쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작

연구에 따르면 두개골 안면 뼈에서 유래한 BMSC는 축 뼈 및 부속 뼈에서 유래한 BMSC보다 우수한 능력을 나타냅니다. 따라서 하악 BMSC는 두개안면 질환의 미래 치료법을 개발하기 위해 선호되는 자원으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 전체 골수 순응도와 형광 세포 분류의 장점을 결합하여 단시간에 상당한 수의 정제된 하악 BMSC를 얻을

이 프로토콜을 처음 시도하는 경우 이 비디오를 보거나 관련 문헌을 읽음으로써 달성할 수 있는 쥐 하악골의 해부학적 구조와 기능적 움직임을 이해하는 것이 매우 중요하다고 생각합니다. 쥐를 안락사시킨 후 깨끗한 흄 후드에 누운 자세로 놓습니다. 양측 앵귤러스 오리스(angulus oris)의 피부와 협곡근(buccinator muscle)을 하악골의 뒤쪽 부위까지 절개합니다.

두 엄지손가락으로 상악 앞니와 하악 앞니를 반대 방향으로 밀어 쥐의 입을 벌리면 하악골에 붙어 있는 하악 치아가 드러납니다. 협측 근육과 코라코이드에 부착된 힘줄과 하악골의 아래쪽 경계를 완전히 분리하십시오. 그런 다음 하악 뒤쪽 치아를 누르고 양쪽의 과두가 명확하게 드러날 때까지 앞뒤로 회전시킵니다.

하악체와 두개골을 분리하고 젖은 거즈를 사용하여 뼈 표면의 접착 연조직을 청소합니다. 생존력을 보존하기 위해 미리 냉각된 최소 필수 매체 알파 또는 얼음 위의 PBS로 채워진 10cm 멸균 유리 접시에 뼈를 놓습니다. 하악체에서 첫 번째 대구치의 근심 가장자리를 따라 앞쪽 뼈를 잘라낸 다음 세 번째 대구치의 원위 가장자리를 따라 코라코이드와 과두를 포함한 하악골 골을 제거하여 골수를 노출시킵니다.

10cm 멸균 유리 접시에 10ml의 알파-MEM을 10%FBS로 채웁니다. 10ml 주사기로 배지를 흡입한 다음 바늘을 골수강에 삽입하고 골수를 접시에 반복적으로 플러시합니다. 뼈가 하얗게 변할 때까지 뼈의 근심 및 원위 양쪽에서 각각 최소 3회 골강을 세척합니다.

플러시된 세포가 포함된 배지를 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 800RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10%FBS가 있는 알파-MEM 3밀리리터로 세포를 재현탁합니다. 새로운 10cm 배양 접시에 세포를 플레이트화하고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 온도에서 배양합니다.

배양 배지를 흡인하고 PBS로 접시를 씻습니다. 접시에 0.02% EDTA가 함유된 0.25% 트립신 2밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 소화합니다. 그런 다음 10% FBS가 있는 알파-MEM 4밀리리터를 첨가하여 반응을 중지합니다.

셀 현탁액을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 800RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 10% FBS로 120마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 100마이크로리터의 셀 현탁액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

섭씨 4도에서 CD16부터 CD32까지 1마이크로리터의 항체로 세포 현탁액을 15분 동안 차단하고, CD45에 대한 PE 접합 항체, CD90에 대한 FITC 결합 항체, CD29에 대한 APC 항체로 세포를 섭씨 4도에서 어둠 속에서 1시간 동안 염색합니다. 다른 20마이크로리터의 세포 현탁액을 염색되지 않은 음성 대조군으로 사용합니다. 튜브를 800RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버리고 10% FBS로 0.5ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 분석 10분 전에 밀리리터 DAPI당 0.01밀리그램 10마이크로리터를 추가합니다. 원심분리 튜브에 배치된 40나노미터 필터를 사용하여 세포를 여과한 다음 형광 활성화 세포 분류기에서 세포를 분석합니다.

먼저 DAPI 음성 세포를 게이팅하여 전체 세포 수에서 죽은 세포를 제거한 다음 선택한 세포에서 CD29 양성, CD90 양성, CD45 음성을 표적 mBMSC로 게이트합니다. 분류된 mBMSC를 10%FBS가 포함된 5mL의 알파-MEM이 있는 15ml 원심분리기 튜브에 수집합니다. 튜브를 800RPM에서 5분 동안 원심분리하고 수집 버퍼를 제거합니다.

1ml의 신선한 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시킨 다음 6cm 배양 접시에 플레이트를 만듭니다. 이 프로토콜을 사용하여 많은 비율의 세포가 초기 배양 후 3일째에 플레이트에 부착되었습니다. 추가로 3-4일간의 배양 후 세포 합류도는 70-80%에 도달했습니다.P0 세포에서 약 81.1%를 차지하는 mBMSC를 정제하기 위해 형광 세포 분류를 사용했습니다.

일주일 동안 6개의 웰 플레이트에서 P2 mBMSC를 배양한 후, 상당한 양의 집락 형성 단위가 관찰되었습니다. mBMSC의 다중 계통 분화 능력을 평가하기 위해 그들은 골-연골 및 지방 계통으로 유도되었습니다. ALP의 활성 증가, 알리자린 적색 염색 하에서 적색 석회암 결절, 골형성 특이적 유전자 Runx2, Alp, Bsp 및 Ocn의 발현 증가는 골형성 유도를 나타냅니다.

지방 형성을 확인하기 위해 Oil-red-O 염색을 사용했습니다. 수많은 지질이 풍부한 액포가 유도 9일 후에 분명했습니다. 또한, 지방생성 특이적 유전자 Ppar-gamma-1 및 Cebpa의 발현이 증가하였다.

샘플은 연골형성 분화에 대한 현미경 관찰 동안 Alcian blue에 대해 양성 염색을 보여주었습니다. 또한, 항-II형 콜라겐 항체를 이용한 면역염색은 연골 기질의 축적을 강화한 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜에서는 mBMSC의 실행 가능성을 보장하는 것이 매우 중요합니다.

이 목적은 적절한 실험 동물을 선택하고, 얼음 위에서 작업하고, 실험 시간을 단축함으로써 달성 할 수 있습니다. 이를 체외 모델을 활용하면 많은 수의 증식성 하악 골밀도를 얻을 수 있으며, 이는 생물학적 특성, 미세 환경에 대한 후속 반응 및 하악 골밀도세포의 기타 응용에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.