Name: 통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 hiPSC를 뉴런 계통으로 자동 분화시키는 방법을. Brightfield 및 공초점 현미경을 활용한 통합 라이브 셀 모니터링으로 재현성 높은 신경과학 연구가 가능합니다.

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저자는 감사하게이 연구를 위한 생물 물질을 기여한 환자와 그들의 가족을 인정합니다. 연구에 사용된 세포 선은 Rutgers (nd41865 iPS#1로 ND41865)와 틸로 쿠나스 박사의 실험실 (iPS#2)와 NINDS 컬렉션에서 했다. 이 작품은 NOMIS 재단 (PH), RiMod-FTD, EU 공동 프로그램 - 신경 퇴행성 질환 연구 (JPND) (PH)에 의해 부분적으로 지원됩니다. DZNE I2A 이니셔티브 (AD); PD-Strat, ERA-Net ERACoSysMed 자금 조달 프로젝트 (PH) 및 파킨슨 병 (FOUNDIN-PD) (PH, EB)에 대한 기초 데이터 이니셔티브. FOUNDIN-PD는 마이클 J. 폭스 재단의 PD 프로그램에 대한 경로의 일부입니다. 저자는 스티븐 핀크베이너와 멜라니 콥 (글래드 스톤 연구소)이 수동 mDA 뉴런 차별화 프로토콜의 설립에 기여한 것에 대해 감사하고 마호미 스즈키 (요코가와 전기 공사)는 중성자 아웃 성장 분석 설정에 도움을 주었습니다.

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Payne, N. L., Sylvain, A., O'Brien, C., Herszfeld, D., Sun, G., Bernard, C. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+and+treating+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of human induced pluripotent stem cells for modeling and treating neurodegenerative diseases.</a> New biotechnology. 32 (1), 212-228 (2015).</li>
<li>Wu, Y. Y., Chiu, F. L., Yeh, C. S., Kuo, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+modelling+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease.</a> Open Biology. 9 (1), 180177(2019).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular cell biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Jain, S., Heutink, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+single+genes+to+gene+networks%3A+high-throughput-high-content+screening+for+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">From single genes to gene networks: high-throughput-high-content screening for neurological disease.</a> Neuron. 68 (2), 207-217 (2010).</li>
<li>Soares, F. A. C., Chandra, A., Thomas, R. J., Pedersen, R. A., Vallier, L., Williams, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+feasibility+of+scale+up+and+automation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+cultured+in+aggregates+in+feeder+free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Investigating the feasibility of scale up and automation of human induced pluripotent stem cells cultured in aggregates in feeder free conditions.</a> Journal of biotechnology. 173, 53-58 (2014).</li>
<li>Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+automated+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system.</a> Scientific reports. 5, 16647(2015).</li>
<li>Conway, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+96-well+Plate+Based+iPSC+Culture+and+Production+Using+a+Robotic+Liquid+Handling+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52755(2015).</li>
<li>Paull, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+derivation%2C+characterization+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">high-throughput derivation, characterization and differentiation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature methods. 12 (9), 885-892 (2015).</li>
<li>Busskamp, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neurogenesis+through+transcriptional+activation+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Rapid neurogenesis through transcriptional activation in human stem cells.</a> Molecular systems biology. 10, 760(2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
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<li>Koch, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+affects+neurite+morphology%2C+autophagy%2C+vesicle+transport+and+axonal+degeneration+in+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+%26+disease%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein affects neurite morphology, autophagy, vesicle transport and axonal degeneration in CNS neurons.</a> Cell death & disease. 6, 1811(2015).</li>
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<li>Mehta, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Huntington%27s+Disease+iPSC-Derived+Cortical+Neurons+Display+Altered+Transcriptomics%2C+Morphology%2C+and+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Human Huntington's Disease iPSC-Derived Cortical Neurons Display Altered Transcriptomics, Morphology, and Maturation.</a> Cell reports. 25 (4), 1081-1096 (2018).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Spandidos, A., Wang, X., Wang, H., Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PrimerBank%3A+a+resource+of+human+and+mouse+PCR+primer+pairs+for+gene+expression+detection+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification.</a> Nucleic acids research. 38, Database issue 792(2010).</li>
</ol>

우리는 공개 할 것이 없습니다.

hiPSC 배양 및 뉴런 분화의 표준화를 위한 통합 이미징 기능을 갖춘 자동화된 세포 배양 시스템을 소개합니다. 최소한의 사용자 개입으로 인해 실험적 변화는 분화 중에 세포 표현형의 재현성을 보장합니다. 캘린더 기반 스케줄러는 실험의 조직 및 병렬화를 지원하며 실험이 수행되는 시점에서 높은 수준의 유연성을 허용합니다. 기존 방법을 쉽게 조정할 수 있으며 사용 가능한 방법의 스펙트럼을 늘릴 수 있습니다. 또한 많은 수의 분석 플레이트 형식을 사용하여 이 시스템의 유연성을 추가할 수 있습니다. CO2 인큐베이터, 로봇 암, 브라이트필드 셀 사이토미터 및 액체 처리 스테이션으로 구성된 최소한의 시스템은 hiPSC 문화와 분화에 필요한 기본 단위를 형성하며 학술 연구 실험실에 저렴한 비용을 지불합니다. 화합물, RNAi 라이브러리 또는 CRISPR/Cas9 라이브러리의 저장을 위한 자동화된 -20°C 저장 시스템과 자동 세포 배양 시스템의 조합과 고함량/고처리량 현미경의 통합을 통해 페노티픽 스크리닝의 실행을 가능하게 한다.
현재 연구에서는, 자동 세포 배양 시스템은 일회용 팁과 배양 매체를 사용하여 저수지로 수동으로 리필되어 미디어 변경 및 기타 배양 공정을 위해 액체 처리 스테이션의 사용을 특히 하룻밤 동안 제한했다. 이러한 한계를 피하기 위해 일회용 팁 대신 바늘 사용으로 조정할 수 있으며, 냉장고에 저장된 미디어 라인과 미디어 백 간의 튜브 연결을 설치한 후, 미디어 저장소는 히터 요소에 의해 미리 따뜻하게 된 신선한 매체로 자동으로 리필할 수 있습니다. 이렇게 하면 팁, 문화 미디어 및 저장소 교환의 수동 리필로 인한 사용자 간섭이 줄어듭니다.
당사의 자동화된 세포 배양 시스템은 몇 가지 이점을 제공합니다. 하나는 바코드 추적 시스템입니다. 시스템에 로드된 플레이트는 메서드 실행 중 및 후 샘플을 추적할 수 있도록 시스템에서 읽고 저장하는 고유한 바코드로 식별됩니다. 또 다른 장점은 사용자 특정 프로젝트를 만들 수 있다는 점입니다. 여기서 시스템에 로드된 배양 플레이트는 특정 프로젝트에 할당하고 일괄 그룹으로 그룹화할 수 있습니다. 일괄 구조화는 개별 플레이트를 선택할 필요가 없으므로 특정 일괄 처리의 모든 플레이트에 동일한 절차의 실행을 단순화합니다. 또한 액체 클래스 편집기를 사용하면 각 액체 이송 단계에 대한 포부 및 분배 매개 변수뿐만 아니라 파이펫팅 속도와 높이를 조정할 수 있습니다. 모든 프로세스는 로그 파일에 문서화되어 지정된 문화권 또는 분석 판에 대해 수행된 작업을 되짚어볼 수 있습니다.
인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)에서 유래된 뉴런 및 기타 세포 유형은 특정 환자 집단(예: 파킨슨병용 도파민성 뉴런)에서 신경 퇴행성 질환의 메커니즘을 연구하기 위한 체외 도구에서 유용하며, 이는 개인화된 약물 검진의 가능성을 제공한다. hiPSC를 배양하는 것은 매우 시간 집약적이며 일반적으로 저용량 생산으로 제한되는 복잡한 차별화 프로토콜을 실행하도록 훈련된 사람들에게 요구합니다. 우리는 hiPSC의 피더 없는 문화를 자동화된 배양에 적용하고 2개의 신경 분화 프로토콜, 테트온 프로모터10,11,및 중뇌 도파민기의 세대를 위한 장기 소형 분자 기반 프로토콜(mDA) 뉴런13에서NGN2 과잉 발현을 기반으로 하는 신속한 피질 뉴런 분화 프로토콜을 구현하였다. 수동 문화 및 차별화 프로토콜의 간단한 전송 및 재현성은 자동화 된 문화 시스템을 매우 유용하게 만듭니다. 자동화된 세포 배양 시스템에서 배양된 인간 iPSC는 일관된 줄기 세포 형태를 보여주었으며 독립적인 실험 간에 재현가능한 중요한 흉병 마커를 표현하였다. 또한, hiPSC 배양 프로토콜의 자동화는 더 많은 수의 세포주를 병렬로 배양하고 확장하는 것을 선호했다. 사용자가 실험실에 있을 때 수행된 다운스트림 공정 단계(예: 셀 의 수확 또는 분화를 위한 수동 레타칭)에 대해 하루 동안 시스템을 무료로 상태로 두고 밤새 도록 예정된 자동 병합 검사. 사용자 정의 인플루엔트 임계값에 도달하면, 세포는 자동화된 세포 배양 시스템의 스태커에서 사용할 수 있는 세포외 매트릭스 코팅 판으로 통과되고 보충된다. 각 통로 라운드는 약 70분이 소요되며 한 부모 판에서 4개의 1웰 플레이트를 생성하며, 이는 하루에 20개의 구절을 수용할 수 있습니다.
NGN2 분화 프로토콜의 자동화는 성공적으로 수행되었으며 서로 다른 구절에 걸쳐 뉴런 세포의 균일 한 인구의 생성을 허용하고 수동 분화에 필적. 더욱이, 다중 세포주 또는 수천 개의 시험 조건/화합물을 가진 검열 실험을 관련시키는 대규모 검열 연구를 위한 실험 비용은 급속한 분화 때문에 감소될 것입니다. 라이브 셀 중성염 아웃성장 측정을 포함한 비용 효율적이고 높은 처리량 판독값은이전에14,15,16에도시된 바와 같이 질병 모델링을 위한 페노티픽 판독값으로 쉽게 개발, 구현 및 사용될 수 있다. 따라서, 우리는 GFP를 과도하게 발현하는 작은 분자 유래 신경 전구체(smNPC) 세포를 사용하여 NGN2 프로토콜을 더욱 적응시켰다. smNPC 세포는 배양 매체(iPSC 배양 비용의 1/3)와 실험을 확장하는 데 필요한 시간(iPSC 배양 비용의 1/3)을 포함한 추가 이점을 제공합니다. smNPC의 세포 수율은 iPSC로 얻은 것보다 7~10배 높습니다. 분화 뉴런은 수동 항체 염색이나 화학 라벨링 없이 완전히 자동화된 이미징 프로세스를 사용하여 며칠 동안 성공적으로 모니터링및 이미지화되어 이미징을 포함한 수동 절차에 필요한 비용과 시간을 절약했습니다. 96웰 플레이트의 60개 웰 내부의 현재 이미징은 우물당 25개의 필드가 이미지될 때 플레이트당 약 16분정도 걸리며, 이는 1000개의 화합물에 대한 이미징 기반 스크리닝을 위한 데이터를 하루에 획득하고 분석할 수 있음을 의미합니다. 미래에, 이 판독은 neurite 아웃성장 결함의 구출을 위한 복합 검열 연구 결과에서 이용될 수 있었습니다.
또한, 우리는 또한 iPSC에서 중뇌 도파민학 (mDA) 뉴런을 생성하기위한 수동 분화 프로토콜의 전송을 시연한다. 이 작은 분자 기지를 둔 분화 프로토콜은 65 일이 걸리고 다중 투감 단계 및 빈번한 미디어 변경 때문에 노동 집약적이며, 주로 매 2 일마다 mDA 뉴런의 생산을 동시에 몇 iPSC 라인으로 제한합니다. 자동화된 mDA 차별화 프로토콜은 수십 개의 iPSC 라인으로 차별화를 확장하는 데 큰 이점이 있습니다. 최대 30개의 세포주를 병렬로 분화할 수 있습니다. 분화는 주로 미디어 변화에 기초하기 때문에 거의 모든 분화 과정을 인간의 간섭없이 수행 할 수 있습니다. 자동화된 시스템의 일정 기반 스케줄러를 사용하여 차별화 단계에 따라 미디어 변경 내용을 계획할 수 있습니다. 이러한 많은 수의 세포주 및 배양 판으로 작업하는 한 가지 제한은 하룻밤 미디어 변화를 수행 할 수 없다는 것이었습니다. 주된 이유는 우리의 시스템이 일회용 팁과 이 수동 단계를 실행하는 실험실의 사용자를 필요로 하는 문화 미디어의 수동 리필을 사용하기 위해 설정되어 있다는 사실입니다. 미디어 변경 프로세스를 용이하게 하기 위해 시스템에 로드된 플레이트가 프로젝트에 할당되고 일괄 그룹으로 그룹화되었습니다. 그런 다음 배치 크기는 일회용 팁수와 사용 가능한 문화 미디어 볼륨에 맞게 조정되었습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 이러한 제한은 재사용 가능/세척 가능한 바늘의 구현과 미디어의 자동 리필에 의해 쉽게 극복할 수 있다. iPSC에 표시된 바와 같이 세포의 자동 패혈증/결합은 당사의 자동화된 세포 배양 시스템에서 제공하는 편의 시설 중 하나입니다. 우리는 차별화의 25 일에 mDA 뉴런의 자동화 된 replating을 테스트했습니다. 그러나, mDA 뉴런의 해리는 iPSC(8분)보다 해리 효소를 가진 더 긴(40분) 배양을 필요로 하며, 이는 세포주당 1시간 이상으로 자동 투석 과정을 연장한다. 그 결과, 같은 날 30개의 세포주를 자동 투하하는 것은 불가능해졌습니다. 자동화된 레볼라팅(플레이트 전송, 파이펫팅) 동안 다른 단계를 가속화하고 시스템을 바늘과 미디어 라인의 사용에 맞게 조정하여 야간 작업을 가능하게 하는 이 제한을 해결할 수 있습니다. 단점에도 불구하고, 우리는 성공적으로 MAP2 (뉴런) 및 TH (mDA 뉴런) 양성 세포의 상당한 양으로 배양을 생산하는 mDA 뉴런의 자동화 된 분화로 수동 프로토콜을 전송 할 수 있습니다.
수십 개의 iPSC 세포주를 병렬로 구분하는 것은 파킨슨 병을 포함한 신경 퇴행성 질환의 분자 메커니즘을 조사하는 프로젝트에 큰 관심을 가지고 있습니다. 그러나 오류 수가 적고 비용 절감으로 작업을 더 빠르게 완료하는 것은 큰 과제입니다. 여기에 제시 된 프로토콜의 자동화 (iPSC, smNPC 및 mDA 뉴런)의 자동화로 인해 우리는 속도를 높이고 비용을 절감하며 프로젝트의 재현성을 높일 수 있습니다. 수백 개의 환자 세포주를 포함하는 FOUNDIN-PD (https://www.foundinpd.org/wp/)와 같은 프로젝트의 개발은 자동화 된 배양 및 분화 프로토콜에 대한 필요성을 보여줍니다. 우리의 미래 관점은 자동화 된 시스템에 수동 3 차원 (3D) 세포 배양 모델의 전송을 포함한다. 플레이트 정의 설정과 어댑터의 사용에 사소한 적응은 3D 배양에 필요한 상업 또는 맞춤형 플레이트 및 미세 유체 챔버의 사용을 허용합니다. 더욱이, 자동화된 라벨 없는 화상 진찰 모형의 구현은 우리가 실시간으로 신경 성장을 추적하고 neurite 성장, 신경 조직 및 세포 죽음에 있는 변경을 질병 기계장치의 더 나은 이해로 번역하는 것을 허용할 것입니다.

인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC)는 자기 갱신하고 거의 모든 성인 세포 유형에서 분화 할 수 있습니다. 이러한 특성은 hiPSC를 기초 연구 및 약물 발견1에서질병 모델링을위한 유용한 도구입니다. 인간 iPSC는 질병 과정에 가장 영향을 받음/관여하는 질병 관련 세포 유형을 유도할 수 있는 기증자 유전적 배경을 유지하며, 예를 들어, 신경퇴행성 질환에 대한 상이한 뉴런아류형(2,3). 또한, hiPSC는 인간의 문맥과 생리적 단백질 발현 수준에서 질병을 모델링하여 동물 및 세포 과잉 발현 모델의 일부 한계를 극복하고, 단원성, 복잡하고 후성유전학적 질환뿐만 아니라 후기 발병질환4에이르는 질병을 모델링하는 데 귀중한 자산이 되는 것으로 입증되었다.
이러한 혜택과 기회에도 불구하고 hiPSC의 몇 가지 제한 사항은 여전히 해결해야 합니다. 현재 hiPSC 문화 권양 및 차별화 프로토콜은 비용 효율적이지 않고 표준화하기 어렵고 노동 집약적입니다. 수동 배양 단계는 성장의 차이와 hiPSC의 자발적인 차별화로 인해 수율및 표현형의 가변성이 높을 수 있습니다. 따라서 자동화5를사용하여 달성할 수 있는 보다 표준화된 처리 기술을 구현하고 프로토콜을 단순화하여 실험자 의존적 변동을 줄여야 합니다. 자동화 된 hiPSC 문화 및 차별화 프로토콜의 설립은 학술 및 산업 연구 프로젝트 모두에 대한 공통 표준을 설정하고 생물학적으로 관련된 질병 모델의 생성과 더 재현 가능한 결과를 허용합니다.
이전 작품은 hiPSC 배양6,7,8의 자동화를 시도했지만, 그들의 프로토콜은 시스템에 의존하고 다른 분석 형식에 적응성이 부족 특정 세포 배양 판 형식으로 제한되었습니다. 이러한 시스템은 세포의 벌크링에 유용하지만 원하는 세포 유형, 질병 표현 및 스크리닝 목적으로 자동화된 분화에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한, 섬유아세포 파생, hiPSC 생성 및 차별화를 위한 대규모 자동화 플랫폼은9에 설명되었지만, 많은 학술 실험실에서 매력적이지만 저렴할 수 있는 라인의 생산에 전념하는 고처리량 실험실에서만 달성할 수 있는 규모로 설명되었습니다.
고효율 미립자 공기(HEPA)의 액체 처리 스테이션을 기반으로 한 완전 자동화된 세포 배양 시스템을 개발하여 대용량 CO2 인큐베이터, 브라이트필드 이미징 사이토미터 및 플레이트 수송용 로봇 암과 함께 여과된 환경을 개발했습니다. 이러한 구성 요소는 안정적이고 재현 가능한 hiPSC 배양 및 분화를 위한 기초를 제공합니다. 우리는 화합물 또는 바이러스 저장을위한 자동화 된 -20 ° C 스토리지 시스템과 고속 방적 디스크 공초점 라이브 셀 이미저로 시스템을 보완했습니다. 맞춤형 프로토콜을 통해 자동화된 세포 시딩, 미디어 변경, 인플루엔트 검사, 세포 확장 및 분석 플레이트 생성을 샘플 처리 및 플레이트 이미징과 함께 생성하여 시스템이 고함량/고처리량 스크리닝과 호환됩니다. 자동화된 세포 배양 및 이미징 시스템은 제어 소프트웨어 및 맞춤형 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 사용하여 작동합니다. GUI를 사용하면 메서드 실행에 필요한 셀 라인 별 매개 변수가 포함된 CSV 파일을 가져올 수 있습니다. 또한 GUI를 사용하면 기본 제공 캘린더 보기를 사용하여 모든 시퀀스에서 수많은 실험을 예약할 수 있으므로 각 메서드가 시작되는 시간을 완전히 제어할 수 있습니다.
당사의 자동화된 세포 배양 시스템은 표준화된 파이펫팅 속도, 패싱 시간, 연결 임계값, 종자 밀도 및 중간 볼륨을 다양한 플레이트 형식(96, 48, 24-, 12-6 또는 1-웰 플레이트 형식)으로 배양하는 유연성을 사용합니다. 우리는 6 일10,11에서TUBB3 양성 뉴런을 얻을 수있는 뉴런으로 hiPSC를 변환하기위한 최근 발표 된 단기 분화프로토콜을조정했다. 또한 EF1a 프로모터12 및 iPSC에서 GFP를 중뇌 도파민기(mDA) 뉴런으로 통합하여 65일 이내에 mDA 뉴런을 산출하는 이중 SMAD 억제프로토콜(13)을 적용하여 작은 분자 신경 전구체 세포(smNPC)의 자동 분화 및 이미징을 뉴런으로 확립했습니다.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td>Distributor</td><td>카탈로그 번호</td><td>희석</td></tr><tr><td>iPSC pluripotency marker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-SSEA4</td><td>Abcam</td><td>ab16287</td><td>1 to 33</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Oct3/4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>1에서 200</td></tr><tr><td>NGN2 뉴런 마커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-TUBB3</td><td>R & D</td><td>MAB1195</td><td>1 to 500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-BRN2</td><td>NEB</td><td>12137</td><td>1 to 1,000</td></tr><tr><td>mDA neuron markers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-TH</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>12137</td><td>1 to 750</td></tr><tr><td>Mouse anti-MAP2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-74421</td><td>1 to 750</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-닭 IgY, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td>1-2,000</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1-2,000</td></tr><tr><td>염소 안티-마우스 IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11032</td><td>1-2,000</td></tr><tr><td>염소 안티-토끼 IgG, Alexa Fluor 488</td><td>인비트로젠</td><td>A11008</td><td>1-2,000</td></tr><tr><td>염소 안티-토끼 IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1 to 2,000</td></tr><tr><td>염소 항토끼 IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>1 to 2,000</td></tr><tr><td>Nuclei counterstaining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1 to 8,000</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments </td><td>Distributor</td><td>카탈로그 번호</td><td>설명/응용 프로그램</td></tr><tr><td>Agilent TapeStation 시스템</td><td>Agilent Technologies</td><td>4200</td><td>DNA 및 RNA 샘플에 대한 자동 전기영동 </td></tr><tr><td>Automated -20 &deg; C 저장 시스템</td><td>Hamilton Storage Technologies</td><td>Sample Access Manager (SAM -20C, 3200 series)</td><td>시약 보관</td></tr><tr><td>바코드 리더</td><td>Honeywell</td><td>바코드 리더 Orbit</td><td>바코드 스캐너</td></tr><tr><td>명시야 세포 세포 세포</td><td>Nexcelom</td><td>Celigo</td><td>Confluence check and 세포 계수</td></tr><tr><td>CellVoyager 7000</td><td>Yokogawa</td><td>CellVoyager 7000</td><td>세포 배양을 위한 자동 컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Cytomat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 24 C, CU</td><td>12 스태커 피치 28 mm, 12 스태커 피치 23 mm (총 456개 플레이트)</td></tr><tr><td>시료 해동용 Cytomat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cytomat 2-LIN, 60 DU (건조 장치)</td><td>2 스태커 피치 28 mm (총 42개 플레이트)</td></tr><tr><td>HEPA 필터</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Hood Flow Star UV</td><td>Modified by Hamilton Robotics</td></tr><tr><td>Liquid handling station</td><td>Hamilton Robotics</td><td>Microlab Star</td><td>채널: 8x 1-ml, 4x 5 ml 및 96 채널 MPH</td></tr><tr><td>미디어 저장소</td><td>Hamilton Robotics</td><td>188211APE</td><td>미디어/시약 저장소</td></tr><tr><td>순수 시스템</td><td>Veolia Water</td><td>ELGA PURELAB Classic</td><td>은 바늘 세척 스테이션에 순수한 물을 제공합니다.</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSTUDIO12KOA</td><td>Real-time PCR 기계</td></tr><tr><td>로봇 팔</td><td>Hamilton Robotics</td><td>랙러너</td><td>플레이트 운반</td></tr><tr><td>턴테이블 Hamilton</td><td>Robotics</td><td>턴테이블</td><td>플레이트 방향 조정</td></tr><tr><td>무정전 전원 공급 장치</td><td>APC</td><td>Smart UPS RT Unit, 10000 VA 전원 공급</td><td>백업 전원 공급 장치</td></tr><tr><td>VIAFLO-피펫</td><td>Integra</td><td>4500</td><td>전자 피펫</td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453545</td><td>Real-time PCR machine</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Distributor</td><td>카탈로그 번호</td><td>참고</td></tr><tr><td>1-well culture plate (84 cm2)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>165218</td><td>Nunc OmniTray</td></tr><tr><td>6-well culture plates (9.6 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657160</td><td>TC treated with lid</td></tr><tr><td>12-well culture plate (3.9 cm2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665180</td><td>TC treated with lid</td></tr><tr><td>96-웰 배양 플레이트 (0.32 cm2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005558</td><td>CellCarrier-96 Black</td></tr><tr><td>plate Tips, 50-&micro; L</td><td>Hamilton Robotics</td><td>235987</td><td>50-uL 팁</td></tr><tr><td>팁, 300-&micro; L</td><td>해밀턴 로보틱</td>스 <td>235985</td><td>300-&micro; L 팁</td></tr><tr><td>팁, 1000-&micro; L</td><td>해밀턴 로보틱</td>스 <td>235939</td><td>1000-&micro; L 팁</td></tr><tr><td>팁, 5mL</td><td>Hamilton Robotics</td><td>184022</td><td>5mL 팁</td></tr><tr><td>튜브, 15mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>15mL 튜브</td></tr><tr><td>튜브, 50mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>50mL 튜브</td></tr><tr><td>Nalgene 극저온 2.0mL 바이알</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V5007</td><td>극저온</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력>플라스미드</td><td>Distributor</td><td>카탈로그 번호</td><td>Notes</td></tr><tr><td>pLV_hEF1a_rtTA3</td><td>Addgene</td><td>61472</td><td>Ron Weiss의 친절한 선물</td></tr><tr><td></td><td>pLV_TRET_hNgn2_UBC_Puro Addgene</td><td>61474</td><td>Ron Weiss의 친절한 선물</td></tr><tr><td>pLVX-EF1a-AcGFP1-N1 렌티바이러스</td><td>Takara Bio</td><td>631983</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Sequence (forward)</td><td>Sequence (reverse)</td><td>Source</td></tr><tr><td>iPSC pluripotency</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4 (ID 4505967a1)</td><td>CTTGAATCCCGAATGGAAAGGG</td><td>GTGTATATCCCAGGGTGATCCTC</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NAOG: (ID 153945815c3)</td><td>CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA</td><td>CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC</td>, <td>PrimerBank</td></tr>, <tr><td>REX1 (ID 89179322c1)</td><td>AGAAACGGGCAAAGACAAGAC</td><td>GCTGACAGGTTCTATTTCCGC</td>, <td>PrimerBank</td></tr><tr><td>NGN2 neurons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 (ID 87578393c1)</td><td>CTCAGCACCGCTAACAGAGG</td>, <td>CATTGGCGCTTCGGACAG</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>BRN2: (ID 380254475c1)</td><td>CGGCGGATCAAACTGGGATTT,</td><td>TTGCGCTGCGATCTTGTCTAT</td><td>, PrimerBank</td></tr><tr><td>, CUX2(ID 291045458c2)</td><td>CGAGACCTCCACACTTCGTG</td><td>, TGTTTTTCCGCCTCATTTCTCTG</td><td>, PrimerBank</td></tr>, <tr><td>NCAM1(ID: 336285437c3)</td><td>TGTCCGATTCATAGTCCTGTCC,</td><td>CTCACAGCGATAAGTGCCCTC</td>, <td>PrimerBank</td></tr><tr><td>SYNAPSIN1(ID: 91984783c3)</td><td>TGCTCAGCAGTACAACGTACC</td>, <td>GACACTTGCGATGTCCTGGAA</td><td>PrimerBank</td></tr><tr><td>mDA neurons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH</td><td>CGGGCTTCTCGGACCAGGTA</td><td>CTCCTCGGCGGTGTACTCCACA</td><td>NCBI 프라이머-BLAST</td></tr><tr><td>MAP2</td><td>GGATCAACGGAGAGCTGAC</td><td>TCAGGACTGCTACAGCCTCA</td><td>NCBI 프라이머-BLAST</td></tr><<tr><td>strong>Housekeeping genes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GAAATCCCATCACCATCTTCCAGG</td><td>GAGCCCCAGCCTTCTCCATG</td><td>NCBI 프라이머 - BLAST</td></tr><tr><td>OAZ1</td><td>AGCAAGGACAGCTTTGCAGTT</td><td>ATGAAGACATGGTCGGCTCG</td><td>NCBI 프라이머 - BLAST</td></tr><tr><td>RPLPO</td><td>CCTCATATCCGGGAATGTG</td><td>GCAGCAGCTGGCACCTTATTG</td><td>NCBI 프라이머 - BLAST</td></tr><tr><td>RPL13A</td><td>GCCTACAAGAAAGTTTGCCTATC</td><td>TGGCTTTCTCTTTCCTCTTCTC</td><td>NCBI 프라이머 - BLAST</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Media and Reagents</td><td>Distributor</td><td>카탈로그 번호</td><td>농도 사용</td></tr><tr><td>코팅 매트릭스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extracellular matrix (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>코닝</td><td>356008</td><td>2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>시그마</td><td>L2020</td><td>5 - 10 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴(PLO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>배양 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iPSC 배양 배지 (필수 8 플렉스 배지)</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>NGN2 뉴런 - NGN2 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0.909 mL (50 &마이크로; M)</td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (1%)</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331093</td><td>484.75 mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL ( 2 mM)</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I9278</td><td>0.25 mL (2.5 &micro; g/mL)</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (0.5%)</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (0.5%)</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>mDA neurons - SRM medium</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>0.5 mL (55 &micro; M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>Knockout DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>409.5 mL</td></tr><tr><td>Knockout serum replacement (혈청 대체)</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>75 mL (15%)</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>mDA 뉴런 - N2 매체</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (2%)</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL (2 mM)</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>475 mL</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL(1%)</td></tr><tr><td>mDA 뉴런 - 분화 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>10 mL (2%)</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>485 mL</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>5 mL (1%)</td></tr><tr><td>NGN2 뉴런 - 보충제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& 디</td><td>4423/10</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>독실린 (독스)</td> <td>시그마</td><td>D9891</td><td>2.5 &mu; g/mL</td></tr> 신경교세포 <tr><td>유래 신경영양인자 (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10ng/mL</td></tr><tr><td>L-아스코르브산 2-인산 마그네슘(AA2)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>64 mg/L</td></tr><tr><td>Neurotrophic factor-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>푸르모르파민(PMA)</td><td>케이맨</td><td>10009634</td><td>0.5 &mu; M</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>시그마</td><td>P8833-10MG</td><td>0.5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>티아조비빈</td><td>메르크 밀리포어</td><td>420220-10MG</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>mDA 뉴런 - 보충제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CHIR99021 (CHIR)</td><td>R& 디</td><td>4423/10</td><td>3 &mu; M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>케이맨</td><td>13197</td><td>10 &마이크로; M</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP (db-cAMP)</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 8B (FGF-8b)</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Glial 유래 신경 영양 인자 (GDNF)</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>L-아스코르브산(AA1)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>0.2 mM</td></tr><tr><td>LDN193189 (LDN)</td><td>Cayman</td><td>11802</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Purmorphamine (Purm)</td><td>케이맨</td><td>10009634</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>소닉 고슴도치/SHH (C24II) N-Terminus (SHH)</td><td>R& D</td><td>1845-SH</td><td>100ng/mL</td></tr><tr><td>SB431542(SB)</td><td>케이맨</td><td>13031</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>트랜스포밍 성장 인자 유형 &szlig; 3 (TGF&szlig; 3)</td><td>R& D</td><td>243-B3</td><td>1 ng/mL</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>케이맨</td><td>10005583</td><td>10 &마이크로; M</td></tr><tr><td>Dissociation reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>single cell dissociation reagent (StemPro Accutase)</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>1x</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Gibco</td><td>11575020</td><td>0.5 mM</td></tr><tr><td>RNA 분리 및 cDNA 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 분리 키트</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Rneasy MiniKit</td></tr><tr><td>RNA 용해 완충액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>Trizol 용해 완충액(RNA 용해 완충액)</td></tr><tr><td>역전사 효소(키트)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080-085</td><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>설명/응용 프로그램</td></tr><tr><td>세포 배양 프레임워크 (CCF) (그래픽 사용자 인터페이스, GUI)</td><td>Hamilton Robotics</td><td>자동화</td><td>시스템을 위한 맞춤형 사용자 인터페이스</td></tr><tr><td>CellPathFinder 소프트웨어 (이미지 분석 소프트웨어 1)</td><td>Yokogawa</td><td>CellPathfinder HCS 소프트웨어</td><td>이미지 분석 도구</td></tr><tr><td>CellVoyager 측정 시스템</td><td>Yokogawa</td><td>포함 CellVoyager 7000</td><td>현미경 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>Columbus 소프트웨어 (이미지 분석 소프트웨어 2)</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>이미지 분석 도구</td></tr><tr><td>클라우드 기반 qPCR 앱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Themo Fisher 클라우드</td><td>분석 소프트웨어 qRT-PCR 데이터</td></tr><tr><td>금성 소프트웨어</td><td>Hamilton Robotics</td><td>VENUS Two Dynamic Schedular 5.1 <</td><td>br/> 자동화 시스템용 소프트웨어 제어 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

인간 유도만능 줄기세포(hiPSC)에 대한 수동 배양 및 분화 프로토콜은 표준화가 어렵고, 가변성을 나타내며, 원치 않는 세포 유형으로 자발적으로 분화하는 경향이 있다. 이 방법은 노동 집약적이며 대규모 실험에 쉽게 순종할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 고처리량 이미징 시스템과 결합된 자동화된 세포 배양 시스템을 개발하고 여러 hiPSC 라인을 병렬 및 뉴런 분화로 유지하기 위한 프로토콜을 구현했습니다. 6\u20128일 이내에 hiPSC 유래 피질 뉴런을 생성하기 위해 Neurogenin-2(NGN2)를 이용한 단기 분화 프로토콜의 자동화를 설명하고, 65일 이내에 hiPSC 유래 중뇌 도파민기믹(mDA) 뉴런을 생성하는 장기 분화 프로토콜의 구현을 기술한다. 또한, 우리는 GFP 렌즈바이러스로 유도된 작은 분자 유래 신경 전구체 세포(smNPC)에 NGN2 접근법을 적용하고 살아있는 세포 자동화된 neurite 아웃growth 분석법을 확립했습니다. 우리는 일상적인 hiPSC 문화와 피질 및 도파민성 뉴런으로 분화에 적합한 프로토콜이있는 자동화 된 시스템을 제시합니다. 우리의 플랫폼은 새로운 질병 메커니즘 및 약물 목표를 식별하기 위해 장기적인 핸즈프리 문화와 고함량/고처리량 hiPSC 기반 화합물, RNAi 및 CRISPR/Cas9 스크리닝에 적합합니다.

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

이 연구의 전반적인 목표는 인간 IPS 세포를 학습하고 신경 혈통으로 분화하기 위한 자동화된 절차를 구현하는 방법과 자동화된 이미징을 구현하는 방법을 보여주는 것입니다. 표준화된 자동화 된 절차는 높은 현상 재현성을 보장하면서 낮은 실험 적 변화를 허용합니다. 또한 새로운 프로토콜의 개발에 맞게 시스템을 조정할 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 요아킴 태거와 엘리젤라 브레산, 우리의 실험실에서 포스트 문서입니다. 자동화 된 시스템의 그래픽 사용자 인터페이스에서 리소스 계측기 프로세스 보기를 클릭하고 리소스 계측기 프로세스를 선택합니다. 실행 계측기 프로세스를 클릭하고 실행 HEPA 후드및 다시 로드 프로세스를 실행합니다.로드할 리소스를 선택하고, 도어를 열고, 팝업 이미지에 표시된 대로 적절한 위치에 셀 배양 판과 일회용 팁을 로드합니다. 그런 다음 닫기 전에 70 %의 에탄올로 문을 오염 제거하고 오염 제거 프로세스를 실행합니다. 이 시스템은 30분 동안 UV 방사선에 의해 멸균됩니다.배양 배지 또는 해리 시약으로 플레이트를 적재하려면 HEPA 후드 스텝을 실행하고 액체 처리 스테이션의 문을 엽니다. 70%에탄올로 오염 제거 후, 저수지를 갑판에 배치하여 할당된 위치에 놓고 뚜껑을 닫습니다. 액체 처리 스테이션의 문을 닫은 다음 InitHepaHood 자원 계측기 프로세스를 실행하여 HEPA 후드를 전원을 공급합니다.자동화된 배양 방법을 실행하려면 그래픽 사용자 인터페이스의 캘린더 뷰에서 프로세스 단계를 클릭하고 실험에 사용할 셀줄을 선택합니다. 마법사를 사용하여 프로젝트를 선택하고 사용할 일괄 처리를 표시합니다. 오른쪽 화살표 헤드를 클릭하고 실행할 프로세스 단계를 선택하려면 마법사의 다음 페이지로 이동합니다.마법사의 마지막 페이지에서 실험을 예약하고 메서드를 실행하는 데 필요한 적절한 매개 변수 세부 정보 변수를 설정합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. 인간 IPS 셀 서스펜션으로 50 밀리리터 튜브를 적재한 후, 선반상에서 세포를 수신하기 위한 코팅된 배양판을 적재하고 튜브 방법으로부터 플레이트의 파싱을 실행한다. 브라이트필드 이미징 사이토미터의 세포를 계산하려면 덱에 셀 서스펜션이 있는 384웰 카운팅 플레이트를 자동으로 준비하고 로봇 암을 사용하여 데크에서 브라이트필드 이미징 사이토미터로 384웰 카운팅 플레이트를 전송합니다.계산 후 시스템은 플레이트를 원래 위치로 되돌리고 코팅된 문화권 또는 분석판을 선반에서 파이펫팅 데크로 옮깁니다. 그런 다음 시스템은 플레이트에 적합한 사용자 정의 번호 및 볼륨의 셀을 시드하고 파이펫팅으로 혼합합니다. 시드 후, 플레이트는 이산화탄소 인큐베이터로 옮겨지기 전에 세포 분포를 위해 분당 500회전에서 10초 동안 온데크 셰이커로 이동됩니다.자동화된 합류를 평가하려면 검사 합류 방법을 실행하고 적어도 하나의 배양 판과 분석 플레이트가 없는 배치를 선택합니다. 매개 변수 세부 정보 섹션에서 이미징 분석 설정에서 이미지 수집을 위해 iPSCf_2020 입력합니다. 그런 다음 시스템은 인큐베이터에서 브라이트필드 이미징 세포계로 첫 번째 플레이트를 전송하고 세포 합류를 이미지화합니다.세포 배양 또는 분석 플레이트 미디어를 변경하려면 배양 판 방법의 미디어 변경을 실행하고 배양 판만 포함하는 배치를 선택합니다. 시스템은 판을 갑판으로 옮기고 판을 기울여 상체의 포부를 허용합니다. 상체는 폐기물 수거 모듈에 버려지고 팁을 폐기하고 신선한 매체의 12 밀리리터가 각 접시에 추가됩니다.그런 다음 시스템은 플레이트를 다시 뚜껑을 닫고 판을 세포 배양 인큐베이터로 반환합니다. 또는 분석 플레이트의 매체를 변경하려면 분석 플레이트 방법의 미디어 변경을 실행합니다. 세포를 경작하기 위해, 부착 된 세포 방법의 하위 경작을 실행하고 하위 가 필요한 배양 판을 포함하는 배치를 선택합니다.매체를 폐기한 후, 시스템은 세포에 0.5 밀리롤러 EDTA의 8밀리리터를 추가하기 전에 플레이트당 PBS8 밀리리터로 세포를 한 번 씻는다. 기울기 옵션으로 갑판에서 8분 후 EDTA는 플레이트당 12밀리리터의 신선한 매체로 대체됩니다. 이 시스템은 식민지를 50~80마이크로른 덩어리로 나누기 위해 5주기의 파이프팅으로 세포를 세트리히하기 전에 식민지를 제거하기 위해 분당 2, 000 회전에서 플레이트를 흔들것입니다.그런 다음 세포는 갑판에 있는 50 밀리리터 튜브로 옮겨진 다음 1대 7 분할 비율로 시드됩니다. 자동화된 고함량, 높은 처리량 세포 이미징의 경우 이미징 방법을 실행하고 적어도 하나의 분석 플레이트와 배양 판이 없는 배치를 선택합니다. 그런 다음 시스템은 이미징을 위해 자동 공초점 현미경으로 분석 플레이트를 전송합니다.필요한 프로세스 단계를 수행하는 동안 올바른 배치 및 플레이트 ID를 선택해야 합니다. hiPSC 배양은 성장을 위해 매일 감시되고 브라이트필드 이미징 사이토미터에서 의 합류 비율을 분석해야 합니다. 수동 또는 자동화된 시스템 배양 후, 세포는 전형적인 줄기 세포 및 흉부 마커 발현을 나타낸다.자동화된 배양 시스템에서 분화된 뉴런은 수동으로 재배되는 뉴런과 유사한 형태학 및 뉴런 네트워크 조직을 시연한다. 6일간의 분화 후, 자동으로 분화된 피질 뉴런은 뉴런 특이적 등급 III 베타-튜룰린 및 상부 피질 층 마커 발현에 대해 양성이다. 8 일 후, 세포는 또한 마이크로 튜블러 관련 단백질 2, 신경 세포 접착 분자, 및 시냅신 I뿐만 아니라 피질 뉴런 마커를 표현했다.이러한 마커의 발현은 매우 낮거나 전혀 hiPSC에서 관찰되지 않습니다. 이 시스템은 또한 중성염 길이가 수동 개입없이 분화의 11 일 이상 측정 할 수 있도록 라이브 셀 자동화 된 neurite 아웃 성장 분석체를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 자동화된 배양 시스템을 사용하여 65일 간의 배양 기간 동안 중간 변화를 수행하면 예상 된 세포 조직 및 형태와 함께 중뇌 도파민 성 뉴런으로 hiPSC 분화를 용이하게합니다.중성염 외성장 이외에, 신경 변성을 연구하는 것과 관련된 다른 자동화된 피노티픽 어약, 예를 들어, TDP-43 전좌 RNA 포시 및 알파 시뉴클레인 피브릴 섭취량은 이 높은 처리량, 높은 함량의 포맷을 사용하여 탐구할 수 있다.

automated-production-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

만능 인간 줄기 세포의 neuronal 차별화 (hPSCs)에 대한 프로토콜은 종종 시간이 소요되어 있으며 상당한 세포 배양 기술을 필요로합니다. 여기, 우리는 통제 된 방식으로 인간의 뉴런의 간단 신속하고 효율적인 생성을 허용하는 multititre 판 형식으로 작은 분자 기반의 차별화 절차를 적응하고 있습니다.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

이 동영상은 인간 신경전구세포(NPC)를 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. NPC는 확립된 마우스 성상세포-쥐 피질 뉴런 공동 배양에 도입되어 NPC가 뉴런으로 분화되는 것을 촉진합니다. 분화는 컨포칼 현미경으로 세포를 시각화하여 확인됩니다.

인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 흥분성 피질 뉴런을 생성하는 방법을 보여줍니다. 독시사이클린 유도 시, hiPSC는 신경 특이적 전사 인자인 뉴로게닌-2를 과발현합니다. 특정 배지를 사용하고 성상세포와 공동 배양함으로써, 이 과정은 hiPSC가 시냅스 연결을 가진 뉴런으로 분화하는 것을 용이하게 합니다.

Differentiating human-induced pluripotent stem cells into neurons on micro-electrode arrays (인간 유도 만능 줄기세포를 마이크로 전극 어레이의 뉴런으로 분화)

우리는 발달 생물학의 지식과 발표된 연구를 바탕으로 인간 배아 줄기 세포와 인간 유도 만능 줄기 세포 모두에서 A9 중뇌 도파민 뉴런을 효율적으로 생성할 수 있는 최적화된 프로토콜을 개발했으며, 이는 파킨슨병에 대한 질병 모델링 및 세포 대체 요법에 유용할 것입니다.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

우리는 수정하고 흥분 대뇌 피질의 뉴런 (12)에 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 빠른 재현, 효율적인 분화를 설명하는 이전에 게시 된 프로토콜을 구현합니다. 특히, 우리의 수정은 네트워크 레벨에서의 전기 생리 학적 특성을 측정하기위한 마이크로 - 전극 어레이의 신경 세포 밀도 및 사용의 제어를 허용한다.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

사용 가능한 만능줄기세포(PSC)-기능성 세포 분화 시스템은 현재 심각한 line-to-line 및 batch-to-batch 변동성 문제로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 심장 분화를 주요 예로 사용하여 이미지 기반 기계 학습을 기반으로 PSC 분화 과정을 지능적으로 모니터링하고 조절하는 프로토콜을 제시합니다.

만능줄기세포 분화를 모니터링하기 위한 살아있는 세포 이미지 기반 기계 학습 전략

배우세요 hiPSC를 뉴런 계통으로 자동 분화시키는 방법을. Brightfield 및 공초점 현미경을 활용한 통합 라이브 셀 모니터링으로 재현성 높은 신경과학 연구가 가능합니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

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