Name: 면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 배우세요 면역글로불린 A 신병성 마우스 모델에서 신장 microRNA 발현을 검출하는 방법을. 이 기술은 생체 외 인간 생검 없이 질병 유전학을 연구하고 새로운 진단 및 치료 전략을 개발하는 데 활용됩니다.

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이 원고의 초안을 편집해 주신 Edanz Group(www.edanzediting.com)의 Sarah Williams 박사에게 감사드립니다.

동물 실험은 Jichi Medical University의 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals의 실험 동물 사용 및 관리 지침을 준수합니다.
1. HIGA 마우스에서 신장 샘플 채취
참고: HIGA 마우스는 생후25주 후에 IgA 신병증의 안정적인 표현형을 나타낸다 8,9,10,11. Balb/c 마우스는 대조군 8,9,10,11로 선택해야 합니다. 25주령의 암컷 HIGA 마우스(n=10)와 25주령의 암컷 Balb/c 마우스(n=10)를 얻었다. 실험에 필요한 마우스의 수를 미리 결정할 필요가 있습니다. 이 단계는 10 마리의 HIGA 마우스와 10 마리의 Balb / c 마우스의 샘플 크기에 대해 약 7-8 시간이 필요합니다.
<ol><li>HIGA 마우스(25주령, 암컷), Balb/c 마우스(25주령, 암컷), 흡입 마취 장치, 이소플루란, 코르크 시트, 핀, 인산염 완충 식염수(PBS), 주사 주사기, 바늘, 수술용 가위 및 겸자.</li>
	<li>흡입 마취 장치와 함께 4%-5%의 이소플루란을 사용하여 HIGA 마우스를 마취하고 핀을 사용하여 코르크 시트의 등쪽 위치에 장착합니다. 마취 유도 후 유지 용량으로 이소플루란의 농도를 2%-3%로 조정합니다. 참고: 마취 깊이는 침습적 시술과 관련된 통증이 완전히 제거되는 수준으로 유지됩니다. 특히, 이소플루란 농도는 흉부와 같은 조직을 절제할 때 4-5%로 조정되어야 합니다. 제모와 눈 연고는 필수적이지 않습니다. 절차를 신속하게 수행 할 수있는 경우 가열 패드에 마우스를 장착 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>수술 용 가위와 집게로 마우스 복벽의 정중선을 3-4cm 절개하고 신장의 양쪽을 조심스럽게 확인하십시오.</li>
	<li>수술용 가위와 집게로 갈비뼈와 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장색이 옅은 노란색으로 바뀔 때까지 PBS를 좌심실에 주입합니다(이 절차는 마우스의 전신에 PBS가 관류됨을 의미합니다).</li>
	<li>신장 동맥, 신장 정맥 및 요관을 절단하고 신장을 제거하십시오. 다음 단계에서 사용하기 위해 신장을 30mg 조각으로 나눕니다. 참고: IgA 신병증의 병리학은 주로 신장 피질(신장 바깥 부분)의 사구체를 침범합니다. 피질과 수질을 거시적으로 완전히 구별하는 것은 어렵지만 주로 신장의 바깥 부분을 수집하는 것이 바람직합니다. 이 샘플은 –80°C에서 몇 개월 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 신장 샘플에서 총 RNA 정제
참고: 이 단계에서는 시중에서 판매되는 miRNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 추출합니다. 또한, 바이오폴리머-파쇄 스핀 컬럼이 사용된다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. miRNA 분리 키트에는 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.
<ol><li>1.5 또는 2.0mL 수집 튜브, 100% 에탄올, 클로로포름, 실리콘 균질화기, 마이크로피펫, 피펫 팁, 원심분리기, 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼, 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼, 페놀/구아니딘 기반 용해 시약, 구아니딘/에탄올 세척 완충액(세척 완충액 1), 에탄올 세척 완충액(세척 완충액 2) 및 뉴클레아제가 없는 물.</li>
	<li>실온에서 실리콘 균질화기와 700μL의 페놀/구아니딘 기반 용해 시약을 사용하여 30mg 신장 샘플을 균질화합니다. 참고: 샘플의 miRNA는 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 노출될 때까지 취약하므로 이러한 단계를 즉시 수행해야 합니다.</li>
	<li>용해물을 바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼으로 옮기고 실온에서 2분 동안 15,000 x g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>여과액에 클로로포름 140μL를 넣고 15초 동안 세게 혼합합니다. 2-3분 동안 그대로 둔 다음 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>중간층을 건드리지 않고 맑은 상청액을 새 수집 튜브로 부드럽게 옮기고 결정된 부피(아래 참조)를 100% 에탄올에 추가합니다. 5 초 동안 소용돌이. 참고 : 얻은 상청액 부피의 1.5 배에서 100 % 에탄올이 필요합니다.</li>
	<li>시료(상한 700μL)를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼으로 옮기고 시료를 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>700 μL의 세척 완충액 1을 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 첨가하고 컬럼을 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>세척 완충액 2 500μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 넣고 실온에서 8,000 x g에서 15초 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 여과액을 폐기하십시오.</li>
	<li>실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 다시 원심분리하여 에탄올을 추가로 제거하고, 실온에서 1분 동안 15,000 x g 에서 별도의 에탄올을 제거한다. 원심분리 후 여과액을 버리십시오.</li>
	<li>스핀 컬럼에 부착된 튜브를 새 수집 튜브로 변경합니다.</li>
	<li>뉴클레아제가 없는 물 30μL를 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 추가하고 실온에서 1분 동안 8,000 x g 에서 원심분리합니다. 참고: 생성된 30μL 용액에는 고농도의 총 RNA가 포함되어 있습니다. 이 샘플은 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 전체 RNA에서 cDNA 합성
참고: 이 단계에서는 시판되는 역전사 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물 및 완충액이 포함되어 있습니다. 이 절차는 반응의 진행을 방지하기 위해 얼음 위에서 수행해야 합니다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 3시간이 필요합니다.
<ol><li>다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 8웰 스트립 튜브, 마이크로피펫, 피펫 팁, 분광 광도계, 뉴클레아제가 없는 물, 얼음, 핵산 혼합물, 역전사효소 혼합물, 완충액 및 열 순환기.</li>
	<li>분광 광도계를 사용하여 총 RNA의 농도를 측정합니다. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물의 필요한 부피를 계산하여 12μL에 1μg의 총 RNA가 포함되도록 합니다.</li>
	<li>다음과 같은 내용으로 마스터 믹스를 준비합니다: 2.0 μL의 핵산 혼합물, 2.0 μL의 역전사효소 혼합물 및 4.0 μL의 완충액을 총 8.0 μL로 샘플당 추출합니다.</li>
	<li>8μL의 마스터 믹스를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>3.2에서 계산된 뉴클레아제가 없는 물의 부피로 총 RNA를 희석합니다. 그런 다음 총 RNA 용액 12μL(총 RNA 1μg 포함)를 8웰 스트립 튜브의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>열 순환기를 사용하여 37°C에서 60분 동안 8웰 스트립 튜브에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 열 순환기를 사용하여 95°C에서 5분 동안 배양합니다. 참고: 배양 후 용액에는 고농도의 cDNA가 포함되어 있습니다.</li>
	<li>이 용액을 1.5mL 튜브에 옮기고 뉴클레아제가 없는 물 200μL를 추가합니다. 참고: 생성된 200μL 용액은 qRT-PCR에 주형 cDNA로 사용할 수 있습니다. 이 샘플은 –80°C에서 약 1년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>4. miRNA의 qRT-PCR
참고: 이 단계에서는 시판되는 PCR 키트가 사용됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이 키트에는 PCR 혼합물, 범용 프라이머 및 뉴클레아제가 없는 물이 포함되어 있습니다. 샘플은 이중으로 준비해야하며 각 경우에 결과의 정확성을 고려해야합니다. miRNA의 발현 수준은 ΔΔCT 방법에 의해 정량화된다. 이 단계는 10마리의 HIGA 마우스와 10마리의 대조군 마우스의 샘플 크기에 대해 약 4시간이 필요합니다.
<ol><li>다음 항목을 준비합니다: 1.5mL 수집 튜브, 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, 마이크로피펫, 피펫 팁, PCR 믹스, 범용 프라이머, 뉴클레아제가 없는 물, miRNA 특이적 프라이머 및 Real-Time PCR 기기.</li>
	<li>각 웰에 대해 PCR 믹스 12.5μL, 범용 프라이머 2.5μL, 5μM miRNA 특이적 프라이머 1.25μL, 뉴클레아제가 없는 물 6.25μL의 내용물로 마스터 믹스를 준비합니다. 참고: 이 분석에서는 miRNA[RNA, U6 Small Nuclear 2(RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p]에 특이적인 프라이머를 사용했습니다. RNU6-2는 내인성 대조군14를 사용하였다.</li>
	<li>22.5 μL의 마스터 믹스를 96 웰 반응 플레이트의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>단계 3.7에서 제조된 cDNA 2.5μL를 96웰 플레이트의 개별 웰에 추가합니다.</li>
	<li>96웰 반응 플레이트를 접착 필름으로 덮은 다음 1,000 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>Real-Time PCR 기기를 실행합니다. PCR 기기를 다음과 같이 프로그래밍합니다: 95°C에서 15분 동안 초기 활성화, 94°C에서 15초 동안 40회 변성, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 70°C에서 30초 동안 연장.</li>
	<li>ΔΔCT 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. 상대적 발현 수준은 2–ΔΔCT로 결정됩니다. 참고: 비정상적인 PCR 증폭 곡선은 결과에서 제외하는 것을 고려해야 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgA+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">IgA Nephropathy.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).</li>
<li>Szeto, C. C., Li, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in IgA nephropathy.</a> Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).</li>
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<li>Vishnoi, A., Rani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA+Biogenesis+and+Regulation+of+Diseases%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview.</a> Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).</li>
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<li>Serino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+a+retrospective+international+study%2C+circulating+miR-148b+and+let-7b+were+found+to+be+serum+markers+for+detecting+primary+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy.</a> Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).</li>
<li>Muso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+glomerular+extracellular+matrix+in+a+new+mouse+strain+of+high+serum+IgA+ddY+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice.</a> Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).</li>
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<li>Hyun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+improve+renal+function+in+a+mouse+model+of+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy.</a> Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).</li>
<li>Katsuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+a+mouse+model+of+immunoglobulin+A+nephropathy+reveals+an+enhanced+PDGF-EDG5+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pharmacogenomics+Journal%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade.</a> The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).</li>
<li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li>
<li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+%28miRQC%29+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li>
<li>Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence+based+strategy+for+normalization+of+quantitative+PCR+data+from+miRNA+expression+analysis+in+forensic+organ+tissue+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification.</a> Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+miR-146a+and+miR-155+in+kidney+biopsy+and+urine+from+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Markers%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy.</a> Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).</li>
<li>Hennino, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-21-5p+renal+expression+is+associated+with+fibrosis+and+renal+survival+in+patients+with+IgA+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy.</a> Scientific Reports. 6, 27209(2016).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+Win+the+Battle+with+RNase%22">How to Win the Battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

우리는 이 새로운 방법을 사용하여 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있었습니다. IgA 신병증은 원인 및 치료 목표를 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요한 설명할 수 없는 질병이다 1,3. 그러나 인간 신장 샘플을 얻는 것은 매우 침습적입니다. 이 새로운 기술은 작은 동물을 이용한 IgA 신병증의 연구를 가능하게 하고 IgA 신병증 및 miRNA에 대한 향후 연구를 용이하게 할 것이라는 점에서 유리합니다. 향후 연구에서 이 방법은 IgA 신병증 치료를 위한 새로운 miRNA 연구에 적용될 수 있습니다. HIGA 마우스에서 miRNA의 인공 조절은 IgA 신병증의 표현형에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 경우 이 방법은 miRNA의 변화를 확인하는 데 유용할 수 있습니다. 이 방법은 혈청 내 miRNA를 분석하기 위한 것이 아니지만 프로토콜을 수정하여 이를 위해 사용할 수...

면역글로불린 A(IgA) 신병증은 신장 사구체 간질 영역 1,2에 IgA가 비정상적으로 침착되는 것을 특징으로 하는 원발성 사구체신염의 일종입니다. 원발성 사구체신염 중 가장 흔하며 환자의 20%-40%에서 말기 신부전을 유발한다2. 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 지속적인 점막 감염이 연루되어 있다 1,3. 코르티코스테로이드, 면역억제제 및 레닌-안지오텐신계 억제제가 치료 방법으로 제안되었으나 1,3 완전히 확립되지는 않았다 3. 따라서 IgA 신증 치료의 병인 및 치료 방법을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
microRNA(miRNA)는 유전자 발현을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 작은 비암호화 RNA입니다 4,5. miRNA는 다양한 질병의 발병기전에 관여하는 것으로 보고되어 있으며, 일부는 질병 바이오마커 및 치료제로 확인되고 있다 4,5. 최근에, miRNA와 IgA 신병증의 발병기전 사이의 연관성이 또한 보고되었다 2,6,7. 예를 들어, miR-148b는 IgA 신병증환자에서 IgA의 구조적 이상에 관여하는 것으로 나타났으며, miR-148b 및 let-7b는 IgA 신병증을 검출하기 위한 새로운 바이오마커로 기록되었다7. IgA 신병증에 대한 miRNA의 효과를 이해하면 병인과 치료법을 더 명확히 하는 데 도움이 될 수 있지만2, 소동물 모델을 사용하여 IgA 신증에서 miRNA를 프로파일링하는 표준 방법은 아직 확립되지 않았습니다2.
본 발명자들은 본원에서 IgA 신병증 마우스 모델 (HIGA 마우스)의 신장에서 miRNA 발현 수준을 측정하기 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하였다. 상기 HIGA 마우스는 특히 높은 수준의 혈청 IgA 및 신장 사구체에 IgA의 비정상적인 침착을 나타내는 특징적인 ddY 균주이다 8,9,10,11. 따라서, HIGA 마우스는 IgA 신증마우스 모델로 8,9,10,11을 사용할 수 있다. 우리의 방법은 네 가지 주요 단계로 구성됩니다 : 첫째, HIGA 마우스에서 외과 적으로 신장 샘플을 채취합니다. 둘째, 실리카 멤브레인 기반의 스핀 컬럼을 이용하여 시료를 균질화하고 전체 RNA를 정제하는 단계; 셋째, 역전사를 사용하여 전체 RNA로부터 상보적 DNA(cDNA)를 합성하는 단계; 넷째, 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(qRT-PCR)을 통해 miRNA의 발현 수준을 검출하는 것이다. 이 방법의 이론적 근거와 결과의 신뢰성은 이전 보고서12,13을 기반으로합니다. 우리는 이것이 IgA 신병증 마우스 모델에서 miRNA 발현 수준을 정확하게 측정하는 데 유용한 기술이며 IgA 신병증에서 miRNA에 대한 향후 연구를 촉진하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>BALB/cCrSlc (25주령, 여)</td><td>일본 SLC, Inc.</td><td>none</td><td>제어용 마우스</td></tr><tr><td>HIGA/NscSlc (25주령, 여성)</td><td>Japan SLC, Inc.</td><td>없음</td><td>IgA 신병증 마우스 모델</td></tr><tr><td>qRT-PCR용 MicroAmp Optical 96웰 반응 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96웰 반응 플레이트</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>96웰 반응판용 접착 필름</td></tr><tr><td>miScript II RT 키트</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>cDNA 합성을 위한 실험 키트</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>총 RNA 추출을 위한 실험용 키트</td></tr><tr><td>miScript 프라이머 어세이(RNU6-2)</td><td>Qiagen</td><td></td><td>MS00033740 miRNA 특이적 프라이머</td></tr><tr><td>miScript 프라이머 어세이(miR-155-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001701</td><td>miRNA 특이적 프라이머</td></tr><tr><td>miScript 프라이머 어세이(miR-146a-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>miRNA 특이적 프라이머</td></tr><tr><td>miScript 프라이머 어세이 (미르-21-5p)</td><td>Qiagen</td><td>MS00009079</td><td>miRNA 특이적 프라이머</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Real-Time PCR용 실험용 키트,</td></tr><tr><td>QIA 파쇄기</td><td>, Qiagen</td><td>79654</td>, <td>바이오폴리머 파쇄 스핀 컬럼</td></tr>, <tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR 시스템</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR 기기</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex 소프트웨어 버전 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>real-time PCR 기기 소프트웨어</td></tr><tr><td>takara biomasher 표준</td><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>실리콘 균질화 장치</td></tr></tbody></table>

면역글로불린 a 신병성 마우스의 신장에서 microrna 발현 검출

Detection of MicroRNA Expression in the Kidneys of Immunoglobulin A Nephropathic Mice

면역 글로불린 A (IgA) 신 병증은 IgA의 비정상적인 침착을 특징으로하는 원발성 사구체 신염의 일종으로 말기 신부전을 유발합니다. 최근에, IgA 신병증의 발병기전에서 microRNA(miRNAs)의 관여가 보고되었다. 그러나 작은 동물 모델을 사용하여 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 확립된 방법은 없습니다. 따라서 IgA 마우스 모델(HIGA mouse)의 신장에서 miRNA를 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜의 목표는 대조군 마우스의 신장 수준과 비교할 때 HIGA 마우스의 신장에서 miRNA의 변경된 발현 수준을 감지하는 것입니다. 간단히 말해서, 이 방법은 4개의 단계로 구성된다: 1) HIGA 마우스로부터 신장 샘플을 얻고; 2) 신장 샘플로부터 총 RNA를 정제하는 단계; 3) 전체 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하는 단계; 및 4) miRNA의 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR). 이 방법을 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 여러 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p 및 miR-21-5p)의 발현 수준을 성공적으로 검출했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에서 miRNA를 프로파일링하는 다른 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 HIGA 마우스(n=10)의 신장에서 miRNA의 발현 수준을 조사했습니다. 이 결과는 설명된 프로토콜에 따라 완전히 얻어졌습니다. Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 선택했습니다(n=10). 두 그룹 모두에서 25주령을 선택했습니다. 암컷 HIGA 마우스만 공급업체에서 구입할 수 있었습니다. 3개의 miRNA(miR-155-5p, miR-146a-5p, 및 miR-21-5p; 그림 1) IgA 신병증과 관련이 있는 것으로 이전에 보고된15,16이 검출되었다. 두 그룹의 상대적 miRNA 발현 수준은 t-test를 사용하여 비교되었으며, P &lt; 0.05가 통계적으로 유의했습니다. miR-155-5p는 대조군에 비해 HIGA군에서 3.3배 높은 수준으로 발현되었으며(P&lt; 0.001), miR-21-5p는 HIGA군에서 1.58배 높은 수준으로 발현되었다...

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

Immunoglobulin A (IgA) nephropathy is a type of primary glomerulonephritis characterized by the abnormal deposition of IgA, leading to the end-stage renal ...

이 방법은 소동물 모델을 사용하여 IGA 신병증에서 microRNA의 변화를 쉽게 확인할 수 있어 인간 신장 생검 없이 IGA 신병증을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 IGA 신병증의 유전학에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있으며, 이는 잠재적으로 신장 질환에 대한 새로운 진단 및 새로운 치료 방법을 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마우스가 제대로 마취되었는지 확인한 후 수술용 가위와 집게를 사용하여 마우스의 복벽을 3-4cm 정도 절개하고 신장의 양쪽을 확인합니다.갈비뼈와 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다. 우심방을 절개한 후 신장 색이 옅은 노란색으로 변할 때까지 PBS를 좌심실에 주입하여 마우스의 전신에 PBS가 관류되었음을 나타냅니다. 신동맥, 신정맥, 요관을 절개한 다음 신장을 제거합니다.실온에서 실리콘 균질화기와 700마이크로리터의 페놀 구아니딘 기반 용해 시약을 사용하여 30mg의 신장 샘플을 균질화합니다. 용해물을 바이오 폴리머 파쇄 스핀 컬럼으로 옮기고 실온에서 15, 000G에서 2분 동안 원심분리합니다. 원고 지침에 따라 RBNA 정제를 계속합니다.최종 세척 후 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에 30마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 추가하고 8, 000G에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용리합니다. cDNA 합성을 위해 샘플당 총 8마이크로리터의 핵산 혼합물 2마이크로리터, 2마이크로리터의 역전사효소 혼합물 및 4마이크로리터의 완충액으로 마스터 믹스를 준비합니다. 8마이크로리터의 마스터 믹스를 8웰 튜브 스트립의 각 웰에 추가합니다.nuclease-free water에서 총 RNA를 희석합니다. 그런 다음 총 RNA 용액 12마이크로리터를 스트립의 각 웰에 추가합니다. 샘플을 thermocycler에 넣고 섭씨 37도에서 60분 동안 배양한 다음 섭씨 95도에서 5분 동안 배양합니다.정량적 Real-Time PCR을 수행하려면 원고 지침에 따라 마스터 믹스를 준비한 다음 96웰 반응 플레이트의 각 웰에 22.5마이크로리터의 마스터 믹스를 추가합니다. 준비된 cDNA 2.5마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. Real-Time PCR 기기에 반응 플레이트를 놓습니다.그런 다음 섭씨 95도에서 15분 동안 초기 활성화를 위해 프로그래밍한 다음 15초 동안 섭씨 94도에서 변성 40주기, 30초 동안 섭씨 55도에서 어닐링, 30초 동안 섭씨 70도에서 연장을 프로그래밍합니다. 델타-델타 CT 방법을 사용하여 유전자 발현을 정량화합니다. 이 프로토콜은 Balb/c 마우스의 신장을 대조군으로 사용하여 HIGA 마우스의 신장에서 microRNA의 발현 수준을 조사하는 데 사용되었습니다.3개의 IGA 신병증 관련 microRNA의 발현 수준을 측정했습니다. 두 그룹의 상대적인 microRNA 발현 수준은 P가 0.05 미만인 T-테스트를 사용하여 통계적으로 유의하게 비교되었습니다. miR-155-5p는 대조군에 비해 HIGA 그룹에서 3.3배 더 높은 수준으로 발현되었으며, miR-21-5p는 1.58배 더 높은 수준으로 발현되었습니다.miR-1461-5p 발현은 두 그룹 간에 유의한 차이가 없었다. 이 프로토콜을 시도할 때는 마스크, 장갑 및 모자를 착용하고 실험실 테이블과 도구를 깨끗하게 유지하여 환경의 뉴클레아제가 실험에 영향을 미치지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 실험 방법은 현재 우리 실험실에서 실용화되고 있습니다.IGA 신병증에 대한 새로운 진단 및 치료 방법을 확립하는 것이 목표입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

이 논문은 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 허혈성 신장 손상 마우스 모델과 microRNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.

허혈성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 MicroRNA에 대한 정량적 검출 방법

우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

우리는 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 연령 의존적 신장 손상이있는 마우스의 신장 및 혈청에서 microRNA 발현을 평가하는 방법을 제시합니다.

연령 의존적 신장 장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 MicroRNA 발현의 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 평가

여기에서 우리는 여러 신장 질환 마우스 모델에서 비바이러스 벡터 및 폴리에틸렌이민 나노입자의 꼬리 정맥 주입을 통해 외인성 인공 합성 miRNA 모방체를 신장에 전달합니다. 이로 인해 신장에서 표적 miRNA가 크게 과발현되어 여러 마우스 모델에서 신장 질환의 진행이 억제되었습니다.

여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

본 프로토콜은 마우스에서 루푸스 진행을 추적하는 방법을 기술한다. 세포 침윤과 신장에서의 단백질 침착을 기반으로 루푸스 신염을 특성화하기위한 두 가지 추가 절차가 제시됩니다.

단백뇨, 백혈구의 신장 침윤 및 루푸스가 발생하기 쉬운 MRL / lpr 마우스에서 단백질의 신장 침착 분석

본 연구는 면역글로불린 A신증(IgAN)을 Dioscoreae Nipponicae Rhizoma(DNR)의 활성성분인 디오신(DIO)으로 치료하기 위한 실험 데이터와 in vivo 및 in vitro에서 한약의 효과 및 기저 기전을 연구하기 위한 패러다임을 제공합니다.

Dioscin In Vivo에서 B 세포 활성화를 억제하고 In vitro에서 갈락토오스 결핍 IgA1 생산을 감소시켜 IgA 신병증 완화를 중재했습니다.

이 프로토콜은 폐쇄성 신병증에서 조직 섬유증의 진행을 연구하기 위해 마우스에서 편측 요관 폐쇄(UUO)를 유도하는 방법을 설명합니다. 여기에는 수술 절차, 수술 후 관리 및 섬유증 평가 방법이 포함됩니다.

신장 간질성 섬유증(Kidney Interstitial Fibrosis) 조사를 위한 일측성 요관 폐쇄 모델(Unilateral Ureteral Obstruction Model for Investigating Kidney Interstitial Fibrosis)

배우세요 면역글로불린 A 신병성 마우스 모델에서 신장 microRNA 발현을 검출하는 방법을. 이 기술은 생체 외 인간 생검 없이 질병 유전학을 연구하고 새로운 진단 및 치료 전략을 개발하는 데 활용됩니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

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