Name: Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 학습하세요 쥐의 성체 신경발생을 평가하는 면역조직화학 기법으로 BrdU 양성 세포를 시각화하는 방법을. 이 기술은 세포 증식 측정과 조직 완전성 보존에 필수적입니다.

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기술 지원을 제공해 주신 Miguel Burgos와 Gustavo Lago에게 감사드립니다. 또한 시약과 물질을 제공하는 데 친절한 지원을 해주신 Clorinda Arias 박사, Karla Hernandez 박사 및 Oscar Galicia 박사에게도 감사드립니다. 우리는 또한 이 작업의 수행을 위한 자금을 제공하고 비디오 제작 비용을 충당하기 위해 자금을 제공한 멕시코 이베로아메리카나 대학교의 División de Investigación y Posgrado에 감사드립니다.

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성인 신경 발생은 평생 동안 새로운 뉴런을 생성 할 가능성이있는 성인 신경 전구체 세포의 틈새에서 가장 자주 발생하는 과정입니다. 브로모데옥시우리딘(BrdU) 표지는 성인 뇌에서 새로 생성된 세포의 수를 특성화하기 위해 면역학에서 널리 사용됩니다. BrdU는 주로 별개의 뇌 영역 (신경 인성 영역)의 세포에 통합됩니다. 이 세포는 해마의 치아 이랑인 뇌실 하 영역(SVZ)에 위치하며, 이는 아과립 영역(SGZ)으로 알려진 힐루스와 과립 세포 사이에 있습니다.1,2,18. 또한, 시상 하부, 선조체, 신피질 및 편도체19를 포함하여 성인기에 더 낮은 증식 능력을 특징으로하는 다양한 뇌 영역이 있습니다. 앞서 언급했듯이 BrdU 염색은 세포 증식을 감지하기 위해 성인 신경 발생 연구에 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 BrdU를 마커로 사용하는 데는 한계와 함정이 있습니다. 첫 번째는 BrdU가 세포주기 마커라는 것입니다. 따라서 세포 운명을 확인하고 표지 된 세포의 특정 발달 단계를 검출하기위한 세포 마커를 포함하기 위해 이중 또는 삼중 염색을 수행해야합니다. BrdU에 대한 또 하나의 우려는 DNA 안정성을 수정하는 독성 및 돌연변이 유발 용액이 세포 기능과 세포주기를 변화시킬 수 있다는 것입니다. 투여 프로토콜 및 투여 용량(50\u2012600 mg/kg)을 따르기로 결정할 때 이전 정보를 고려해야 합니다. 또 다른 중요한 특징은 BrdU가 세포 증식 마커14가 아니라 DNA 합성 마커라는 것이다. 따라서 세포 증식을 DNA 복구, 중단된 세포 주기 재진입 및 유전자 복제와 같은 다른 사건과 구별하는 것이 적절합니다. 연구원은 BrdU의 적절한 사용을 보장하기 위해 적절한 통제를 따라야 합니다. 이러한 문제와 한계에 대한 자세한 논의는 Taupin의 작업14를 검토하는 것이 좋습니다. 면역조직화학 프로토콜의 표준화 과정은 느리고 까다로울 수 있습니다. 이 작업에서는 성공적인 IHC 프로토콜을 관리하기 위한 모든 일반적인 단계를 제시했습니다. 그러나 모든 연구 그룹은 조직, 항체 및 상태를 사전에 테스트하고 평가할 것을 권장합니다. 검사 및 평가는 검사된 각 항체 및 조직에 대해 최소 3가지 수준의 배양, 세척 단계 및 강도로 수행되어야 합니다. 또한 연구원이 특정 요구 사항 및 요구 사항20,21,22,23,24,25를 충족하는 최상의 프로토콜을 선택할 수 있도록 추가 프로토콜을 검토할 것을 권장합니다.
앞서 언급했듯이이 절차에는 과학 기사에서 일반적으로 사용되고 언급되는 몇 가지 단계와 방법 론적 고려 사항이 포함되며 나중에 논의 될 것입니다. 연구자는 기술, 예산, 장비, 설정 및 주요 연구 목표 측면에서 항체를 신중하고 정확하게 선택할 것을 권장합니다. 항체는 나중에 실험에서 테스트 할 동일한 유형의 조직으로 테스트해야합니다. 또한 고정 기술과의 상용성을 테스트하기 위해 동일한 목적(IHC)(즉, 웨스턴 블롯 또는 유세포분석 기술뿐만 아니라)으로 테스트된 항체의 사용을 권장합니다. 복강내 주사, 복강내 주입, 경구 섭취, 또는 뇌실내 주입과 같은 BrdU 염색을 투여하기 위해 상이한 경로가 사용될 수 있다(각 기술에 대한 보다 상세한 설명은 참고문헌26 참조). 복강 주사를 선택한 경우 BrdU가 장 영역을 피하면서 복강 내로 투여되는지 확인하십시오. 장에는 BrdU가 뇌에 도달하기 전에 고갈될 수 있는 여러 개의 세포가 복제되어 있기 때문에 표지된 세포의 수에 영향을 미칩니다. 얇은 섹션은 용액의 더 나은 침투를 허용하기 때문에 얻는 것이 중요합니다. 40μm 두께의 관상 절편을 연단-꼬리로 절단하고 Kempermann et al.27에 의해 제안된 입체학적 절차에 따라 24웰 세포 배양 플레이트로 옮겼습니다. 면역 조직 화학은 슬라이드에 장착 된 조직 또는 자유 부동 섹션으로 수행 할 수 있습니다. BrdU는 세포핵 깊숙이 위치하기 때문에 자유 부동 섹션에 용액이 침투하여 더 나은 결과를 제공하고 관심 영역에 더 잘 접근할 수 있습니다. 1차 항-BrdU 항체 접근을 허용하기 위해 DNA 결합(DNA 변성)을 여는 것이 중요합니다. 이 작업에서는 HCI 배양을 사용하여 이러한 특정 절차를 수행했습니다. 한편, 비특이적 에피토프를 차단하는 과정은 세포 신호를보다 정확하게 식별 할 수있게했다.
양호한 막 투과화는 항체가 관심 영역을 적절하게 침투하도록 합니다. Triton X-100과 같은 투과제를 PBS++ 및 PBS+ 용액에 추가하면 막 투과화가 향상됩니다. PBS 및 트리스 완충 식염수(TBS) 시약 모두 이 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 예산 측면에서 TBS는 PBS보다 상대성 이론이 저렴할 수 있습니다. 그러나 PBS는 항인산 항체를 방해하고 알칼리성 포스파타제 접합 항체를 억제할 수 있으므로 표적이 인산화에 의해 번역 후 변형(즉, 인산화)되는 경우 PBS의 사용을 피하십시오. 우리는이 작업에 PBS를 사용했으며 조직 세척 단계가보다 구체적인 신호를 제공한다는 것을 알았습니다. 또한 연구자에게 TBS o PBS를 사용하여 최소 3회의 세척 주기를 수행할 것을 권장합니다. 솔루션은 새로 준비해야합니다. 항원 검색(AR)은 3차 및 4차 항원의 구조를 수정하는 고정으로 인한 항원성 손실을 줄이기 위한 방법입니다. 이러한 감소는 항원을 항체28,29에 의해 검출할 수 없게 만든다. 이 프로토콜에 사용 된 열 유도 에피토프 검색 (HIER)은 고온 또는 강알칼리성 가수 분해 (EDTA pH 8.5 또는 Tris pH 9.5와 같은 다른 완충 용액 사용)에 의해 포름 알데히드와 단백질 사이의 화학 반응을 역전시키려고 시도했습니다. 결과를 비교하고 프로토콜에 가장 적합한 항체를 선택하려면 다양한 AR 프로토콜로 새로운 항체를 테스트하는 것이 중요합니다. 이 마지막 단계는 일반 프로토콜에서 선택 사항일 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜에 대해 더 나은 결과를 제공하기 위해 항원 검색 프로토콜로 조직을 처리했습니다.
비염색 구조를 가시화하고 면역 반응으로 인한 1차 염색 색상을 마스킹하는 것을 방지하는 데 사용되는 기본 염색 색상 및 방법을 고려하여 올바른 최종 대비 색상과 카운터 염색 기술을 선택하는 것이 중요합니다. 형광 현미경의 경우 DAPI (4', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌)는 DNA의 AT 영역에 결합 할 때 청색 형광 (흡수 : 360 nm, 방출 : 460 nm)을 방출하는 매우 인기있는 핵 및 염색체 대조 염색입니다. DAPI 함유 장착 매체를 사용할 수 있으며 사용하기 쉽습니다. 이는 이미지 획득을 위한 뛰어난 신호 유지를 제공합니다. 과산화물 반응의 경우, IHC는 크레실 바이올렛, 헤마톡실린, 중성 적색 또는 메틸 그린 염색과 같은 상이한 옵션으로 이용가능하였다. 다중 면역염색 기술의 경우, 교차 반응성을 피하기 위해 사용되는 고정 기술과 양립할 수 있는 항체를 선택하는 것이 중요합니다30. 단일 염색의 문제와 합병증이 해결되면 필요에 따라 다른 색상 염색을 투여하십시오. 2차 항체 사이의 비특이적 결합을 조절하는 것이 중요하다. 이는 1차 항체의 동일한 숙주 종에서 생산된 2차 항체를 사용하기 전에 1차 항체를 포화시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 토끼에서 생산된 항 마우스 및 염소에서 생산된 항-토끼 2차 항체를 사용하는 경우, 염소 항체에서 생산된 항-토끼는 토끼에서 생산된 항 마우스 항체를 사용해야 한다. 순차적 방법이 완전히 지배되면 동시 면역 염색 과정을 시작할 수 있습니다. 이 방법에서는 2 차 항체를 적절하게 선택하는 것이 필수적입니다. 이상적으로, 모든 항체는 교차 반응을 피하기 위해 동일한 숙주 동물로부터 나와야 합니다. 염색 방법이 출생 후 해마 조직(이 연령대의 풍부한 신경 발생)에서 정확하게 작동하는지 확인하기 위해 양성 대조군을 실행하는 것이 좋습니다. 양성 대조군 조직에서 염색 문제가 보이면 절차를 검토 및 검토하고 수정 및 조정하고 좋은 염색이 생성 될 때까지 반복하십시오. 그런 다음 음성 대조군을 실행하여 특정 1차 항체를 생략하거나 정상 혈청(1차 항체와 동일한 종)으로 대체하여 항체가 올바르게 작동하는지 테스트합니다. 소개에서 언급했듯이 이미지 디콘볼루션은 강력한 도구이며 컨포칼 현미경을 사용할 수 없을 때 대안을 제공합니다. 투과광 명시야, 광시야 형광 및 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 얻은 모든 이미지에 이미지 디콘볼루션을 적용할 수 있습니다. 이미지 디콘볼루션의 궁극적인 목적은 획득 시스템이 열화된다는 원래 신호를 재구성하는 것입니다10.
요약하면, 티미 딘 유사체 BrdU의 면역 검출에 의해 시각화 된 새로 생성 된 세포의 식별은 복잡하지만 강력한 기술입니다. 이 연구는 특히 성인 해마 신경 발생 분야의 과학자들이 새로운 세포를보다 정확하게 정량화하는 데 도움을주기위한 시도입니다. 우리는 이러한 노력이 과학계에 도움이 되었고 면역조직화학 기술에 의한 세포 증식 연구를 더 쉽게 미세 조정할 수 있기를 바랍니다.

평생 동안 성인 인간의 뇌에서 새로운 뉴런이 생성된다는 생각은 수십 년 동안 과학계를 매료 시켰습니다. 뇌가 평생 동안 새로운 뉴런을 생성한다는 지식은 분열 1,2에서 세포의 검출을 통해 얻어졌습니다. 성인 뇌에서 새로 생성 된 뉴런의 검출은 쥐에 삼중 티미 딘 (thymidine-H3)을 두개 내 주사하고자가 방사선 촬영 1,2로 세포주기에서 세포를 검출함으로써 처음 확인되었습니다. glia의 세포 분열과 신경 모세포의 존재가보고되었으며, 이는 출생 후 신경 발생1에 대한 최초의 유망한 데이터였습니다. 그럼에도 불구하고 thymidine-H3의 사용 및 검출은 방사능의 사용을 의미했으며, 이는 방사능을 관리하는 사람들에게 해로울 수 있습니다. 신경계에서 세포의 증식, 이동 및 기원 연구에서 BrdU 면역 조직 화학의 적합성을 조사하는 첫 번째 노력은 Miller와 Nowakowski3에 의해 1988 년에 나타났습니다. 1998 년 Eriksson과 동료들이 발표 한 논문에 따르면 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU) 4을 주사 한 환자의 인간 성인 뇌에서 새로운 뉴런이 사후에 시각화되었습니다. 이 환자들은 종양의 성장을 표지하기 위해 BrdU 주사 (250mg 정맥 주사)를 받았다4. 이 기술은 동물 모델에 채택되었습니다. 이러한 방법의 도입은 방사성 화합물을 사용하지 않고 새로 생성된 세포를 검출할 수 있었기 때문에 이 분야의 이정표가 되었습니다. 이 절차는 해당 분야의 추가 연구를 촉진하기 위해 성인 뇌 틈새에서 세포 증식을 측정하는 황금 표준이 되었습니다.
티미딘 유사체 기술의 한계는 새로 생성된 세포에 대한 세포 정체성의 결정을 허용하지 않는다는 것이다. 그러나 면역 조직 화학을 통해 동일한 세포의 이중 또는 삼중 표지 기술을 수행 할 수 있으며, 이는 새로 생성 된 세포의 세포 운명과 성숙 단계를 검증하여 분야의 추가 진화로 이어집니다. 이 방법은 새로 생성된 세포를 신경교, 미분화 뉴런 또는 완전히 성숙한 과립 세포로 분화시키고 회로에 적극적으로 참여하고 있는지 확인하는 것까지 특성화되었습니다. 이 분야의 또 다른 돌파구는 네스틴 도메인 하에서 미분화 세포를 식별하기 위해 형질 전환 모델을 사용하는 것이 었습니다. 네스틴-GFP 형질전환 마우스는 강화된 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하며, 이는 네스틴 프로모터의 제어 하에 있습니다. Nestin은 전구 세포5를 특징으로하는 중간 필라멘트입니다. 네스틴-GFP 형질전환 마우스는 신경발생에 관여하는 초기 발달 단계를 확립할 수있었습니다6. 그러나 중요한 한계는 실험실 시설에서 특수 조건 하에서 nestin-GFP 형질전환 마우스 콜로니를 유지할 수 있다는 것인데, 이는 일부 과학 그룹, 특히 개발도상국의 그룹에 비용 효율적입니다.
위에서 언급 한 기술에는 장점과 단점이 있습니다. 그러나, 면역조직화학(IHC)에 의한 증식 세포의 동정 및 세포 성숙 단계 또는 세포 운명을 확인하기 위해 면역형광법에 의한 이중 또는 삼중 표지 기술을 수행할 수 있는 가능성은 지금까지 성체 신경발생을 측정하는 가장 실현 가능한 방법을 나타낸다. 면역조직화학을 이용한 동정 과정은 단백질, 단백질 도메인 또는 뉴클레오티드를 1차 항체로 알려진 인식을 허용하는 특정 항체로 표지하는 것으로 구성됩니다. 후자는 2차 항체에 의해 인식되며, 이는 2차 항체와 결합된 발색체 (예를 들어, 양 고추냉이 퍼옥시다제) 또는 플루오로크롬 (예를 들어, FITC)으로 표시된다. 현미경은 크로모겐과 형광 색소 신호를 모두 감지할 수 있습니다. IHC를 사용하여 막 단백질, 세포 골격 단백질 또는 BrdU와 같은 핵 구성 요소를 확인할 수 있습니다. 반면에 BrdU는 경쟁에 의해 S상 동안 DNA에 통합되기 때문에 세포핵에서 찾을 수 있습니다. 따라서 중요한 단계는 HCl을 사용한 DNA 변성으로, 이는 DNA 결합을 열어 BrdU 항체가 DNA 내의 BrdU에 접근할 수 있도록 합니다. BrdU는 복강 내 투여 후 각각 15 분 및 60 분 동안 마우스와 랫트 혈청에서 포화 농도로 존재 한 다음 각각 60 분 및 120 분에 검출 할 수없는 수준으로 급격히 떨어진다는 것을 아는 것이 중요합니다7.
여기에서는 DAB (3,3'- 디 아미노 벤지딘) 산 신호 증폭 (4.1 단계)과 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 반응을 사용한 발색 간접 검출 (4.1 단계), 아비딘-비오틴 복합체 (ABC) 증폭 (4.1 단계), 신호 증폭이없는 간접 면역 형광 검출 (4.4 단계) 및 표지 된 스트렙 타비 딘-비오틴 (LSAB) 증폭 (4.3 단계). 각 방법에는 장점과 단점이 있으며 특정 조직 요구 사항에 유용할 수 있습니다( 표 1 참조). 우리는 비접합 1차 항체를 사용할 때 발색성 검출 방법에서 형광 검출 방법으로 변경하기 위해 경제성과 단순성 때문에 간접 ICH 방법을 따르기로 결정했습니다. HRP 접근법은 경제성, 높은 안정성, 높은 회전율 및 기판의 전체 가용성으로 인해 일반적으로 사용되는 IHC 방법입니다. 그럼에도 불구하고 염색 방법이 정확하게 작동하는지 확인하기 위해 양성 대조군을 사용하고 항체 기능을 효과적으로 테스트하기 위해 음성 대조군을 사용하는 것이 좋습니다. 다중 면역염색 또는 다중 IHC 방법(6단계 참조)은 단일 실험에서 조직 절편으로부터 많은 양의 데이터를 획득할 수 있는 강력한 도구이다. 이 기술은 샘플의 가용성이 제한적일 때 특히 중요합니다. 또 다른 장점은 조직 무결성을 유지하면서 동일한 세포 공간에서 공동 발현되는 특정 단백질을 동시에 식별할 수 있다는 것입니다. 멀티플렉스는 특정 증식 단계 (예를 들어, 네스틴, GFAP, DCX, Ki-67) 동안 발현된 상이한 마커를 염색할 수 있게 하여, 보다 상세한 증식 및분화 연구8에 도달할 수 있게 한다. 교차 반응을 피하기 위해 사용되는 고정 기술과 호환되는 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 각각의 새로운 항체(BrdU 포함)를 개별적으로 검사하여 방법을 조정하고 개선하는 것이 좋습니다. 그런 다음 이중 순차 염색을 도입하고 마지막으로 순차 방법이 완전히 지배될 때 동시 면역 염색 프로세스를 시작합니다. 이 방법에 적합한 2차 항체를 선택하는 것이 중요합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>메서드</td>
			<td>구체적인 방법</td>
			<td>장점</td>
			<td>단점</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">간접 검출 방법</td>
			<td>DAB와의 과산화효소 반응</td>
			<td>1. 직접 검출 및 간접 형광 방법보다 감도가 높습니다. 2. 형광 색소보다 광퇴색에 대한 내성이 높습니다. 3. 형광 검출 방법보다 저렴한 비용</td>
			<td>1. 더 적은 색 염료로 다중화하기가 어렵습니다. 2. 동일한 세포 공간에서 공동 발현 된 표적에 대해 복잡합니다. 3. 동일한 조직에서 동시에 희소하고 높은 풍부한 표적에 대한 동적 범위 감소.</td>
		</tr><tr><td>형광</td>
			<td>1. 더 많은 색깔 염료를 가진 다중화를 위한 제일 그리고 가장 쉬운. 2. 동일한 세포 공간에서 공동 발현된 표적에 가장 적합합니다. 3. 동일한 조직에 동시에 희소하고 높은 풍부한 표적에 대한 더 나은 동적 범위. 4. 추가 단계가 없습니다.</td>
			<td>1. DAB 방법을 사용한 간접 과산화 효소 반응보다 민감도가 낮습니다. 2. 시간이 지남에 따라 광퇴색에 대한 약한 저항. 3. 더 비쌉니다.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">신호 증폭 방법</td>
			<td>아비딘-비오틴 복합체(ABC)</td>
			<td>1. 직접 및 간접 검출 방법보다 감도가 높습니다. 2. 배경 줄이기</td>
			<td>1. 추가 단계. 2. 증폭하지 않는 것보다 비쌉니다.</td>
		</tr><tr><td>표지 된 스트렙타비딘-비오틴 (LSAB)</td>
			<td>1. 직접 및 간접 검출 방법보다 감도가 높습니다. 2. ABC 방법보다 더 실질적인 조직 침투. 3. 배경 줄이기</td>
			<td>1. 추가 단계. 2. ABC 방법보다 비쌉니다.</td>
		</tr><tr><td>추가 증폭 방법이 아님</td>
			<td>1. 비용 절감. 2. 추가 단계가 없습니다. 3. 높은 풍부한 표적에 이상적입니다.</td>
			<td>1. 낮은 감도 : 풍부한 목표가없는 문제.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: IHC 기술의 장점/단점. 이 표는 간접 검출 방법의 장점 / 단점을 보여줍니다 : (3,3'- 디 아미노 벤지딘) DAB 및 형광과의 퍼 옥시 다제 반응; 및 신호 증폭 방법 : 아비딘-비오틴 복합체 (ABC), 표지 된 스트렙 타비 딘 - 비오틴 (LSAB) 및 추가 증폭 방법이 아닙니다.
고해상도 이미지는 적절한 분석을 수행하고 결과를 제시하는 데 필수적입니다. 해상도를 향상시키는 두 가지 접근법이 있습니다 : 1) 더 나은 현미경 디자인 (예 : 공초점, 다광자) 사용 또는 2) 디콘볼 루션9을 사용하여 이미지를 향상시키기 위해 흐림 프로세스를 수치 적으로 반전시킵니다. 불행히도, 컨포칼 현미경은 장비 및 서비스 비용이 높기 때문에 저렴하지 않습니다10. 광시야 에피형광 현미경과 z-스택 이미지의 후속 디콘볼루션은 컨포칼 현미경 8,9에 대한 적합하고 저렴한 대안을 제공합니다. 전술한 바와 같이, 디콘볼루션 목표는 수학적 제거 알고리즘(10)을 사용하여 에피형광 또는 컨포칼 현미경에 의해 얻어진 이미지에 나타난 흐림, 초점이 맞지 않는 헤이즈 및 왜곡을 감소시킴으로써, 획득 시스템(9)에 의해 저하되었던 원래의 신호를 복원하는 것이다. 획득 된 흐릿한 이미지는 3D 포인트 스프레드 함수 (PSF)로 관찰 된 물체를 변환 한 결과로 수학적으로 모델링 할 수 있습니다. PSF는 조직 샘플에 의해 방출되고 현미경에 의해 수집 된 빛의 점들의 이론적 회절 패턴이다. PSF 파일은 카메라의 CCD 셀 간격, 사용 된 매체의 굴절률, 대물 렌즈의 개구수, 형광단의 발광 파장, 이미지 크기, z-stack 처리 방법의 이미지 수 및 그 사이의 공간과 같은 각 이미지의 특정 조건으로 생성됩니다 (표 2의 기술 사양 참조). 즉, PSF 파일은 현미경 관찰에 대한 이미징 설정의 효과를 요약합니다9. 그러나 회절 PSF 3D 플러그인(https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D)을 사용하여 각 z 스택 이미지에 대한 고유한 PSF 파일을 만듭니다. Z 스택 이미지는 슬라이드의 동일한 XY 위치에서 정의된 깊이(z축)에서 디지털화된 일련의 광학 섹션입니다. 컴퓨터는 다른 초점면에 위치한 물체에서 시작된 신호를 재 할당하여 초점 평면에서 얻은 정보를 컴파일합니다. z-스택 이미지를 생성하려면 슬라이드의 서로 다른 초점 레이어에서 이미지를 가져와야 합니다(예: 1μm 깊이마다 동일한 XY 영역의 서로 다른 이미지 10개). 그런 다음 제조업체 또는 피지에서 제공하는 현미경 소프트웨어를 사용하여 z-stack 또는 3D 이미지를 생성합니다. 결과는 단일 스택 이미지 파일(예: 초점이 다른 10개의 이미지)이 됩니다. 디콘볼루션 현미경을 위한 오픈 소스 소프트웨어와 같은 몇 가지 고객별 도구 및 소프트웨어 솔루션이 있습니다. 피지11 플러그인 인 DeconvolutionLab29 (ImageJ12 배포)를 사용하여 디콘볼루션 프로세스의 출력을 보여줍니다. 디콘볼루션은 최종 현미경 사진의 해상도를 향상시키는 데 도움이 됩니다(그림 1B, C 참조). 자세한 내용과 지침은 참고자료13을 읽어 보시기 바랍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> 그림 1: 여러 색상 채널에 대한 3D 디콘볼루션의 대표 이미지. (A) 저배율에서 DG. (B) 각 채널의 원본 z-스택 이미지와 병합된 이미지. (c) 각 채널 및 병합된 이미지에 대한 3D 디콘볼루션 z-스택 이미지. 이 뇌는 신체 활동 그룹의 일부인 쥐에서 나온 것입니다. 표지된 스트렙타비딘-비오틴(LSAB) 증폭 방법을 사용하였다. BrdU(적색), DAPI를 카운터염색(파란색), 신경교세포섬유산성 단백질(GFAP)을 성상교세포 마커(녹색)로 나타내는 Cy3 스트렙타비딘 접합 항체를 보여주었습니다. ML = 분자층; GCL = 과립 세포층; SGZ = 하위 입상 영역. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 연구의 목적은 면역 염색으로 긍정적이고 성공적인 결과를 얻는 단계에 대한 자세한 설명을 제공하고 컨포칼 현미경을 사용하지 않고 BrdU 기반 연구에서 일반적으로 사용되는 단계를 나열하는 것입니다. BrdU 염색은 성공적인 염색을 위해 주의 깊게 따라야 하는 여러 단계가 필요한 기술입니다. 이러한 염색 기술을 표준화하는 데는 일반적으로 수개월이 걸리며 시간과 자원이 많이 소요됩니다. 우리는 이 기사가 시간과 오류를 줄임으로써 이 분야에서 시작하는 그룹에 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대했습니다.

<table><tbody><tr><td>시약 준비 및 설정</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donor Horse Serum</td><td>BioWest</td><td>S0900</td> PBS 파라포름알데히드 시약 등급의 <td>차단 및 배양 솔루션</td></tr><tr><td>, 결정질(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>독성, 가연성</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>746436-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨, 일염기성</td><td>J.T Bker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>J.T Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Meyer</td><td>2365-500G</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>Corrisive, pH 교정</td></tr><tr><td>용, 인산나트륨 이염기</td><td>성 Sigma-Aldrich</td><td>S9763-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoxyuridine, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>독성 (돌연변이 유발, 기형 유발)</td></tr><tr><td>23&ndash; 27G 피하 주사 바늘</td><td>BD PrecisionGlide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>식염수 용액</td><td>PiSA</td><td>30130032</td><td></td></tr><tr><td>주사기 1 mL</td><td>NIPRO</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>TISSUE PREPARATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50-ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>해부 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr>: <tr><td>단두대,</td><td>스톨팅</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>마이크로톰, 저온 유지 장치,</td><td>MICROM</td><td>HM525</td><td></td></tr>, <tr><td>넷웰 15mm 폴리에스테르 메쉬, 멤브레인 인서트,</td><td>12웰 배양 플레이트에 사전 로드</td>된 <td>Corning</td><td>3477</td></tr>, <tr><td>넷웰 플라스틱 12웰 캐리어 키트</td>, 15mm 폴리에스테르 메쉬용 <td>Corning</td><td>3520</td><td> 멤브레인 인서트</td></tr><tr><td>Netwell 플라스틱 6웰 캐리어 키트</td><td>Corning</td><td>3521</td><td></td></tr><tr><td>관류 펌프</td><td>Cole-Parmer</td><td>7553-70</td><td></td></tr><tr><td>Shaker</td><td>IKA</td><td>ROKCER 3D Digital</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td>1%, 감광성</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase (HRP) 기판 키트(니켈 포함), 3,3'-디아미노벤지딘</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>발암성, 감광성</td></tr><tr><td>Hydochloric Acid</td><td>J.T.Baker</td><td>9535-05</td><td>부식성, pH 보정용</td></tr><tr><td>과산화수소, 50%</td><td>Meyer</td><td>5375-1L</td><td>독성, 산화성</td></tr><tr><td>Permount 장착 매체</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td>을 사용한 VECTASHIELD 안티페이드 마운팅 매체 <td>빛에 민감한</td></tr><tr><td>VECTASTAIN&reg; Elite&reg; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td></tr><tr><td>Primary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA056030</td><td>1:500</td></tr><tr>Mouse <td>Sigma-Aldrich</td><td>B2531</td><td>에서 생산된 단클론 Anti-BrdU 항체</td><td>1:250</td></tr><tr><td>2차 항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-065-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>G-21040</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5393</td><td>1:250</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H + L) 교차 흡착, FITC</td><td>Invitrogen</td><td>F-2765</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidin, Cy3</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-1300</td><td>1:250</td></tr><tr><td>IMAGING AND ANALYSIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>Dell Computer Company</td><td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td><td>프로토콜의 프로세스 제어 및 모니터링용</td></tr><tr><td>CCD-카메라</td><td>Olympus</td><td>UC50</td><td></td></tr><tr><td>CellSens 표준 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>cellSens Standard Edition</td><td>수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>Epifluorescent microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>고압 130W 수은 아크 램프</td><td>Olympus</td><td>U-HGLGPS</td><td></td></tr><tr><td>저 자가형광 이멀젼 오일</td><td>Olympus</td><td>MOIL-30 Type F</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 커버 안경 (VWR, 카탈로그 번호 48404 454; 24&nbsp; 60 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (VWR, 카탈로그 번호 48323-185; 76&nbsp; 26 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-FBW 필터 큐브</td><td>Olympus</td><td>U-FBW</td><td>여기 460 - 495 nm, 이색성 미러 505 nm, 억제 510 nm</td></tr><tr><td>U-FGW 필터 큐브</td><td>Olympus</td><td>U-FGW</td><td>여기 530 - 550 nm, 이색성 미러 570 nm, 억제 575 nm</td></tr><tr><td>U-FUW 필터 큐브</td><td>Olympus</td><td>U-FUW</td><td>여기 340 - 490 nm, 이색성 거울 410 nm, 억제 420 nm</td></tr></tbody></table>

thymidine analog brdu를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

성인 해마 신경 발생 (AHN) 분야에서 가장 중요한 것 중 하나는 새로 생성 된 세포의 식별입니다. 티미딘 유사체(예: 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU))의 면역검출은 이러한 새로 생성된 세포를 시각화하는 데 사용되는 표준 기술입니다. 따라서 BrdU는 일반적으로 작은 동물에 복강 주사되므로 티미 딘 유사체는 DNA 합성 중에 분열하는 세포에 통합됩니다. 검출은 뇌 절편의 면역 조직 화학 분석에 의해 수행됩니다. 이 기술을 사용해 온 모든 연구 그룹은 성공적인 염색을 달성하기 위해 미세한 세부 사항에 특별한주의가 필요하다는 것을 알 수 있습니다. 예를 들어, 중요한 단계는 HCl을 사용한 DNA 변성으로, 이를 통해 세포핵에 도달하여 염색할 수 있습니다. 그러나 기존의 과학 보고서는 그러한 단계를 자세히 설명하는 것은 거의 없습니다. 따라서 긍정적이고 성공적인 결과를 산출하는 데 몇 개월이 걸릴 수 있으므로 새로운 실험실에서는 기술을 표준화하는 것이 어렵습니다. 이 연구의 목적은 티미 딘 유사체 BrdU로 작업 할 때 면역 염색 기술의 긍정적이고 성공적인 결과를 얻는 단계를 자세히 설명하고 정교화하는 것입니다. 프로토콜에는 시약 준비 및 설정, 설치류에서 티미딘 유사체 투여, 심경 관류, 조직 준비, 퍼옥시다제 면역조직화학 반응, 아비딘-비오틴 복합체 사용, 면역형광, 대조염색, 현미경 이미징 및 세포 분석이 포함됩니다.

위에서 설명한 방법은 추가 신체 활동이없는 대조군과 달리 자발적인 신체 활동 후 성인 쥐 해마에서 신생아 세포를 정량화하는 데 적용되었습니다. 우리는 출생 후 쥐 해마를 양성 대조군으로 사용했습니다. 생후 3개월령의 수컷 랫트는 7일 동안 자발적인 신체 활동 프로토콜(endless wheel) 하에 있었다. 6일째에, 래트에게 BrdU를 주사하였고 (섹션 2), 3회 완전 주사까지 매 12시간마다 주사하였다. 3개의 세포 주기 분열을 완료하기 위해, 동물을 마지막 BrdU 주사 8시간 후에 경심 관류 (섹션 3)하였다. 비교 대조군으로 사용하기 위해 신체 활동을하지 않은 3 개월 된 쥐에게도 동일한 절차가 사용되었습니다. 양성 대조군으로서, 생후 1일령 래트 새끼(출생 후 1일)에 상기 섹션 2에 기재된 바와 같이 BrdU를 1회 주사하였다. 주사 후 1 일 (출생 후 2 일째), 새끼를 안락사시키고, 그들의 머리를 단계 3.4에 설명 된대로 PFA 용액에 침지시켰다. 성인 래트를 심부 마취시키고(단계 3.1), 단계 3.2에 기재된 바와 같이 경심 관류시켰다. 뇌를 해부하고 사후 고정시켰다 (3.4 단계). 뇌를 40 μm 관상 절편으로 절단하였다(단계 3.5). 절편을 단계 4에 기재된 바와 같이 BrdU 면역조직화학에 대해 처리하였다.
염색(단계 4.1) 및 DG에서 BrdU 양성 세포 계수를 위해 DAB IHC와 함께 양 고추냉이 과산화효소 반응을 사용했습니다. 도 5 는 BrdU 표지된 세포를 갖는 DG 섹션을 나타낸다. 도 5C, D 는 고배율에서 DG 단면의 대표적인 부분을 나타낸다. 표지 된 세포는 화살표로 표시된 강렬한 어두운 염색을 보였다. 삽입물은 실험군 및 대조군에서 표지된 세포의 평균 수를 나타낸다(계수된 양성 세포에 6을 곱한 값은 단계 8.1에 기재된 바와 같이). 스튜던트의 t-검정은 BrdU 양성 세포 수 간에 유의한 차이를 나타냈습니다(t(10) = 2.704, p = 0.0222). 신체 활동을하지 않은 대조군은 2,040 ± 314 세포 (n = 6 랫트)를 보였다. 이에 비해 신체 활동 그룹은 평균 3,606 ± 486 (n = 6 랫트) BrdU 양성 세포를 보였다. 관찰 된 바와 같이, 신체 활동 노출은 BrdU 양성 세포를 증가시킵니다. 따라서, 이들 결과는 신체 활동이 성인 치아 이랑17에서 세포 증식을 증가시킨다는 것을 보여주는 다른 보고된 결과와 일치한다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> 그림 3: BrdU 표지된 세포핵의 다양한 형태의 예. BrdU는 핵을 표지하는 DNA 합성 마커입니다. 해마 영역에서, BrdU 양성 핵은 치아 이랑 하위 과립 영역에 위치한 반 타원형 모양을 가졌다. BrdU는 경쟁에 의해 통합되기 때문에 모든 세포에 대해 통합된 양은 나중에 핵이 시각화되는 방식에 반영될 변형을 갖게 됩니다. (A) 면역형광 이미지. (B) 추가적인 증폭 방법 없이 과산화효소 반응을 이용한 이미지를 제시한다. 노란색 화살표는 아티팩트 및 비특이적 신호를 나타냅니다. 검은색 또는 흰색 화살표는 BrdU+ 셀을 나타냅니다. 1 – 완전히 정리된 핵, 반타원형 핵 고도로 착색됨. 2 – 점이 있는 핵, 핵의 경계가 표시되고 내부에 여러 점이 있습니다. 3 – 점이 거의 없는 핵, 핵의 경계가 표시되고 내부에 적은 수의 점이 있습니다. 4 – 작은 핵은 다른 분화 단계에서 가능한 세포이지만 여전히 틈새의 일부입니다. 5 – 클러스터는 분열중인 전구체 세포이므로 응축 된 그룹으로 함께 여러 세포를 관찰 할 수 있습니다. 이러한 그룹 내에서 양성 세포의 잘못된 라벨링을 피하기 위해 특히 신중하게 계산해야 합니다. 빨간색 화살표는 단일 세포로 혼동될 수 있는 분열 중인 핵을 나타냅니다. 각 셀은 상자에 포함되어 있으며 Z 축 평면에서 실시간으로 구별 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> 그림 4: 단일 및 병합 채널의 대표적인 RGB 이미지. 위쪽 이미지는 원본 z-스택 이미지를 나타내고 아래쪽 이미지는 3D 디콘볼루션된 z-스택 이미지를 보여줍니다. (A) DG의 저배율. (B) 각 채널에 대한 RGB 영상, (C) RGB 병합 영상. 이것은 대조군의 뇌였습니다. 면역형광법은 추가적인 증폭 방법 없이 사용하였다. BrdU (빨간색), 대조 염색 (파란색)으로서의 DAPI, 성상 교세포 마커 (녹색)로서의 GFAP (신경교 섬유 산성 단백질). ML = 분자층; GCL = 과립 세포층; SGZ = 하위 입상 영역. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> 도 5: 각 실험군에 대한 BrdU 표지된 세포(강렬한 다크)를 갖는 대표적인 DG 절편. 퍼옥시다제 반응은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합체 증폭법과 함께 사용하였다. (ᄀ, ᄂ) DG의 낮은 배율을 표시하고, (C, D)는 더 높은 배율에서 상자 영역을 표시합니다. 패널 A 및 C는 신체 활동 그룹으로부터의 조직이고, 패널 B 및 D는 대조군으로부터의 조직이다. 삽입물은 신체 활동 및 대조군에서 표지된 세포의 평균 수를 나타낸다(계수된 양성 세포에 단계 8.1에 기재된 바와 같이 6을 곱함). ML = 분자층; GCL = 과립 세포층; SGZ = 아입계 영역; 화살표는 BrdU+ 셀을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1 : 다른 층에 분포 된 z 축을 따라 양성 세포의 다른 초점을 보여주는 비디오. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
동영상 2: 서로 다른 층에 분포된 z축을 따라 양성 세포 클러스터의 다른 초점을 보여주는 영상. z축 위로 천천히 이동하여 클러스터를 통합하는 여러 핵을 모두 정량화합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>현미경 유형:</td>
			<td colspan="5">에피형광 현미경 올림푸스 BX53</td>
		</tr><tr><td>광원:</td>
			<td colspan="5">고압 130W 수은 아크 램프 (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>수집 소프트웨어:</td>
			<td colspan="5">셀센스 스탠다드</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">필터 세트:</td>
			<td colspan="2">카탈로그 번호</td>
			<td>여기 범위</td>
			<td>이색 거울</td>
			<td>억제 범위</td>
		</tr><tr><td colspan="2">유푸</td>
			<td>340 - 490 나노미터</td>
			<td>410 나노미터</td>
			<td>420 나노미터</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 나노미터</td>
			<td>505 나노미터</td>
			<td>510 나노미터</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 나노미터</td>
			<td>570 나노미터</td>
			<td>575 나노미터</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">사진기:</td>
			<td colspan="2">모델:</td>
			<td colspan="3">CCD 카메라 UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">스펙트럼 범위:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CCD 칩 크기:</td>
			<td colspan="3">2/3인치, 2588(너비 *7) X 1960(높이 *8) 픽셀</td>
		</tr><tr><td colspan="2">픽셀 크기:</td>
			<td colspan="3">3.4 X 3.4 마이크로미터</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">형광 색소:</td>
			<td colspan="2">이름</td>
			<td>여기 파장 (nm)</td>
			<td>발광 *3 파장(nm)</td>
			<td>방출 색상</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 - 인돌 HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>파랑</td>
		</tr><tr><td colspan="2">테트라메틸로다민-이소티오시아네이트(TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>빨강</td>
		</tr><tr><td colspan="2">플루오레세인-이소티오시아네이트(FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>녹색</td>
		</tr><tr><td colspan="2">싸이3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>빨강</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">장착 매체 및 침지 오일:</td>
			<td colspan="3">이름</td>
			<td colspan="2">미디어의 굴절률 *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">공기(슬라이드와 렌즈 사이에 아무것도 없음)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">DAPI가 있는 페이드 방지 장착 매체</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">퍼마운트 마운팅 미디엄</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">저자가 형광 침지 오일 (MOIL-30 유형 F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">확대 렌즈(플랜 형석)</td>
			<td>확대</td>
			<td>개구수 (NA) *2</td>
			<td>분해능 (μm)</td>
			<td>이미지 픽셀 간격(nm) *5</td>
			<td>슬라이스 간격 Z축(nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4배</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10배</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20배</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40배</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100배</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 현미경 설정 사양 및 점 확산 기능(PSF) 파일 생성 요구 사항. 회절 PSF 3D 플러그인 창에는 PSF 파일을 만들 수있는 11 개의 슬롯이 있습니다. 각 슬롯의 설명은 다음과 같습니다: *1 - 매체 굴절률: 슬라이드와 렌즈 사이의 매체 굴절률(예: 공기 = 1.00029). *2 - 개구수 수치: 사용된 렌즈의 NA(다른 침지 미디어를 사용하고 렌즈를 할당한 경우 수정해야 함). *3 - 파장: 형광 색소 최대 발광 파장(nm). *4 - 종방향 구면 수차: 0.00. *5 - 이미지 픽셀 간격: CCD 픽셀 크기(nm)/배율(예: 3.4μm 및 100X 렌즈, 3400/100 = 34nm). *6 - 이미지 Z축 사이의 거리. *7 - 폭: 디컨벌루션할 이미지의 폭을 픽셀 단위로 입력합니다. *8 - 높이: 디컨볼루션할 이미지의 높이를 픽셀 단위로 입력합니다. *9 - 깊이, 슬라이스: z-스택의 이미지 수입니다. *10 - 정규화: 픽셀 값의 합 = 1. *11 - 제목: PSF 파일의 원하는 이름입니다. 파일은 지정된 고유한 z 스택 이미지와 일치해야 합니다.

이 논문은 쥐의 성인 신경 발생을 측정하기 위해 BrdU 양성 세포를 시각화하는 가장 일반적인 4 가지 기술을 제시합니다. 이 작업에는 시약 준비, 티미 딘 유사체 투여, 심경 관류, 조직 준비, 퍼 옥시 다제 면역 조직 화학 반응, 면역 형광, 신호 증폭, 카운터 염색, 현미경 이미징 및 세포 분석에 대한 지침이 포함됩니다.

Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

이것은 성인 신경 발생 분야의 핵심 프로토콜입니다. 여기에서는 성공적인 염색을 달성하는 데 필요한 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 기술은 조직 무결성을 보존하면서 분열 중인 세포에서 동시 발현되는 특정 단백질을 동시에 식별할 수 있도록 합니다.조직 항체와 상태를 미리 검사하는 것이 좋습니다. 중요한 단계는 막 투과화, 신중한 DNA 변성, 차단 및 세척 단계 시간 테스트입니다. 이 기술을 표준화하는 것은 새로운 실험실에서 어려운 일입니다.설치류에서 티미딘 유사체의 시약 준비 및 투여는 성공적인 결과에 매우 중요합니다.티미딘 유사체 BrdU 투여의 경우, 하복강을 고정시켜 실험용 쥐를 제지하고 23게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 새로 준비된 킬로그램당 50mg의 BrdU 용액을 복강내 주입합니다. 적절한 실험 종말점에서 뇌를 채취하고 뇌를 동결하여 저온 유지 장치 마이크로톰을 사용하여 40마이크로미터 두께의 코로나 절편을 획득할 수 있도록 하고 절편을 채취 순서대로 극저온 보호 용액의 24웰 세포 배양 플레이트의 개별 웰에 배치합니다. 모든 섹션이 수집되면 샘플을 섭씨 영하 20도에서 최대 몇 달 동안 보관하십시오.BrdU 염색을 평가하기 위해 아비딘-비오틴-과산화효소 복합체와 함께 과산화효소 반응을 사용하여 샘플이 실온에 도달할 때까지 극저온 보호 용액의 슬라이스를 0.1몰 PBS로 옮기고 세척당 새로운 0.1몰 PBS로 10분 동안 조직을 세 번 헹굽니다. 마지막 세척 후, 실온에서 30분 동안 내인성 과산화효소 차단 용액에 절편을 배양한 다음 0.1몰 PBS에서 10분 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 섭씨 37도에서 20분 동안 2개의 몰 염산에서 섹션을 배양한 다음 0.1 몰 붕산염 완충액에서 10분 동안 헹굽니다.얼음처럼 차가운 0.1몰에서 3회 세척한 후 PBS+차단 용액을 넣어 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양한 후 섭씨 4도에서 PBS+의 마우스 Anti-BrdU 1차 항체로 하룻밤 동안 배양합니다. 0.1몰 PBS를 3회 세척한 후 실온에서 PBS+에서 적절한 마우스 비오틴화된 2차 항체로 샘플을 2-4시간 동안 배양합니다. 세척 후 ABC 용액으로 실온에서 1시간 동안 단면을 처리한 다음 0.1몰 PBS 세척을 3회 수행합니다.마지막 세척 후 슬라이스를 DAB-Peroxidase Substrate Solution으로 옮겨 슬라이스가 짙은 회색이 될 때까지 2-10분 동안 배양합니다. 양성 세포를 시각화할 수 있는 경우, 15분 동안 수돗물을 3회 세척한 후 0.1몰 PBS를 3회 세척하여 샘플을 헹굽니다. 마지막 세척 후 부드러운 브러시를 사용하여 젤라틴 슬라이드에 슬라이스를 조심스럽게 장착하고 실온에서 밤새 공기 건조합니다.다음날 아침에는 영구 장착 매체를 사용하여 샘플 위에 커버 슬립을 놓습니다. BrdU 양성 세포를 정량화하려면 먼저 현미경에서 4배 배율을 사용하여 치상회를 식별하고 Z축을 따라 과립 세포층에서 BrdU 표지 핵을 주의 깊게 검색합니다. 치상회(dentate gyrus) 전체에서 세포를 검색하기 위한 간격 섹션을 선택한 후 모든 BrdU 양성 세포를 계산합니다.표지된 핵의 형태는 세포가 얼마나 많은 BrdU를 포함했는지에 따라 달라질 수 있습니다. Z축을 천천히 이동하여 동물당 최소 10개의 절편과 군집을 통합하는 그룹당 최소 5개의 동물에서 모든 핵을 정량화합니다. 이미지 디콘볼루션의 경우 회절점 확산 함수 3D 플러그인을 열고 필요한 모든 데이터를 입력한 다음 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다.그런 다음 DeconvolutionLab2 플러그인을 열고 일치하는 Z 스택 이미지와 PSF 파일을 해당 창 슬롯으로 드래그합니다. 디콘볼루션 알고리즘과 반복 횟수를 선택하고 실행을 클릭합니다. 디콘볼루션된 이미지를 단일 Z 스택 이미지로 결합하려면 이미지 및 스택을 선택하고 Z 프로젝트를 클릭합니다.프로젝션 유형 메뉴에서 Max Intensity를 선택합니다. 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다. RGB 이미지를 만들려면 Image and Color를 선택하고 Merge Channels를 클릭하여 드롭다운 메뉴에서 해당 이미지를 원하는 컬러 채널로 설정합니다.그런 다음 복합 만들기 상자를 선택 취소합니다. 확인을 클릭하고 파일을 저장합니다. 모든 채널 이미지가 생성되면 두 개 이상의 이미지 파일을 열고 각 이미지 파일에 대해 다른 색상 채널을 선택하여 RBG 이미지를 만듭니다.이 이미지에서는 BrdU 표지된 세포가 있는 대표적인 치상회(dentate gyrus) 절편을 관찰할 수 있습니다. 이러한 절편의 확대된 이미지에서 관찰된 바와 같이, 표지된 세포는 강렬한 어두운 염색을 보여줍니다. 참고로, 신체 활동을 하지 않은 통제된 쥐와 신체 활동에 노출된 실험군 사이에는 BrdU 양성 세포 수에서 상당한 차이가 있으며, 이는 신체 활동이 성체 치상회에서 세포 증식을 증가시킨다는 것을 입증한 다른 보고된 결과와 일치합니다.이 프로토콜을 시도할 때는 새로 준비된 용액을 사용하고 조직을 부드럽게 다루십시오. 해마는 이를 통해 치료할 때 슬라이드의 나머지 부분과 분리되기 쉽고 놓칠 수 있습니다. 이 절차는 DNA 합성 및 이중 염색 세포 증식 연구의 DNA 라벨 및 인덱스 평가에 적용할 수 있습니다.우리는 이러한 노력이 과학계에 도움이 되었기를 바라며, 면역조직화학 기법을 사용할 때 세포 증식 연구에서 새로운 질문에 더 쉽게 답할 수 있기를 바랍니다.

immunohistochemistry-techniques-to-analyze-cellular-proliferation

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 세포 분열의 두 연속 라운드를 정할 성인 생쥐의 조직에 thymidine의 analogues의 연속 결합 (CldU과 이두)을 감지하는 전략을 파생합니다. 이 전략은 세포 수명이 긴 조직의 매상, 종양 발생 변형, 또는 교통 - 확장 세포를 감지하는 데 유용합니다.

기본 조직의 두 Thymidine의 Analogues의 Immunofluorescent 검색 (CldU 및 이두)

이 비디오에서는 방사성 추적자 트리티딘이 세포의 DNA에 혼입되는 것을 측정하여 신경 전구 세포의 증식 능력을 결정합니다. 이 기술은 특정 약물 및 성장 인자로 치료한 후 세포 증식을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

DNA Synthesis Assay: A technique to assess DNA synthesis in proliferating cells using radioactive tritiated thymidine incorporation(방사성 트리티화 티미딘 결합을 사용하여 증식 세포에서 DNA 합성을 평가하는 기술)

출처: Olesen, M. V., et al. 전기 경련 요법의 쥐 모델에서 세포 수를 추정하는 광학 분획기 기술. J. vis. exp. (2017).  이 비디오는 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런을 정량화하는 기술을 보여줍니다. Bromodeoxyuridine(BrdU) 표지된 뉴런을 포함하는 해마 조직 절편을 면역조직화학을 사용하여 염색한 후 광학 분획기 기술을 사용하여 조직 두께 전체에 걸쳐 정량화했습니다.

광학 분획기 기법을 사용하여 쥐의 뇌 조직에서 새로 생성된 뉴런 정량화

성인 태생 포유류의 신경 세포의 기능은 조사의 활성 영역 남아있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생을 억제한다. 컴퓨터 단층 촬영 유도 초점 조사 (CFIR)를 사용하여, 특정 신경 전구 인구 입체 해부 타겟팅 이제 성인 신경의 기능적인 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다.

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

티미 딘의 두 개의 아날로그의 행정, 에듀와 BrdU의는 임신 한 생쥐의 배아 마우스의 뇌에있는 신경 및 전구 세포의 세포주기 진행의 분석을 할 수 있습니다. 이 방법은 두뇌 개발 중에 전리 방사선 등의 유전 독성 스트레스의 효과를 확인하는 데 유용합니다.

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

이 입문 수준 프로토콜은 미세아교세포와 신경 요소에 대한 마커를 예로 들어 설치류 뇌의 면역조직화학적 염색을 완료하는 데 필요한 시약, 장비 및 기술을 설명합니다.

미세 아교 세포와 신경 세포에 대한 예 염색 : 저온 절단 된 쥐의 뇌 조직에서 면역 조직 화학에 대한 입문서

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

이 프로토콜에는 생쥐에서 신뢰할 수 있는 HFS 메서드를 설정 하는 방법을 보여 줍니다. Hippocampal가 뇌 전체 신경 전기 HFS 직접 및 간접적으로 비보에 의해 자극 된다. 신경 활동 및 분자 신호 검사 c-fos 와 Notch1 immunofluorescent 얼룩, 각각; 성체는 bromodeoxyuridine 분석 결과 라벨에 의해 정량 이다.

고주파 자극에 의해 마우스가 뇌의 활성화에 대 한 침략 적 방법

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

학습하세요 쥐의 성체 신경발생을 평가하는 면역조직화학 기법으로 BrdU 양성 세포를 시각화하는 방법을. 이 기술은 세포 증식 측정과 조직 완전성 보존에 필수적입니다.

Thymidine Analog BrdU를 사용하여 쥐의 세포 증식 및 신경 발생을 분석하는 면역 조직 화학 기술

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