓칠 수 있습니다. 이 절차는 DNA 합성 및 이중 염색 세포 증식 연구의 DNA 라벨 및 인덱스 평가에 적용할 수 있습니다.

우리는 이러한 노력이 과학계에 도움이 되었기를 바라며, 면역조직화학 기법을 사용할 때 세포 증식 연구에서 새로운 질문에 더 쉽게 답할 수 있기를 바랍니다.