마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

이 프로토콜은 온전한 또는 소프트 랩 미크론 해상도의 비파괴 이미징을 가능하게 합니다. 동물의 생리학, 해부학 및 발달 메커니즘을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 파리는 조직을 해부할 필요 없이 온전한 상태로 이미지화되기 때문에 조직과 장기의 공간 구조가 원래 상태로 유지되고 쉽게 관찰할 수 있습니다.

Micro CT는 파리의 인간 질병을 모델링하거나 삶의 질에 영향을 미치는 발달 결함을 이해하는 것을 목표로 하는 연구에 이상적인 도구입니다. 또한 공학, 물리학, 재료 과학, 지질학 및 인류학과 같은 다른 분야에서도 유용한 것으로 입증되었습니다. 이미징을 위한 관심 발달 시점을 선택한 후, 5-20마리의 동물을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 1ml의 PBST로 옮기고, 소수성 코팅을 제거하고 동물이 완전히 잠길 수 있도록 주기적으로 두드리면서 실온에서 5분 동안 튜브를 배양합니다.

배양이 끝나면 PBST를 1ml의 Bouin 용액으로 교체하고 튜브를 두드려 파리를 완전히 잠깁니다. 유충 및 번데기 샘플의 경우 실온에서 2시간 배양 후 동물을 5분 동안 세 번 세척하고 세척당 1ml의 신선한 PBS를 세척합니다. 마지막 세척 후, 해부 현미경으로 웰당 새로운 PBS가 들어 있는 다중 웰 해부 접시에 샘플을 옮기고, 홀더에 부착된 작은 미세 핀을 사용하여 각 샘플의 전방 및 후방 큐티클에 구멍을 뚫고 밑에 있는 연조직을 방해하지 않도록 주의합니다.

큐티클을 관통 한 후, 실온에서 24 시간 동안 새로운 1.5 밀리리터 튜브에 1 밀리리터의 신선한 Bouin 용액으로 샘플을 배양 한 후 30 분 동안 샘플을 3 회 세척하고 세척 당 1 밀리리터의 1 마이크로 CT 세척 버퍼를 세척합니다. 마지막 세척 후 적절한 염색 용액 1ml를 튜브에 넣고 샘플을 실온에서 2-7일 동안 배양합니다. 더 긴 이미지 보존이 필요한 경우, 표시된 대로 농도당 1시간 동안 1밀리리터의 에탄올로 상승 에탄올 시리즈 내의 샘플을 탈수하여 임계점 건조를 위해 샘플을 준비합니다.

임계점 건조 샘플을 장착하려면 샘플을 플라스틱 또는 유리 모세관 튜브에 넣은 후 튜브를 회전 스테이지 홀더에 장착합니다. 수화 시료 장착의 경우 P10 피펫 팁에 물을 채우고 좁은 끝을 파라핀 필름으로 고정합니다. 집게를 사용하여 단일 표본을 피펫 팁으로 옮기고 길고 가느다란 물체를 사용하여 샘플이 팁 벽에 닿을 때까지 샘플이 팁에 조심스럽게 밀어 넣습니다.

피펫의 열린 끝을 덮은 후 P10 피펫을 회전 스테이지의 쐐기에 맞도록 설계된 홀더에 장착합니다. 스캔하려면 스캐너 소프트웨어에서 Open Door 아이콘을 클릭하여 회전 스테이지 초크에 액세스하고 샘플 홀더 바닥 주위의 칼라를 조여 샘플을 부착합니다. 최적의 해상도와 대비를 위해 소프트웨어에서 스캐닝 매개변수를 설정하고 옵션 및 X-Ray Source를 클릭하여 X-ray Source 전원 제어를 엽니다.

슬라이더 막대를 사용하여 X선 전압을 30-40킬로볼트로, 전류를 100-110마이크로암페어로 설정하여 3-4와트의 전력과 작은 스폿 크기를 가진 X-ray 빔을 생성합니다. 스캔 중에 획득할 투사 이미지의 수를 설정하려면 옵션 및 획득 모드를 선택하여 카메라 노출 시간을 500-800밀리초로 설정하고 슬라이더 막대를 사용하여 카메라 설정 및 위치에 따라 원하는 이미지 픽셀 크기를 설정합니다. 슬라이더 막대를 클릭하고 드래그하여 360도 회전 경로를 따라 샘플을 이동하여 샘플을 시야 내에 유지합니다.

획득 시작 아이콘을 클릭합니다. 추가 스캔 매개변수를 설정할 수 있는 대화 상자가 나타납니다. 스캔이 저장될 파일과 출력 폴더의 이름을 지정합니다.

무작위 이동을 10으로 설정하고 평균을 4-6프레임으로 설정합니다. 회전 단계는 사용된 카메라 설정에 따라 자동으로 계산되며, 확인을 클릭하여 획득을 시작합니다. 스캔 시간을 보여주는 진행률 표시줄 대화 상자가 나타나고 스캐너는 회전 경로를 따라 표본의 일련의 투영 이미지를 획득하기 시작합니다.

단층촬영을 생성하려면 재구성 소프트웨어에서 투영 이미지를 열고 시프트 보정 알고리즘을 선택하여 초기 이미지 정렬을 수행합니다. 투영 이미지를 적절하게 정렬하는 최상의 값을 선택하고 미세 조정을 클릭하여 각 재구성 매개변수를 미세 조정합니다. 올바른 값을 선택하는 데 사용할 수 있는 일련의 미리보기가 생성됩니다.

최적의 매개 변수 값이 Settings 탭에 표시되는지 확인하고 Output 탭에서 비트 심도, 파일 이름 및 데이터가 저장될 폴더와 같은 파일 매개 변수를 조정합니다. 관심 영역은 관심 있는 구조만 재구성하는 데 사용할 수 있습니다. 여러 번 재구성해야 하는 경우 시작 및 배치에 추가를 클릭하여 현재 이미지를 배치 관리자에 추가하고 나머지 이미지에 대해 재구성을 반복합니다.

재구성된 이미지의 형태 분석을 위해 세그먼트 탭의 해당 형태 분석 소프트웨어 프로그램에서 기본 및 새로 만들기를 클릭하고 이미지에 새 이름을 지정한 다음 적절한 색상을 선택합니다. Define range(범위 정의) 상자를 선택하고 슬라이더를 조정하여 관심 구조를 포함하는 임계값 범위를 조정합니다. 임계값으로 정의된 영역을 그리려면 마우스 왼쪽 키를 누른 상태에서 Control 키를 길게 누릅니다.

영역을 제거하려면 Shift 키를 누른 상태에서 마우스 왼쪽 키를 누릅니다. 관심 있는 메쉬 영역의 측정값이 기본 형태 해석을 위한 정보 패널에 표시되는지 확인합니다. 메쉬 객체와 전체 단층촬영 이미지를 렌더링하고 결과 이미지를 3D로 시각화한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 Show Movie Maker를 선택하고 뷰어의 개별 프레임을 사용하여 객체의 비디오를 생성합니다.

이 이미지에서는 배아, 세 번째 인스타 유충, ferrate 성충 단계의 번데기, 성체 암컷 파리를 관찰할 수 있으며, 요오드로 염색하고 상업용 벤치 탑 스캐너를 사용하여 물에서 이미지화할 수 있습니다. 섬세한 조직의 탁월한 보존과 균일한 염색이 뚜렷하여 모든 주요 장기를 쉽게 식별할 수 있습니다. 여기에서는 느린 프로젝션 스캔 모드와 빠른 프로젝션 스캔 모드 모두에서 획득한 동일한 성인 파리 헤드케이스를 비교

중요한 것은 느린 이미지의 해상도가 더 높지만 형태 분석 결과는 느린 스캔과 빠른 스캔 간에 차이가 없다는 것입니다. 렌더링 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 모든 조직 또는 장기 시스템을 분할하여 형태 분석 및 3D 시각화에 사용할 수 있습니다. 이 이미지에서는 포스포텅스텐산으로 염색되고 수화 상태에서 또는 X선 현미경에서 임계점 건조 후 이미지화된 플라이 복부를 관찰할 수 있습니다.

포스포텅스탄산을 사용하면 중장의 개별 상피 세포와 고환 내의 정자 다발을 쉽게 해결할 수 있습니다. 임계점 건조 이미지는 수화된 샘플에 비해 약간 증가된 해상도를 보여주지만, 큐티클 근처의 지방 세포와 같은 수화된 샘플에서 섬세한 조직의 미세 구조를 더 잘 보존할 수 있습니다. 최상의 해상도를 얻으려면 시료의 움직임과 과도한 진동을 제한하십시오.

이를 위해서는 샘플을 스테이지에 고정하는 것이 중요하지만, 이를 달성하기 위해서는 창의성과 수완이 필요할 수 있습니다. 광 및 전자 현미경과 같은 추가 이미징 방법을 이미징 워크플로우의 일부로 사용하여 나노 크기에서 전체 유기체에 이르기까지 주어진 유전자 돌연변이를 이해할 수 있습니다.