CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

이 프로토콜은 금속 표면에 치료 펩티드를 추가하는 새로운 화학 전략을 포함하고, 금속 생체 재료의 넓은 범위의 생체 적합성을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고있다. 이것은 생체 임플란트의 맨금속 표면에 펩티드와 치료 단백질을 부수는 보편적이고 강력한 기술입니다. 우리는 스텐팅에 의해 유발되는 염증 반응을 방지하기 위해 CD47 펩티드를 부속시킴으로써 금속 스텐트의 생체 적합성을 개선하기 위해이 기술을 사용했습니다.

스테인레스 스틸 호일 쿠폰 이나 메쉬 디스크를 셰이커에 2-이소프로판올을 5 분 동안 세척하. 이 세척을 두 번 수행한 다음 세척당 10 분 동안 클로로포름으로 샘플을 두 번 씻으시다. 정화된 스테인리스 스틸 샘플을 섭씨 220도에서 30분간 오븐에 놓습니다.

구운 호일 이나 메쉬 디스크를 PABT의 0.5% 수성 용액으로 담그고 1시간 동안 셰이커에 인큐베이션합니다. 폐기된 증류수로 PABT 변형 샘플을 5회 세척합니다. 시편을 새로운 바이알로 옮기고 세근을 반복합니다.

셰이커의 실온에서 샘플을 TCEP로 15분 동안 처리합니다. 디가스 는 리오필라이저와 같은 진공 생성 장치로 둥근 바닥 플라스크에서 증류수를 분해하고, 호일 또는 메쉬 디스크를 탈가스물로 5회 세척한다. 샘플을 새 바이알로 옮기고 세서스를 반복합니다.

주식 PEI-PDT의 212.5 마이크로리터와 125 마이크로리터의 0.4 마이크로리터를 탈가스 수역에서 아세테이트1%의 PEI-PDT 용액 5밀리리터를 준비한다. 세척된 스테인리스 스틸 시편을 1%PEI-PDT로 배양합니다. 공기를 아르곤 가스로 교체하고, 유리병을 밀폐밀봉하고, 셰이커에 1시간 동안 섞습니다.

펩타이드 컨쥬게이션으로 즉시 진행하거나 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 샘플을 저장하십시오. 밀리리터 인간 펩타이드 CD47 스톡 용액을 탈가시 50% 아세트산으로 용해한 다음, 500마이크로리터를 탈가스 PBS4.5 밀리리터로 용해시켜 작업 용액을 준비한다. 세척된 PEI-PDT 코팅 시료를 실온에서 펩타이드 CD47의 작동 용액과 함께 1시간 동안 흔들어 줍니다.

완료되면 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 펩타이드 CD47 코팅 샘플을 세척한다. 펩타이드 CD47 또는 스크램블 펩타이드로 금속 호일을 코팅한 후, 분기 인치 PVC 튜브를 38센티미터 길이의 3개로 자르고 수정되지 않은 스크램블 펩타이드 또는 펩타이드 CD47 수정 금속 호일을 3개의 다른 튜브에 삽입합니다. 어떤 항 혈소판 약물무료 건강한 인간 기증자로부터 혈액의 30 밀리리터를 수집, 수집 된 혈액의 응고를 방지하기 위해 4 %의 나트륨 구연산나트륨의 한 밀리리터와 주사기를 미리로드.

10 밀리리터 주사기를 사용하여 각 튜브에 10 밀리리터의 혈액을 넣고 끝을 금속 어댑터와 연결합니다. Chandler 루프 장치의 바퀴에 피가 가득한 튜브를 놓고 4 시간 동안 섭씨 37도에서 바퀴 회전으로 금속 호일을 따라 혈액을 전달합니다. 튜브에서 혈액을 배출하고 IRB 요구 사항에 따라 폐기 한 다음 메스로 튜브를 잘라 포일을 회수합니다.

염화 나트륨 0.1과 나트륨 cacodylate 버퍼에 70% 용액을 희석하여 2% 글루타랄데히드 용액을 준비합니다. 2% 글루타랄데히드 용액을 15분 동안 배양하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 금속 호일을 분석하기 전에 PBS로 세 번 씻으시기를 바하십시오.

섭씨 37도의 수조에서 PBS8 밀리리터를 따뜻하게 합니다. 10 밀리머 CFDA 염료 재고 용액을 하나의 CFDA 바이알에 90 마이크로리터를 추가하여 10 밀리미터 CFDA 염료 스톡 솔루션을 준비한 다음, 따뜻한 PBS에 주식 CFDA의 75 마이크로리터를 추가하여 작업 용액을 준비합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 알루미늄 호일로 혼합하고 덮습니다.

각 호일을 CFDA 염료 1밀리리터에 24웰 플레이트에 넣습니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 접시를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 PBS에서 포일을 세 번 씻은 다음 형광 현미경으로 이미지를 만듭니다. 공자된 TAMRA 공주 펩타이드 CD47의 농도는 금속 표면상에 펩타이드의 최대 고정 밀도를 결정하기 위해 정량화되었다.

최대 펩티드 보존은 밀리리터당 100 마이크로그램의 입력 농도로 달성된 약 180 나노그램의 센티미터 제곱이었습니다. 변형된 금속 표면에 TAMRA 컨쥬게이드 펩타이드 CD47의 고정은 형광 현미경 검사법에 의해 더욱 확증되었고, 이는 TAMRA 컨쥬게이트 펩타이드 CD47 처리 메쉬 디스크의 표면에서 방출되는 균일한 형광을 보였다. 변형이 부족한 제어 매시 표면에서 최소한의 형광만 검출되어, 비특이적으로 결합된 TAMRA 공주 펩티드 CD47을 형광의 주요 원천으로 배제한다.

또한 펩타이드 CD47 코팅 표면이 스크램블 수정 및 수정되지 않은 펩티드 컨트롤에 비해 혈액 매개 세포 부착의 급격한 감소를 보이는 것으로 확인되었다. 쥐 버피 코트 세포로부터 분리된 단핵구는 베어 메탈및 펩타이드 CD47 변형 스테인리스 스틸 호일에 배양되었다. 급성 단세포 부착의 58% 감쇠, 대식세포로의 변환 및 대식세포 증식은 기능화된 표면에서 관찰되었다.

이 프로토콜을 시도하는 동안, 가능한 한 빨리 수행될 탈가스 물 또는 시약을 포함하는 단계를 수행하고 산소에 대한 노출을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 당사의 기술은 금속 표면과의 세포 상호 작용을 선택적으로 조절하고 RT-PCR, 유동 세포측정 및 면역 형광과 같은 전형적인 세포 유형 식별 분석법은 이 기술과 호환됩니다. 다양한 생체 활성 펩티드를 위해 개발될 때, 이 기술은 조직 재료 인터페이스에서 생체 적합성을 증가시켜 기악할 수 있다.