2020년 7월 8일
microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.
이 방법은 소동물 모델을 사용하여 IGA 신병증에서 microRNA의 변화를 쉽게 확인할 수 있어 인간 신장 생검 없이 IGA 신병증을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 IGA 신병증의 유전학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있으며, 이는 잠재적으로 신장 질환에 대한 새로운 진단 및 새로운 치료 방법을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스가 제대로 마취되었는지 확인한 후 수술용 가위와 집게를 사용하여 마우스의 복벽을 3-4cm 정도 절개하고 신장의 양쪽을 확인합니다.
갈비뼈와 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장 색이 옅은 노란색으로 변할 때까지 PBS를 좌심실에 주입하여 마우스의 전신에 PBS가 관류되었음을 나타냅니다. 신동맥, 신정맥, 요관을 절개한 다음 신장을 제거합니다.
실온에서 실리콘 균질화기와 700마이크로리터의 페놀 구아니딘 기반 용해 시약을 사용하여 30mg의 신장 샘플을 균질화합니다. 용해물을 바이오 폴리머 파쇄 스핀 컬럼으로 옮기고 실온에서 15, 000G에서 2분 동안 원심분리합니다. 원고 지침에 따라 RBNA 정제를 계속합니다.
최종 세척 후 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 30마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 8, 000G에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용리합니다. cDNA 합성을 위해 샘플당 총 8마이크로리터의 핵산 혼합물 2마이크로리터, 2마이크로리터의 역전사효소 혼합물 및 4마이크로리터의 완충액으로 마스터 믹스를 준비합니다. 8마이크로리터의 마스터 믹스를 8웰 튜브 스트립의 각 웰에 추가합니다.
nuclease-free water에서 총 RNA를 희석합니다. 그런 다음 총 RNA 용액 12마이크로리터를 스트립의 각 웰에 추가합니다. 샘플을 thermocycler에 넣고 섭씨 37도에서 60분 동안 배양한 다음 섭씨 95도에서 5분 동안 배양합니다.
정량적 Real-Time PCR을 수행하려면 원고 지침에 따라 마스터 믹스를 준비한 다음 96웰 반응 플레이트의 각 웰에 22.5마이크로리터의 마스터 믹스를 추가합니다. 준비된 cDNA 2.5마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. Real-Time PCR 기기에 반응 플레이트를 놓습니다.
그런 다음 섭씨 95도에서 15분 동안 초기 활성화를 위해 프로그래밍한 다음 15초 동안 섭씨 94도에서 변성 40주기, 30초 동안 섭씨 55도에서 어닐링, 30초 동안 섭씨 70도에서 연장을 프로그래밍합니다. 델타-델타 CT 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. 이 프로토콜은 Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 microRNA의 발현 수준을 조사하는 데 사용되었습니다.
3개의 IGA 신병증 관련 microRNA의 발현 수준을 측정했습니다. 두 그룹의 상대적인 microRNA 발현 수준은 P가 0.05 미만인 T-테스트를 사용하여 통계적으로 유의하게 비교되었습니다. miR-155-5p는 대조군에 비해 HIGA 그룹에서 3.3배 더 높은 수준으로 발현되었으며, miR-21-5p는 1.58배 더 높은 수준으로 발현되었습니다.
miR-1461-5p 발현은 두 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. 이 프로토콜을 시도할 때는 마스크, 장갑 및 모자를 착용하고 실험실 테이블과 도구를 깨끗하게 유지하여 환경의 뉴클레아제가 실험에 영향을 미치지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 실험 방법은 현재 우리 실험실에서 실용화되고 있습니다.
IGA 신병증에 대한 새로운 진단 및 치료 방법을 확립하는 것이 목표입니다.
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본 연구는 IgA 신증 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 인간 신장 생검 없이도 IgA 신증에서 microRNA의 관여 여부를 조사할 수 있습니다.
이 프로토콜은 바이오 제약 R&D 팀이 검증된 IgA 신병증 마우스 모델에서 microRNA 발현 프로파일을 분석할 수 있게 하여, 신장 질환 프로그램의 타겟 검증 및 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 인간 생검 없이도 변화된 miRNA 수치를 검출하는 재현 가능한 방법을 제공함으로써, 예측 신뢰도가 향상된 바이오마커 및 치료 타겟의 조기 발견을 촉진합니다. 이 접근 방식은 질병 기전을 조사하고 전임상 개발을 위한 후보 물질의 우선순위를 정하는 발견 단계의 연구 노력과 일치합니다.
이 방법은 초기 발견 연속체(early discovery continuum)에 부합하며, 표적 검증의 가설 테스트를 지원하고 리드 물질 확인 결정을 위한 스크리닝 및 분석 워크플로우에 정량적 출력물을 생성합니다.