Name: 쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 쥐 하악골에서 골수 간엽 줄기 세포를 분리하고 배양하는 방법을. 유세포 분석술을 활용한 이 기법은 두개안면 질환 치료 연구에 활용됩니다.

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상하이 9대 인민병원의 두개안면 이상에 대한 디지털화된 스토마토로지 연구센터의 도움을 주셔서 감사합니다. 이 원고의 작품은 중국 국립 자연과학재단(NSFC)[81570950,81870740,81800949]의 보조금으로 지원되고, 상하이 서밋 & 고원 분야, 상하이 정밀 의학 연구소, 상하이 9인조 병원, 상하이 자오동 의과대학 [JC201809], 상하이 자오동 대학 의과대학 고원혁신팀 인센티브 프로젝트. L.J.는 우수 청소년 의료 인재, 상하이 "의학 재능의 떠오르는 별" 청소년 개발 프로그램 및 상하이 자오퉁 대학의 "첸 싱" 프로젝트의 학자입니다.

이 논문의 모든 동물 실험 절차는 상하이 제9인민병원, 상하이 자오동 대학교 의과대학의 동물관리위원회의 승인을 받았습니다.
1. 준비
<ol><li>실험에 대 한 두 5 주 된 남성 스프라 그 다울리 쥐를 사용.</li>
	<li>바늘 홀더, 핀셋 및 가위를 포함한 모든 계측기를 고온에서 살균하거나 75% 에탄올에 10분 동안 침지합니다. 참고: 에탄올 침수가 세포 손상을 피하기에는 너무 길어서는 안 됩니다.</li>
	<li>문화 매체를 미리 준비하며, 구성은 표 1에제공된다. 아래에 설명된 대로 각 매체를 보충하십시오.<ol>
<li>α-MEM 배양 배지(10% FBS) 제제: 최소 필수 중간 알파(α-MEM)를 10% 태아소 혈청과 1% 페니실린 및 연쇄절제술을 보충합니다.</li>
		<li>골성 분화 배지 의 준비: 10% 태아 소 혈청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.20% 아스코르브산, 1% β-글리페로포산 및 0.01% dexamethasone을 가진 보충 골성 분화 기저질 배지.</li>
		<li>골성 유도 매체의 준비: 혼합 70% α-MEM 배양 배지 (와 10% FBS) 및 30% 골성 분화 매체.</li>
		<li>아디포겐성 분화 매체 A: 10% 태아소 혈청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-연쇄절제술, 0.20% 인슐린, 0.10% IBMX, 0.10% 로시글리타존, 0.01% Dexamhasone.</li>
		<li>adipogenic 분화 매체 B의 준비: 보충 adipogenic 분화 기저 배지 와 10% 태아 소 혈 청, 1% 글루타민, 1% 페니실린-연쇄 절제술 및 0.20% 인슐린.</li>
		<li>연골분균 분화 배지: 보충 연골분화 기저질 배지 0.01% 덱사메타손, 0.30% 아스코르브산, 1% ITS, 0.10% 피루바테 나트륨, 0.10% 프롤린, 1% TGF-β3. 참고: 골성 분화 배지는 구성 후 한 달 이내에 사용해야 합니다. 구성된 연골생성 분화 배지의 유효 기간은 12h이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 쥐 mBMSC의 격리 및 재배
참고: 모든 실험 작업은 세포 생존가능성을 유지하기 위해 가능한 한 얼음에서 수행해야 합니다.
<ol><li>수확 쥐 하악<ol>
<li>CO2 질식에 의해 두 5 주 된 남성 스프라그 Dawley 쥐를 안락사. 실험을 진행하기 전에 동물의 호흡이 멈추는지 확인합니다.</li>
		<li>3 분 동안 75 % 에탄올을 포함하는 비커에서 이 쥐를 헹구세요.</li>
		<li>쥐를 깨끗한 연기 후드 안에 놓고 하악을 수확합니다. 참고: 사용 전에 30분 동안 자외선으로 연기 후드를 살균하십시오.</li>
		<li>쥐를 척추 위치에 놓습니다. 피부와 부치네터 근육을 양자 간 통구 오리에서 하악의 후방 부위로 절개하여 절개를 낮은 유일한 이동 가능한 뼈입니다. 참고: 명확한 작동 필드를 얻기 위해 귤 오리스의 각 측면에 2cm 절개를 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>양 엄지 손가락으로 양상악절 절개를 반대 방향으로 밀어 쥐의 입을 열어 하악에 부착된 하악치아를 노출시다.</li>
		<li>코라코이드와 하악의 열등한 경계에 부착된 부칼 근육과 힘줄을 완전히 분리합니다. 참고: 근육 긴장의 부족 때문에 이 단계에서 하악의 증가 이동성이 관찰됩니다.</li>
		<li>양면의 콘딜레가 명확하게 드러나질 때까지 하악 후방 치아를 누르고 앞뒤로 회전합니다. 참고: 이 단계는 쥐의 입을 인위적으로 열어 콩딜을 탈구할 수 있는 최대 범위까지 수행된다. 하악은 양측 콘딜레를 통해 두개골에 연결되어 있으므로 condyles의 노출은 두개골과 하악 사이의 단절로 이어집니다.</li>
		<li>하악의 몸을 두개골과 분리합니다.</li>
		<li>젖은 거즈를 사용하여 뼈 표면에 부착 된 연조직을 청소하십시오.</li>
		<li>뼈를 10cm 멸균 유리 접시에 넣고 생존력을 유지하기 위해 얼음 위에 최소 필수 α(α-MEM) 또는 인산염 완충식식식(PBS)으로 채워져 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC의 격리 및 재배<ol>
<li>하악 몸에서 첫 번째 어금니의 매혹적인 가장자리를 따라 전방 뼈를 잘라. 골수 구멍을 노출하는 세 번째 어금니의 탈반 가장자리를 따라 코라코이드와 콘딜을 포함한 하악라무스를 제거합니다.</li>
		<li>10cm 멸균 유리 접시에 10mL의 α-MEM(10% FBS)을 채웁니다.</li>
		<li>1mL 주사기를 사용하여 α-MEM 배양 배지를 흡인하십시오. 주사기 바늘이 골수 구멍에 삽입되어 골수를 접시에 반복적으로 플러시합니다. 뼈가 하얗게 변할 때까지 뼈의 심미적 측면과 말단 측면에서 뼈 구멍을 3회 이상 플러시하십시오. 참고: 이것은 쥐 하악의 골수 구멍이 긴 뼈에서와 같이 명백하지 않기 때문에 가장 중요한 단계이며 바늘을 삽입하는 적절한 지점은 경험적으로 결정되어야합니다. 위의 모든 실험 샘플은 세포 생존가능성을 유지하기 위해 얼음에 저장되어야하므로 작동 시간이 2h 이상이어야합니다.</li>
		<li>플러시 된 세포를 포함하는 매체를 15 mL 원심분리기 튜브 및 원심분리기로 5 분 동안 4 °C에서 800 x g로 전송합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>α-MEM의 3mL로 세포를 다시 중단합니다(10% FBS). 새로운 10cm 배양 접시에 세포를 플레이트와 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배양.</li>
		<li>문화의 3 일에 이러한 세포의 형태학적 변화와 성장을 확인합니다. 비부착 세포 및 조직 단편으로 배양 배지를 제거합니다. 10% FBS를 통해 신선한 α-MEM 10mL를 부드럽게 추가합니다.</li>
		<li>문화 7일 간 P0 mBMSC는 70%에서 80%로 합류했습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>플로우 셀 정렬 참고: P0 mBMSC는 유동 셀 분류를 통해 표기적으로 확인되고 주로 정제되었다.<ol>
<li>배양 매체를 흡인하고 폐기한 다음 PBS로 접시를 씻으십시오. PBS를 폐기합니다.</li>
		<li>요리에 0.02 % EDTA와 0.25 %의 트립신의 1 mL을 추가합니다. 세포를 37°C에서 5분 동안 소화한 다음, α-MEM 2mL(10% FBS)를 추가하여 반응을 중지합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브와 원심분리기로 5분 동안 800 x g로 옮긴다.</li>
		<li>원심 분리 후 PBS의 120 μL (10 % FBS)에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>15 분 동안 4 °C에서 CD16 / CD32에 대한 항체의 1 μL로 이러한 세포 현탁액을 차단하십시오.</li>
		<li>세포 현탁액의 100 μL을 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮기고, CD45에 대한 피코에리스린(PE)-컨쥬게이드 항체, CD90 및 알로피코시아니아닌(APC)-공주 항체에 대한 피코에리스린(PE)-컨쥬게이드 항체를 가진 세포를13,15에서1°C에 4°C로 염색하였다. 본 실험에 사용되는 항체의 농도는 표 2에도시된다. 다른 20 μL의 세포 현탁액을 얼룩지지 않은 음극으로 사용하십시오.</li>
		<li>그런 다음 5 분 동안 800 x g에서 튜브를 원심 분리하고 서스펜션을 폐기하고 PBS의 0.5 mL (10 % FBS)에서 세포를 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>분석 전에 10 분 동안 0.01 mg / mL DAPI의 10 μL을 추가합니다.</li>
		<li>원심분리기 튜브에 배치된 40nm 필터를 사용하여 세포를 필터링합니다.</li>
		<li>형광 활성화 셀 선별기에서 세포를 분석합니다. 패널을 다음과 같이 설정합니다. 첫째, DAPI-세포를 게이팅하여 총 세포 수에서 죽은 세포를 제거한 다음 CD29+CD90+CD45를 대상으로 한 mBMSC로서 선택된 세포에서 제거합니다.</li>
		<li>정렬된 CD29+CD90+CD45- 셀을 3mL의 α-MEM(10% FBS)이 미리 준비된 15mL 원심분리기 튜브로 수집합니다.</li>
		<li>5 분 동안 800 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 컬렉션 버퍼를 제거하고 10%의 FBS가 있는 신선한 α-MEM 1mL을 추가하여 셀을 다시 일시 중지합니다. 그런 다음 6cm 문화 요리에 접시를 접시에 담아 놓습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 식민지 형성 능력
참고: 이 단계는 mBMSC의 분할 능력을 확인하기 위해 수행되었습니다. 15
<ol><li>이 실험에 대해 두 번째 통로 mBMSC(P2)를 선택합니다. 세포 합류가 80%에서 90%에 도달하면, 6웰 플레이트의 직렬 그라데이션에서 세포를 재시드하여 클로날 증식 능력을 평가합니다. 참고: 그라데이션을 1 x 102에서 1 x 103 세포로 설정하는 것이 좋지만 인간 또는 동물 기원의 상이한 세포주의 최종 희석은 경험적으로 결정되었습니다.</li>
	<li>α-MEM에서 세포를 배양 (와 10% FBS) 식민지 형성 단위의 좋은 수가 빛 현미경에서 볼 수 있을 때까지 약 2 주 동안. 3일마다 배양 매체를 새로 고칩니다.</li>
	<li>배양 배지를 흡기하고 폐기하고, PBS로 우물을 한 번에 5분 동안 두 번 씻는다. 다음으로 각 웰에 4 % 파라포름 알데히드 솔루션을 추가하고 적어도 10 분 동안 수정합니다.</li>
	<li>파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 우물을 두 번 헹구는 다.</li>
	<li>크리스탈 바이올렛 염색 용액으로 세포를 염색하고 약 10 분 동안 37 °C로 배양하십시오. 참고: 원하는 음영이 이루어질 때까지 염색 시간이 적절하게 조정되었습니다.</li>
	<li>염색 용액을 제거하고 샘플을 증류수로 씻어 반응을 중지합니다.</li>
	<li>입체 현미경의 밑에 심상 및 적어도 50개의 세포로 구성된 흩어진 세포 식민지를 계산합니다.</li>
</ol>4. mBMSC의 다중 리니지 차별화
참고: P2 mBMSC는 달리 설명되지 않는 한 후속 실험에 사용되었습니다.
<ol><li>mBMSC의 골성 유도<ol>
<li>위에서 설명한 대로 mBMSC를 소화합니다. 종자 세포는 1mL α-MEM(10% FBS)으로 보충된 12개의 웰 플레이트에서 2.5 x 105/cm2의 밀도로.</li>
		<li>세포 합류가 60-70%에 도달하면 배지를 30%의 골성 유도 매체로 변경합니다. α-MEM(10%의 FBS)을 가진 세포를 음수 대조군으로 배양하고 2일마다 배지를 변경합니다. 참고: 골발생 시 칼슘 요절이 많이 나타난 후, 중간 교환 패턴을 2일마다 반부량의 중간 교환으로 변경하여 골세포가 떠다니는 것을 방지하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>7일 동안 배양한 후, 알칼리성 인산염염색(16,17)에의해 이들 세포의 석회화를 평가한다.</li>
		<li>배양 배지를 제거하고 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오. 잘 1mL의 PBS를 사용하여 세포를 헹구고 3 분 동안 두 번.</li>
		<li>그런 다음 알칼리성 인산염 염색 용액으로 세포를 염색하고 10-30 분 동안 37 °C에서 배양합니다. 참고: 필요한 색상을 얻기 위해 실온에서 하룻밤 동안 배양할 수 있습니다.</li>
		<li>우물을 증류수로 씻어 반응을 멈춥시다. 가벼운 현미경으로 사진을 찍습니다. 적색 색소 과립은 알칼리성 인산염 (ALP) 활성을 나타냅니다.</li>
		<li>나머지 세포를 7일 동안 배양한 후, 알리자린 적색 염색을 수행하여 세포의 광물화 능력을 평가한다.</li>
		<li>세포 고정 후 0.5% 알리자린 적색 염색 용액으로 세포를 10분16,18에염색한다. 3-5 분 후에 증류수로 염색체 반응을 중단하십시오. 참고: 개발된 색상에 따라 반응 시간을 연장할 수 있습니다.</li>
		<li>마지막으로, 배양판을 빛 현미경 아래에 놓아 골성 염색효과를 관찰한다. 붉은 목절은 이 세포의 칼슘 퇴적물을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC의 유도<ol>
<li>상기와 같이 12웰 플레이트에서 종자 P2 mBMSC.</li>
		<li>웰이 90% 컨서크후, 반포성 분화 배지A를 가진 세포를 배양하여 α-MEM 배양 배지(10% FBS)에서 배양된 세포를 음수 대조군으로 사용한다.</li>
		<li>유도 2일 후, 배지 A를 우물에서 흡인시키고 각 웰에 1mL의 비원성 분화 매체 B를 첨가한다.</li>
		<li>하루 후, 중간 크기 B를 제거하고 우물에 다시 추가 된 중간 A와 함께 다시 주기를 시작합니다. 중간 크기 A 및 B를 사용하여 세포를 번갈아 배양합니다.</li>
		<li>분화 배지 A와 B를 3주기동안 번갈아 적용하고 오일 레드 O 염색16,18에의해 이들 세포의 분리 발생을 검출한다. 참고: 둥근 및 큰 지질 방울의 제비는 추가 2 3 일 동안 분화 매체 B로 이 세포를 배양하여 관찰될 수 있습니다.</li>
		<li>배지를 제거하고 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. PBS로 셀을 씻어내라.</li>
		<li>오일 레드 O 염색 용액으로 세포를 염색하고 약 3 분 동안 37 °C에서 배양합니다.</li>
		<li>염색 용액을 제거하고 증류수로 우물을 씻으시다.</li>
		<li>빛 현미경으로 사이포발생을 관찰한다.</li>
	</ol></li>
	<li>mBMSC의 연골 발생 유도<ol>
<li>종자 P2 mBMSC 15 mL 원심분리기 튜브에서 5 x 105/cm2의밀도.</li>
		<li>300 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>연골분화 배지의 0.5 mL로 세포를 다시 중단한다. 세포를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
		<li>원심분리기 튜브의 캡을 풀고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 매 2일마다 매체를 갱신합니다. 참고: 세포는 24시간 후에 펠릿을 시작합니다. 원심분리기 튜브를 48h로 옮기지 않는 것이 좋습니다. 매체를 변경할 때 세포 펠릿을 흡인하지 않도록 주의하십시오.</li>
		<li>유도 21 일 후, 탈수, 파라핀 포함 및 단면다음 4 % 파라 포름 알데히드로 세포 펠릿을 수정합니다.</li>
		<li>탈파화 및 수분 공급 후, 알시안 블루 용액의 슬라이드를 최소 15분18,19,20,21에염색한 다음 증류수로 씻어 반응을 중지합니다. 가벼운 현미경으로 사진을 캡처합니다.</li>
		<li>콜라겐 타입 II의 면역 형광 염색의 경우, 아래 단계를 수행하십시오.<ol>
<li>5 μg/mL 단백질Ase K로 슬라이드를 37°C에서 15분 동안 배양하여 데파라피화 및 수분 화 단계 후 배양합니다.</li>
			<li>슬라이드를 블로킹 버퍼에서 37°C에서 1h로 배양합니다.</li>
			<li>콜라겐 형 II 항체의 1 μL을 슬라이드에 블로킹 버퍼의 200 μL에 적용하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
			<li>다음 날, PBS로 슬라이드를 두 번 세척하고 1 시간 동안 37 °C에서 이차 항체로 배양하십시오.</li>
			<li>슬라이스를 40,6-디아미티노-2-페닐린돌(DAPI)으로 10분 간 배양합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>형광 현미경 검사의 밑에 각 슬라이드의 사진을 찍습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 실시간 PCR
<ol><li>구아니듐 이소티오카네이트 기반의 시판제를 사용하여 mBMSC로부터 총 RNA를 추출한다.</li>
	<li>상용 키트를 사용하여 상호 보완적인 DNA로 RNA의 역 전사를 수행합니다. 역전사의 반응 조건은 다음과 같이: 5분 동안 65°C, 15분 동안 37°C, 15s에 대한 85°C.</li>
	<li>표 3에 나열된 프라이머를 사용하여 골발생 및 사이포발생 특이적 유전자를 검출하기 위해 실시간 PCR을 수행한다. PCR 증폭 절차는 다음과 같이: 5 분 동안 95 °C. 5 초에 대한 95 °C, 40 사이클에 대한 30 초에 대한 60 °C.</li>
</ol>

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모든 저자는 이해 상충이 없다고 말합니다.

이 프로토콜은 전체 골수 준수 및 형광 세포 분류를 결합하여 체외에서 쥐 하악에서 BMSC를 분리하는 방법을 설명하며, 이는 강력한 분화 능력으로 증식 mBMSC를 얻을 수있는 간단하고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 방법은 유동 셀 정렬에 의해 mBMSC를 예열적으로 정화할 수 있지만 세포 균질성에 대한 요구 사항이 더 높은 경우 보다 정확한 정제 방법이 필요할 수 있습니다.
현재, 전체 골수 준수, 밀도 그라데이션 원심 분리, 형광 세포 분류 및 자기 활성화 셀 정렬22를포함하여 mBMSC를 분리하는 데 사용되는 네 가지 주요 기술이 있다. 전체 골수 준수 및 밀도 그라데이션 원심 분리는 짧은 시간에 mBMSC를 얻기 위해 사용되는 가장 일반적이고 쉬운 방법이지만, 수확 된 mBMSC의 낮은 순도는 그들의 주요 단점이다. 마지막 두 가지 방법은 면역 학적 기술을 통해 고도로 정제 된 mBMSC를 분리 할 수 있지만, 오랜 시간을 복용하...

골수 관두 줄기 세포(BMSC)는 골수로부터 유래된 비-조혈 줄기 세포로, 강력한 증식 능력과 다중 계측 분화 전위1,2,3,4를나타낸다. 실제로, BMSCs는 뼈 조직 공학 및 재생을 위한 이상적인 후보로 그(것)들이 발견된 이래로 여겨졌습니다. 수년 동안, 경골과 대퇴골과 같은 장골 문장 또는 긴 뼈는 두개안 면재생을 위한 BMSCs의 일반적인 근원이었습니다. 그러나, 하악 BMSC(mBMSC)와 같은 오로페이셜 BMSC는 상이한 배아 기원 및 발달 패턴과 같은 긴 뼈 BMSC로부터 약간의 차이를 표시합니다. 하악은 신경 절제술 세균 층의 신경 문장 세포에서 발생하고 관상 골화를 겪는 반면, 축 및 부속 골격은 중년에서 온 것이며 내뇌부 진동을 겪습니다. 더욱이, 임상 관찰 및 실험동물 연구는 지속적으로 오로페이셜과 일악 문장 BMSC5,6,7,8사이에 기능적 차이가 있음을 나타내고있다. 보고서에 따르면 BMSC는 하악, 상악뼈 및 폐포 뼈와 같은 두개골 면성 뼈에서 유래한 것으로 나타났으며, 축 및 부속뼈9보다우수한 증식, 수명 및 분화 능력을 나타냈다. 따라서 mBMSC는 케루비즘, 턱 종양, 턱 뼈의 골다공증 및 치주 조직 결함10,11,12와같은 두개골 면질환의 미래 치료적용을위한 바람직한 자원으로 간주됩니다. 전임상 실험에서 치료 잠재력을 이해하려면 시험관내에서 mBMSC를 빠르게 격리하고 배양하는 방법을 확립하는 것이 필수적입니다.
이 연구에서는, 목표는 전체 골수 준수 및 흐름 세포 측정 분류에 의해 정제 된 mBMSC를 얻는 것이었습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (Micro-CT) 및 조직학적 섹션을 통해 명확하게 관찰 된 쥐 하악의 해부학 적 형태는 하악의 궤적 뼈가 절개 수막 공간과 폐포 뼈 사이에 있음을 보여 주었다. 궤적 골수로부터의 골수는 하악골 세포를 얻기 위해 플러시되었지만, 이런 식으로 배양된 세포는 순수한 mBMSC가 아니었으며 뼈, 지방 및 내피 세포로부터의 세포와 같은 다양한 혈통을 가진 여러 유형의 세포로 구성될 가능성이 있었다13,14. 세포 정화의 다음 단계는 특히 중요했다. 유동 세포질은 세포 표면 단백질의 조합을 인식함으로써 세포를 필터링하고 중간엽 줄기 세포의 농축에 널리 채택되어 왔다. 세포 균질성은 유동 세포측정의 주요 장점이지만, 공정은 세포 생존가능성을 결정하지 못하고 제한된 세포 수율을 초래할 수 있다. 이 연구에서는, 전체 골수 준수에서 얻은 P0 mBMSC는 높은 순도와 강한 증식 능력을 가진 mBMSC를 얻기 위하여 유동 세포질에 의해 분류되었습니다.
이 연구는 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별의 조합을 사용하여 쥐 하악 BMSC의 격리, 문화 및 분화를 위한 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 소개합니다. 관련 분야의 연구원이 사용할 수 있는 안정적이고 편리한 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA(1X)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>10cm 배양 접시</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acutenaculum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>지방 생성 분화 매체</td><td>Cyagen biosciences inc.</td><td>MUBMX-90031</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 인산가수분해효소 색상 개발 키트</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>알파-최소 필수 매체</td><td>GE Healthcare HyClone Cell Culture</td><td>SH30265.01B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CollagenII Rabbit pAb</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td></td></tr><tr><td>항체 CD16/CD32</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antifade Mounting Medium with DAPI</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0131</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse/rat CD29 항체</td><td>biolegend inc</td><td>102215</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet</td><td>Esco</td><td>AC2-4S8-CN</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0461-82</td><td></td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) 단클론 항체 (HIS51), FITC, eBioscience</td><td>Invitrogen11-0900-85</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>cence</td><td>L500</td><td></td></tr><tr><td>연골 형성 분화 매체</td><td>cyagen biosciences inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛 염색 솔루션</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>C0121</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>GE 헬스케어 HyClone 세포 배양</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Esco</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Magzol 시약(Trizol 시약)</td><td>Magen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.골형성 분화 배지</td><td>CYAGEN 생명과학 Inc.</td><td>MUBMX-90021</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(1X)</td><td>Gibco</td><td>20012027</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT 마스터 키트</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td>RR036A</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 K</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>퀵블록 차단 완충액</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>P0260</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR1 프리믹스</td><td>TakaRa Bio Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐에 있는 간골 골수 관진 줄기 세포의 격리 그리고 경작

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

여기서 우리는 실험 요구 사항에 대한 수많은 고품질 세포를 빠르게 얻기 위해 시험관에서 하골 골수 중년 줄기 세포 (mBMSC)를 격리하고 배양하는 효율적인 방법을 제시합니다. mBMSC는 우수한 자기 갱신 능력과 다중 계보 분화 잠재력으로 인해 미래에 두개골 면질환 및 두개골 -상악안면 재생의 경우 조직 공학 세포로서 치료 응용 분야에서 널리 사용될 수 있습니다. 따라서 대량으로 mBMSC를 얻는 것이 중요합니다.
이 연구에서는, 골수는 하악에서 플러시되었고 1 차적인 mBMSCs는 전체 골수 부착 재배를 통해 격리되었다. 또한, CD29+CD90+CD45- mBMSC는 형광 세포 분류를 통해 정제되었다. 정제 된 mBMSC의 2 세대는 추가 연구를 위해 사용되었고 골세포, 지방 세포 및 연골 세포로 분화할 수있는 잠재력을 표시했습니다. 이를 활용한 시험관 내 모델을 활용하여 생물학적 특성, 마이크로 환경에 대한 후속 반응 및 mBMSC의 다른 응용 분야의 연구를 용이하게 할 수 있는 많은 수의 증식 mBMSC를 얻을 수 있다.

이 프로토콜을 사용하여, 세포의 큰 비율은 초기 배양 후 3 일에 플레이트에 부착. 전형적으로, 추가 3-4일 배양 후, 세포 합류는 70~80%(도1B)에도달하였다. 형광 세포 분류, DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSC는 P0 세포에서 약 81.1 %를 차지하는18,22를정제하였다(도 1C).
P2 mBMSC를 100세포에서 100개의 세포에 1주일 동안 6웰 플레이트씩 파종한 후, 상당한 양의 콜로니 형성 유닛이 관찰되어 mBMSC(도1D)의중요한 식민지 형성 능력을 시사했다.
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이 문서에서는 쥐 하악에서 골수 메선 줄기 세포를 분리, 재배, 선별 및 식별하기 위한 전체 골수 준수 및 유동 세포 측정 선별을 결합하는 방법을 제시합니다.

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

연구에 따르면 두개골 안면 뼈에서 유래한 BMSC는 축 뼈 및 부속 뼈에서 유래한 BMSC보다 우수한 능력을 나타냅니다. 따라서 하악 BMSC는 두개안면 질환의 미래 치료법을 개발하기 위해 선호되는 자원으로 간주됩니다. 이 프로토콜은 전체 골수 순응도와 형광 세포 분류의 장점을 결합하여 단시간에 상당한 수의 정제된 하악 BMSC를 얻을 수 있습니다.이 프로토콜을 처음 시도하는 경우 이 비디오를 보거나 관련 문헌을 읽음으로써 달성할 수 있는 쥐 하악골의 해부학적 구조와 기능적 움직임을 이해하는 것이 매우 중요하다고 생각합니다. 쥐를 안락사시킨 후 깨끗한 흄 후드에 누운 자세로 놓습니다. 양측 앵귤러스 오리스(angulus oris)의 피부와 협곡근(buccinator muscle)을 하악골의 뒤쪽 부위까지 절개합니다.두 엄지손가락으로 상악 앞니와 하악 앞니를 반대 방향으로 밀어 쥐의 입을 벌리면 하악골에 붙어 있는 하악 치아가 드러납니다. 협측 근육과 코라코이드에 부착된 힘줄과 하악골의 아래쪽 경계를 완전히 분리하십시오. 그런 다음 하악 뒤쪽 치아를 누르고 양쪽의 과두가 명확하게 드러날 때까지 앞뒤로 회전시킵니다.하악체와 두개골을 분리하고 젖은 거즈를 사용하여 뼈 표면의 접착 연조직을 청소합니다. 생존력을 보존하기 위해 미리 냉각된 최소 필수 매체 알파 또는 얼음 위의 PBS로 채워진 10cm 멸균 유리 접시에 뼈를 놓습니다. 하악체에서 첫 번째 대구치의 근심 가장자리를 따라 앞쪽 뼈를 잘라낸 다음 세 번째 대구치의 원위 가장자리를 따라 코라코이드와 과두를 포함한 하악골 골을 제거하여 골수를 노출시킵니다.10cm 멸균 유리 접시에 10ml의 알파-MEM을 10%FBS로 채웁니다. 10ml 주사기로 배지를 흡입한 다음 바늘을 골수강에 삽입하고 골수를 접시에 반복적으로 플러시합니다. 뼈가 하얗게 변할 때까지 뼈의 근심 및 원위 양쪽에서 각각 최소 3회 골강을 세척합니다.플러시된 세포가 포함된 배지를 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 800RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 10%FBS가 있는 알파-MEM 3밀리리터로 세포를 재현탁합니다. 새로운 10cm 배양 접시에 세포를 플레이트화하고 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도의 온도에서 배양합니다.배양 배지를 흡인하고 PBS로 접시를 씻습니다. 접시에 0.02% EDTA가 함유된 0.25% 트립신 2밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 소화합니다. 그런 다음 10% FBS가 있는 알파-MEM 4밀리리터를 첨가하여 반응을 중지합니다.셀 현탁액을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 800RPM으로 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 10% FBS로 120마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 100마이크로리터의 셀 현탁액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.섭씨 4도에서 CD16부터 CD32까지 1마이크로리터의 항체로 세포 현탁액을 15분 동안 차단하고, CD45에 대한 PE 접합 항체, CD90에 대한 FITC 결합 항체, CD29에 대한 APC 항체로 세포를 섭씨 4도에서 어둠 속에서 1시간 동안 염색합니다. 다른 20마이크로리터의 세포 현탁액을 염색되지 않은 음성 대조군으로 사용합니다. 튜브를 800RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 10% FBS로 0.5ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다. 분석 10분 전에 밀리리터 DAPI당 0.01밀리그램 10마이크로리터를 추가합니다. 원심분리 튜브에 배치된 40나노미터 필터를 사용하여 세포를 여과한 다음 형광 활성화 세포 분류기에서 세포를 분석합니다.먼저 DAPI 음성 세포를 게이팅하여 전체 세포 수에서 죽은 세포를 제거한 다음 선택한 세포에서 CD29 양성, CD90 양성, CD45 음성을 표적 mBMSC로 게이트합니다. 분류된 mBMSC를 10%FBS가 포함된 5mL의 알파-MEM이 있는 15ml 원심분리기 튜브에 수집합니다. 튜브를 800RPM에서 5분 동안 원심분리하고 수집 버퍼를 제거합니다.1ml의 신선한 배지를 첨가하여 세포를 재현탁시킨 다음 6cm 배양 접시에 플레이트를 만듭니다. 이 프로토콜을 사용하여 많은 비율의 세포가 초기 배양 후 3일째에 플레이트에 부착되었습니다. 추가로 3-4일간의 배양 후 세포 합류도는 70-80%에 도달했습니다.P0 세포에서 약 81.1%를 차지하는 mBMSC를 정제하기 위해 형광 세포 분류를 사용했습니다.일주일 동안 6개의 웰 플레이트에서 P2 mBMSC를 배양한 후, 상당한 양의 집락 형성 단위가 관찰되었습니다. mBMSC의 다중 계통 분화 능력을 평가하기 위해 그들은 골-연골 및 지방 계통으로 유도되었습니다. ALP의 활성 증가, 알리자린 적색 염색 하에서 적색 석회암 결절, 골형성 특이적 유전자 Runx2, Alp, Bsp 및 Ocn의 발현 증가는 골형성 유도를 나타냅니다.지방 형성을 확인하기 위해 Oil-red-O 염색을 사용했습니다. 수많은 지질이 풍부한 액포가 유도 9일 후에 분명했습니다. 또한, 지방생성 특이적 유전자 Ppar-gamma-1 및 Cebpa의 발현이 증가하였다.샘플은 연골형성 분화에 대한 현미경 관찰 동안 Alcian blue에 대해 양성 염색을 보여주었습니다. 또한, 항-II형 콜라겐 항체를 이용한 면역염색은 연골 기질의 축적을 강화한 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜에서는 mBMSC의 실행 가능성을 보장하는 것이 매우 중요합니다.이 목적은 적절한 실험 동물을 선택하고, 얼음 위에서 작업하고, 실험 시간을 단축함으로써 달성 할 수 있습니다. 이를 체외 모델을 활용하면 많은 수의 증식성 하악 골밀도를 얻을 수 있으며, 이는 생물학적 특성, 미세 환경에 대한 후속 반응 및 하악 골밀도세포의 기타 응용에 대한 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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