오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

3D 오가노이드 배양은 이 프로토콜을 사용하여 개발된 원위 폐 상피에서 근위부에 있습니다. 폐 조직 유지 또는 질병 관련 리모델링의 기본 메커니즘을 연구하기 위한 다루기 쉬운 모델을 제공하고 약물 발견 및 검증을 위한 효과적인 플랫폼을 제공합니다. 이 프로토콜은 다른 조직 해리 세포 분획 접근법과 호환됩니다.

또한 상피 전구 세포는 서로 다른 해부학적 구획에서 분리되어 체외에서 위치 정체성을 유지하기 때문에 외인성 또는 내인성 자극에 대한 폐 반응의 지역적 차이를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 레벨 기술은 기원 영역을 대표하는 전문적인 분화된 자손을 생성하기 위해 배양할 수 있는 지역 특이적 전구 세포를 포함하여 상피 세포의 다양한 하위 집단을 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 폐 조직을 받으면 직경 2mm 이하의 작은 기도를 포함하는 원위 폐 상피와 주변 실질 조직에서 근위 기관과 기관지를 분리합니다.

샘플을 150 x 15mm 페트리 접시에 개별 멸균 접시에 넣고 원위 조직 샘플을 약 1cm 입방체 조각으로 깍둑썰기합니다. 조각을 깨끗한 50mm 튜브에 넣고 세척할 때마다 신선하고 식힌 HBSS로 티슈를 세 번 씻습니다. 마지막 세척 후 티슈를 새 페트리 접시에 옮기고 멸균 보푸라기 방지 물티슈로 조각을 닦아내십시오.

그런 다음 집게와 가위를 사용하여 가능한 한 많은 내장 흉막을 제거한 후 조직을 약 2mm 직경의 조각으로 다지십시오. 조직 절편 분해를 위해 50밀리리터 원추형 튜브에 25밀리리터의 멸균 HBSS에 리베라아제 밀리리터당 50마이크로그램과 DNA 밀리리터당 25마이크로그램을 첨가합니다. 그리고 다진 조직을 약 2-3g을 튜브에 추가합니다.

그런 다음 조직을 섭씨 37도에 놓고 40-60분 동안 분당 900회전으로 계속 흔듭니다. 30분 후 10ml 주사기를 사용하여 소화된 조직을 분쇄하여 덩어리 형성을 방지합니다. 배양이 끝나면 16게이지 바늘이 장착된 10ml 주사기를 사용하여 조직을 5번 분쇄합니다.

그런 다음 넓은 구경의 피펫을 사용하여 표시된 대로 진공 압력 하에서 일련의 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 통과시킵니다. 마지막 스트레이너를 HBSS plus 20ml로 세척하여 남은 세포를 수집한 후 여과액을 원심분리하여 분리된 세포를 수집합니다. 상등액을 버린 후, 1분 동안 얼음을 익힌 세포를 배양하기 전에 부드러운 피펫팅으로 펠릿에 적혈구 용해 완충액 1ml를 추가합니다.

배양이 끝나면 10-20ml의 HBSS와 완충액을 첨가하여 용해를 중화하고 원심분리로 나머지 세포를 수집합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 단클론 항인간 CD31 및 CD45 항체와 LS 컬럼에 접합된 CD31 및 CD45 마이크로비드를 사용하여 전체 세포 풀에서 CD31 양성 내피 세포와 CD45 양성 면역 세포를 고갈시킵니다. FACS를 위한 세포 표면 염색의 경우, 필요한 농도에서 적절한 1차 관심 항체를 추가하고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 30분 동안 세포를 배양합니다.

배양이 끝나면 HBSS plus 3ml로 세포를 세척하고 적절한 농도의 형광단 접합 2차 항체로 세포를 라벨링하여 얼음에서 30분 동안 적절하게 배양합니다. 배양이 끝나면 3ml의 HBSS plus로 세포를 세척하고 HBSS plus 농도의 1배에서 10배에서 7번째 세포로 세포를 재현탁시킨 후 스트레이너 캡을 통해 세포를 5ml 폴리스티렌 튜브로 여과하여 단일 세포 현탁액이 형성되도록 합니다. 그런 다음 DAPI 밀리리터당 1마이크로그램을 첨가하여 투과성 세포를 염색합니다.

근위 조직 상피 전구 세포 농축을 위해 폐에서 근위 기도를 절개하고 가위를 사용하여 길이를 따라 기도를 열어 내강을 노출시킵니다. 믹서에서 계속 흔들면서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하기 위해 liberase 1밀리리터당 50마이크로그램으로 조직을 덮습니다. 배양이 끝나면 조직을 150 x 15mm 크기의 멸균 접시에 옮기고 메스를 사용하여 기도 표면을 부드럽게 긁어 조직에서 내강 상피 세포를 완전히 제거합니다.

다음으로, 5ml의 멸균 HBSS 플러스 버퍼로 접시를 세척하여 제거된 모든 내강 상피 세포를 수집하고 세포를 50ml 원추형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10ml 피펫을 사용하여 현탁액을 5회 연속적으로 분쇄하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 그런 다음 원심 분리로 현탁액을 수집합니다.

그런 다음 펠릿을 얼음 위의 신선한 HBSS와 완충액에 다시 현탁시킵니다. 가위를 사용하여 고리를 따라 남아 있는 기관지 조직을 잘라 작은 조직 스트립을 생성합니다. 새 접시에서 단면 면도날을 사용하여 스트립을 더 작은 조각으로 다지고 조직 조각을 튜브당 2ml의 리브라아제가 들어 있는 C 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 gentleMACS 자동 해리기에서 인간 폐 프로토콜 2를 사용하여 조직을 기계적으로 더 멀리 해리합니다. 해리가 끝나면 약 2g의 다진 근위 조직을 liberase 1ml당 50마이크로그램과 DNA 용액 1밀리리터당 25마이크로그램을 포함하는 50ml 원뿔형 튜브로 이동합니다. 섭씨 37도에서 45분 동안 진탕과 함께 배양한 후 폐 원위 조직에 대해 입증된 바와 같이 일련의 스트레이너를 통해 조직 슬러리를 여과하고 여과액에 동일한 부피의 HBSS와 완충액을 추가하여 소화를 중단합니다.

분리된 내강 근위 기도 세포를 튜브에 추가하고 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 그런 다음 마이크로비드 분리를 통해 세포를 농축하고 원위 폐 조직 세포에 대해 입증된 바와 같이 관심 있는 세포 표면 마커를 위해 염색할 수 있습니다. 유사 성층 상피(pseudo stratified epithelium)가 늘어선 근위기도(proximal airways)에는 막 단백질 NGFR에 대해 면역 반응성이 있는 풍부한 기저 전구 세포가 포함되어 있습니다.

대조적으로, 폐포 내벽의 상피 세포는 폐포 II형 세포 정체성을 암시하는 HTII-280 단클론 항체와 함께 정점 막 면역 반응을 보이는 하위 집합을 포함합니다. 오염된 적혈구, 면역 및 내피 세포의 자기 비드 고갈은 원위 및 근위 조직 샘플 모두에서 상피 세포 집단을 크게 농축하고 그에 따라 FACS 효율을 증가시킵니다. 추가적인 FACS 고갈은 NGFR 또는 HTII-280 표면 염색을 기반으로 추가로 분획할 수 있는 고도로 농축된 원위 세포 집단으로 이어집니다.

HTII-280 양성 원위 폐 상피 세포 배양은 평균 콜로니 형성 효율이 10%인 빠르게 확장되는 오가노이드를 생성하며, 30일차 배양의 면역형광 염색은 오가노이드를 포함하는 내강이 주로 HTII-280 및 SPC 양성 원위 폐 상피 세포로 구성되어 있음을 보여줍니다. NGFR 양성 세포에서 배양된 근위 폐 상피 오가노이드는 배양 30일째에 평균 콜로니 형성 효율 7.8%로 오가노이드를 포함하는 내강을 형성하며, 효소 조직 결합의 경험적 최적화는 표면 에피토프의 보존에 매우 중요하며, 면역형광 염색 및 생존 가능한 상피 세포 subset의 농축을 가능하게 하여 다음 지역 특이적 조직 배양을 위한 배양이 가능합니다. 이 방법은 면역, 혈관, 기질 및 상피 세포 하위 집합의 식별 및 농축과 3D 오가노이드 칩 플랫폼을 사용하는 공동 배양 모델의 개발에 적용할 수 있습니다.

우리는 최근 이 기술을 사용하여 생성된 폐포 오가노이드를 인간 폐 상피의 SARS-CoV-2 감염을 연구하고 COVID-19 약물 검증을 위한 플랫폼으로 사용하는 것에 대해 설명했습니다.