Name: CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 배우세요 금속 스텐트 표면에 CD47 펩타이드를 고정화하여 혈액 세포 부착과 염증 반응을 감소시키는 생체재료 공학 기법을. 이 방법은 다양한 금속 생체재료의 생체적합성을 향상시킬 수 있습니다.

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이 논문에 제시된 프로토콜 개발 및 연구는 IF및 SJS에 NIH (NBIB) R01 자금 조달 (# EB023921) 및 NIH (NHLBI) R01 자금 조달 (# HL137762)에 의해 IF 및 RJL에 지원되었다.

이 실험을 위한 모든 인간 적인 견본은 필라델피아의 아동 병원의 IRB에 따라 얻어졌습니다. 모든 동물 실험은 필라델피아 아동 병원의 IACUC의 승인에 따라 수행되었습니다.
1. PEI-PDT로 베어 메탈 표면 코팅
<ol><li>스테인레스 스틸 호일 쿠폰(1cm x 1cm 또는 0.65cm x 1cm) 또는 스테인레스 스틸 메쉬 디스크를 셰이커(60°C, 200rpm)에 2-이소프로판올로 5분 간 세척합니다. 이 단계를 2배 수행합니다. 그런 다음 클로로폼 (60 °C, 속도 200 rpm)으로 2 x를 각각 10 분 동안 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>정화된 스테인리스 스틸 샘플을 오븐에 220°C에서 30분 간 놓습니다.</li>
	<li>200rpm에서 쉐이커로 5mL에 5mL의 DDW및 인큐베이트에서 25 mg의 폴리에라민 비스포스포네이트를 잠복하고 중탄산칼보네이트(KHCO3)5mg을 5mL에 100rpm에 72°C로 내립니다. 참고 : PABT 합성은 이전에 출판 된 문학18을참조하십시오.</li>
	<li>구운 호일 또는 메쉬 디스크를 PABT의 0.5% 수성 용액으로 담그고 셰이커(72°C, 200rpm 의 속도)에서 1h로 배양합니다.</li>
	<li>PABT 변형 샘플을 5배 동안 탈이온 증류수(DDW)로 세척하고, 시편을 새로운 바이알로 옮기고 DDW로 5배 이상 세척합니다.</li>
	<li>총 5mL의 TCEP 용액(12 mg/mL)을 0.1M 아세트완(0.57mL, 820 mg의 나트륨 아세트산)으로 5mL에 60 mg의 트리스(2-carboxyethyl) 인산염염(TCEP)을 용해하여 총 5mL의 TCEP 용액(12 mg/mL)을 준비한다.</li>
	<li>파BT 변형 샘플을 TCEP로 셰이커의 실온(RT)에서 15분 동안 처리합니다. 참고: TCEP는 티올 그룹을 보호 해제하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>리오필라이저와 같은 진공 생성 장치를 이용하여 둥근 바닥 플라스크에서 드가 DDW를 분해한 DDW로 TCEP 처리호일 또는 메쉬 디스크를 5배 로 세척하였다. 새로운 바이알에서 샘플을 옮기고 탈가드 DDW로 5배를 추가로 세척합니다. 참고: 대기 산소에 의한 금속 표면에서 티올의 산화를 방지하기 위해 빠르게 작업하는 것이 가장 중요합니다.</li>
	<li>주식 PEI-PDT의 212.5 μL과 125 μL의 0.4M 나트륨 아세테이트를 탈가스 DDW에서 희석하여 PEI-PDT 용액 1%의 5mL를 준비합니다. 1.8단계와 동시에 1.9단계를 수행하여 대기 공기에 대한 시료의 노출을 최소화합니다. 참고 : PEI-PDT의 합성은 이전에 출판 된 문학18에설명되어 있습니다.</li>
	<li>세척된 스테인리스 스틸 표본을 PEI-PDT 1%로 배양합니다. 공기를 아르곤 가스로 교체하고, 바이알을 밀착밀봉하고, RT의 셰이커에 1시간 동안 섞어줍니다. 펩티드 컨쥬게이션으로 즉시 진행하거나 최대 1주일까지 4°C에 보관하십시오.</li>
</ol>2. 형광 현미경 및 형광법을 사용하여 금속 표면에 형광 공수 공액 펩CD47 보존의 부착 및 정성적 / 정량적 평가
<ol><li>섹션 1에 설명된 대로 제조된 호일 쿠폰 또는 메쉬 디스크를 세척하고, DDW 5x로 위의 1.1-1.10 단계. 샘플을 새로운 바이알로 옮기고 DDW로 세척하여 5배 추가로 세척합니다. 드디어 탈가스 에탄올로 2배, 탈가스 디메틸 포르마미드(DMF)로 2배 세척합니다.</li>
	<li>탈가시 디메틸포르마미드(DMF)에서 탐라-컨쥬게이드 펩CD47 분말을 1 mg/mL의 최종 농도로 용해시켜 테트라메틸lrhodamine(TAMRA)-cojugated 펩CD47 스톡 용액을 준비한다. 1 mL 할당에 주식 솔루션을 알리 쿼트. -20°C에서 아르곤 분위기 하에서 잘 밀봉된 튜브에 보관하십시오.</li>
	<li>탈가스 dMF를 사용하여 TAMRA-컨쥬게이드 펩CD47의 주식 용액의 1 mg/mL을 희석하여 다음과 같은 플루오로포어 공주 펩CD47-10, 30, 100 및 200 μg/mL의 농도를 준비한다. 참고: TAMRA-컨쥬게이트 펩CD47이 침전된 것으로 나타나면, TCEP 구슬을 사용하여 20분 동안 RT에서 1:1의 비율로 타마-컨쥬게이트 펩CD47 용액을 감소시십시오. TCEP 구슬에 TAMRA-컨쥬게이트 펩CD47을 추가하기 전에 TCEP 비드 용액을 회전시키고, 수퍼나티를 제거한 다음 TAMRA-컨쥬게이트 펩CD47의 추가를 진행한다.</li>
	<li>PEI-PDT 수정 호일 쿠폰을 10, 30, 100 또는 200 μg/mL의 TAMRA-컨쥬게이드 펩CD47을 1시간 동안 RT의 셰이커에서 트리클리카에 배양한다. PEI-PDT 수정 메쉬 디스크뿐만 아니라 메쉬 디스크는 1시간 동안 셰이커에서 ARgon 대기하에서 RT에서 100 μg/mL의 TAMRA-접주 펩CD47을 통해 1.2단계(베어 메탈 컨트롤)를 넘어서 수정되지 않습니다. 참고: 이 단계에서 바이알은 알루미늄 호일로 감싸서 내용물으로부터 보호합니다.</li>
	<li>플루오로포레 컨쥬게이드 펩CD47 코팅 표면을 세척하여 비공동 부착 펩타이드를 제거합니다: DMF(3x), DMF/DDW 1:1, DDW(3배), 0.3% SDS 20m MM Tris pH 7.4(셰이커70°C에서 각각 3배, 5분), DDW(3배), 바이알 변경 및 최종 DDW 세척.</li>
	<li>현미경 유리에 제어 및 공유 결합 된 메쉬 디스크를 배치하고 PBS 50 μL을 추가하고 커버 슬립을 놓습니다. 로다민 필터 세트가 장착된 반전형 형광 현미경을 이용한 이미지 메쉬 디스크. 100배배율로 대표 이미지를 찍습니다.</li>
	<li>15 mL의 12 mg/mL TCEP 용액을 1:1 v/v 혼합물로 1:1 v/v 의 TCEP를 용해하여 메탄올과 0.1 M 아세트 버퍼를 준비하십시오.</li>
	<li>15 분 동안 RT의 셰이커에 TCEP 솔루션 1 mL로 세척 된 각 호일을 배양하십시오.</li>
	<li>TAMRA-컨쥬게이트 펩CD47 스톡(1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL 및 0.01 μg/mL을 직렬적으로 희석하여 다음 표준을 준비하십시오. TCEP 솔루션을 희석제로 사용합니다.</li>
	<li>544/590 nm 발산 및 방출 파장에서 형광에 의한 표준을 사용하여 생성된 교정 곡선에 대해 금속 표면에서 방출된 TAMRA-컨쥬게이트 펩CD47을 분석한다.</li>
</ol>3. PEI-PDT 변형 표면에 인간 펩CD47 부착
<ol><li>제1항에 설명된 바와 같이 제조된 PEI-PDT 코팅 샘플을 세척하여 위의 1.1-1.10 단계, 탈가스 DDW 5x로 유리병을 변경하고 탈가스 DDW 5x로 세척합니다.</li>
	<li>인간 펩CD47 스톡 용액(1 mg/mL)을 분해된 50% 아세트산으로 인체 펩CD47 분말을 용해시켜 농도 1 mg/mL을 달성한다.</li>
	<li>인간 펩CD47(100 μg/mL)의 작동 농도를 4,500μL에서 인간 펩CD47의 500 μL을 분해하여 1x 인산완충식염(PBS)의 작동 농도를 준비한다.</li>
	<li>세척된 PEI-PDT 코팅 시료를 RT에서 펩CD47 100 μg/mL로 1시간 동안 흔들어 줍니다.</li>
	<li>인간 펩CD47 코팅 시료를 세척하여 다음과 같은 순서로 초과 펩티드를 제거하여 PBS(3배), DDW(3배), 0.2% 트위엔-20(각각 3배, 5분), DDW(3배), 변경 바이알 및 최종 DDW 세척을 한다. 참고: 인간 펩CD47 코팅 표면은 최대 6개월 동안 4°C에서 건조하게 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 스크램블 시퀀스 (Scr)로 PEI PDT 변형 표면을 코팅
<ol><li>스크램블 서열 분말을 1 mg/mL의 재고 용액을 준비하기 위해 0.1% 아세트산에 분해된 서열 분말을 녹입니다.</li>
	<li>4,500 μL의 500 μL을 분해하여 스크램블 펩타이드 100 μg/mL의 용액을 3.1% 아세트산의 4,500 μL로 용해시한다.</li>
	<li>세척된 PEI-PDT 표본을 RT에서 스크램블 펩타이드 100 μg/mL로 코팅하여 1시간 동안 흔들어 줍니다.</li>
	<li>부착되지 않은 스크램블 펩타이드를 제거하려면 다음 순서로 표면을 0.01% 아세트산(3배), DDW(3배), 0.2% 트위엔-20(3배, 5분), DDW(3배), 변경 바이알 및 1DW 세척으로 세척한다.</li>
</ol>5. 금속 표면에 대한 셀룰러 부착을 분석하기 위한 챈들러 루프
<ol><li>금속 호일(0.65cm x 1cm)을 인간 펩CD47 또는 스크램블 펩타이드로 코팅한 다음 1항에 대한 설명에 따라 3또는 4가 됩니다.</li>
	<li>1/4" PVC 튜브를 38cm 길이의 3개로 자릅니다.</li>
	<li>최대 8개의 수정되지 않은 스크램블 펩타이드 또는 펩CD47 수정금속 호일을 세 가지 다른 튜브에 삽입합니다.</li>
	<li>기관 IRB 프로토콜에 따라 모든 항 혈소판 약물이없는 건강한 인간 기증자로부터 30 mL의 혈액을 수집하십시오. 수집된 혈액의 응고를 방지하기 위하여 4% 구연산나트륨의 1 mL를 가진 preload 주사기.</li>
	<li>10mL 주사기를 사용하여 각 튜브에 10mL의 혈액을 넣고 끝을 금속 어댑터와 연결합니다. 챈들러 루프 장치의 바퀴에 피가 가득한 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>4h에 대한 25 dyns/cm2의 전단을 생성하기 위해 계산된 속도로 37°C에서 휠 회전으로 금속 호일을 따라 혈액을 전달합니다.</li>
	<li>튜브에서 혈액을 배출하고 IRB 요구 사항에 따라 혈액을 처분하십시오.</li>
	<li>각 튜브에서 호일을 검색하는 메스를 사용하여 튜브를 잘라.</li>
	<li>염화 나트륨 0.1M을 사용하여 10mL의 나트륨 카코디레이트 버퍼를 사용하여 4% 글루타랄데히드 용액 10ml를 희석하여 2% 글루타랄데히드 용액을 준비합니다.</li>
	<li>호일을 2% 글루타랄데히드 용액으로 15분 동안 배양하고 하룻밤 사이에 4°C에 보관하십시오. 분석하기 전에 PBS로 금속 호일을 3배 세척합니다.</li>
</ol>6. CFDA 염료를 사용하여 금속 표면에 세포 부착 분석
<ol><li>37°C로 설정된 수조에서 15mL 튜브에서 PBS의 8mL를 따뜻하게 합니다.</li>
	<li>다음과 같이 CFDA(카박스형-플루오레세인 이아세인, 수니미딜 에스테르) 염료 용액을 준비 - 10mMMM의 재고 농도를 달성하기 위해 하나의 CFDA 염료 바이알에 DMSO의 90 μL을 추가합니다. 다음으로, 따뜻한 PBS의 8mL에 주식 CFDA의 75 μL을 추가하여 93.75 μM의 작업 농도를 준비한다. 튜브를 몇 번 반전하여 섞어서 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다. 참고: 모든 사용 전에 CFDA 염료를 신선하게 준비하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>24 웰 플레이트에 CFDA 염료 1mL로 각 호일을 배양합니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 플레이트를 37°C에서 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>금속 호일을 PBS로 3배 세척하여 과도한 염료를 제거합니다. 반전형 형광 현미경을 이용한 이미지.</li>
</ol>7. 펩CD47 변형 및 베어 메탈 표면에 대한 단핵 부착 및 대식세포 팽창
<ol><li>400-450 g 남성 스프라그-Dawley 쥐의 희생 하는 동안 베나 카바 액세스를 통해 말초 혈액의 10 mL를 수집 합니다. 응고를 방지하기 위해 헤파린 나트륨 1,000 IU와 즉시 섞으세요.</li>
	<li>50mL 원문 튜브로 밀도 그라데이션 배지의 파이펫 10 mL. 혈액을 PBS 5mL로 섞고 파스퇴르 파이펫을 사용하여 밀도 그라데이션 배지위에 희석된 혈액을 조심스럽게 층으로 넣습니다. 800 x g의 스윙 버킷 로터와 18-25 °C의 원심분리기는 가속 및 감속을 최소화하여 20 분 동안.</li>
	<li>파스퇴르 파이펫을 사용하여 플라즈마와 Ficoll 사이의 인터페이스에서 불투명한 버피 코트를 수집합니다. PBS와 원심분리기를 550 x g, 4°C로 10분 동안 부피 코트1:3을 희석하여 버피 코트 셀을 부적시합니다.</li>
	<li>오염된 적혈구를 용해하기 위해 ACK 용해 버퍼의 3mL에서 버피 코트 세포를 다시 일시 중단합니다. 4 분 동안 얼음에 배양. 세포 분리 버퍼(CSB; 0.5% BSA, 0.5% FBS, 2mM EDTA/PBS)의 12mL를 추가합니다.</li>
	<li>원심분리기 550 x g및 4°C에서 10분 동안. CSB의 10mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>혈소판을 제거하기 위해 10 분 동안 200 x g 및 4 °C의 원심 분리기. 두 번 반복합니다.</li>
	<li>CSB의 500 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. CD8a(클론 OX-8), 안티 CD5(클론 OX-19), 안티 CD45RA(클론 OX-33), 안티 CD6(클론 OX-52) 등 각 마우스 항쥐 항체각각의 10μg를 추가한다.</li>
	<li>1 h. CSB의 9.5 mL를 추가 수직 튜브 회전에 4 °C에서 배양. 원심분리기는 300 x g, 4°C에서 10분 동안. 상신을 버리고, CSB의 10mL에서 펠릿을 다시 중단하고 원심분리를 반복한다.</li>
	<li>CSB의 500 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 염소 안티 마우스 IgG 마이크로 비드의 150 μL을 추가합니다. 수직 튜브 회전기에서 4°C에서 20분 동안 배양하십시오. 원심분리기는 300 x g, 4°C에서 10분 동안.</li>
	<li>상부체를 폐기합니다. CSB의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>LS 컬럼을 자기 분리기에 놓습니다.  CSB의 3mL와 LS 열을 프라임합니다. 열 처리량을 삭제합니다. 단계 7.10에서 다시 일시 중단 된 셀 펠릿 1 mL을 추가합니다. 처리량 수집을 시작합니다. 흐름이 중지된 후 CSB의 5mL를 추가하고 흐름이 멈출 때까지 열 처리량을 계속 수집합니다.</li>
	<li>원심분리기는 300 x g에서 음수 선택된 단핵구를 함유하고 10분 동안 4°C로 음수로 선택된 단핵구를 포함하는 컬럼 처리량(6mL)을 원심분리합니다. 10% FCS, 1% 펜/스트렙 및 100 ng/mL 쥐 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)로 보충된 RPMI-1640 배지의 2mL에서 생성된 작은 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>혈세포계를 사용하여 단핵구를 계산합니다. 단세포 농도를 5 x 105 셀/mL로 조정합니다.</li>
	<li>1.1-1.10 및 3.1-3.6에 따라 쥐 pepCD47(N=3)으로 수정된 베어 스테인리스 스틸 호일 샘플(N=3) 또는 스테인리스 스틸 샘플로 12개의 웰 플레이트의 개별 우물에 1mL 볼륨의 단핵현액을 추가한다.</li>
	<li>3일과 5일에 는 미디엄을 변경합니다. 6일째에 시딩 후 PBS로 세포를 씻고 실온에서 4%의 파라포름알데히드로 15분 간 수정합니다. PBS로 5분 동안 두 번 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>스테인레스 스틸 호일을 제거하고 새로운 12 웰 플레이트에 개별적으로 배치합니다. 호일을 뒤집지 마십시오.</li>
	<li>세포를 침투하기 위해 15 분 동안 0.5 % Tween-20 / PBS에서 배양하십시오. PBS로 5분 동안 두 번 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>20 분 동안 10 % 염소 세럼 / PBS를 차단합니다. 세럼을 흡인합니다. 씻지 마십시오. 마우스 항쥐 CD68 항체를 추가합니다(1%BSA/PBS에서 1:100 희석). 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS에서 3배씩 5분 씩 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>염소 안티 마우스 IgG 알렉사 플루어 546 (1 % BSA / PBS에서 1:200 희석)를 추가합니다. 45 분 동안 실온에서 어둠 속에서 배양. PBS에서 5분 동안 씻으시면 됩니다. 1 μg /mL Hoechst 33342 염료를 실온에서 10 분 동안 어둡게 하는 카운터스테인. PBS에서 3배씩 5분 씩 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>반전 된 광학과 형광 현미경을 사용하여 호일과 이미지를 뒤집습니다. 파란색과 빨간색 필터 설정으로 200배 배율로 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>개별 이미지에서 연결된 단핵구를 계산하고 그룹 평균 및 표준 편차를 계산합니다.</li>
</ol>

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우리는 혈액에서 발견되는 염증 세포로 표면의 반응성을 줄이는 가장 중요한 목표를 가지고 스테인레스 스틸 표면에 치료 펩티드 모에티를 더하는 비교적 새로운 화학 전략을 시연하고 설명합니다. 본 명세서에 기재된 비스포스포네이트 화학은 PABT의 금속 산화물 과 비스포스포네이트 그룹 간의 결합 형성을 조정하는 것을 포함한다. 금속 표면에 형성된 폴리비스포산 단층의 두께는 5nm18을초과하지 않으며, 따라서, 두꺼운 폴리머코팅(20)의잠재적인 염증 효과에 대해 중요하지 않다. PABT의 알리팔성 측면 사슬에서 잠복 티올 그룹의 보호는 티올 반응성 화합물로 추가 화학 적 변형을 위해 금속 표면을 프라임. PEI-PDT는 에틸렌네이민 링크의 ~20%가 티올 반응성 피리딜디티오 그룹으로 수정되는 폴리에틸렌네이민(평균 Mw=25,000)으로 분기된다. PEI-PDT내 PDT 군의 소수만이 PABT 유래 티올과의 반응에서 소비되기 때문에 PEI-PDT 테더링 ...

경피 관상 동맥 개입은 관상 동맥 질환을 치료하는 치료의 첫 번째 라인입니다 (CAD) 주로 병은 동맥을 스텐팅 포함. 그러나 스텐트 내 레스텐소증(ISR) 및 스텐트 혈전증은 스텐트 배치1과관련된 일반적인 합병증이다. 혈액-스텐트 인터페이스에서의 혈액 상호 작용은 금속 표면에 혈장 단백질을 거의 즉각적으로 흡착한 후 혈소판 및 염증성 세포 부착 및 활성화2를특징으로 한다. 활성 염증 세포에서 염증성 사이토카인및 케모킨의 방출은 튜니카 미디어에서 혈관 매끄러운 근육 세포 (VSMC)의 페노티픽 변형으로 이어지고 동식물 구획으로의 원심 이동을 유발합니다. 친밀감에서 활성화 된 VSMC의 확산은 친밀감 층 두껍게, 루멘 협착 및 스텐트 레스텐트3을초래한다. 약물 용출 스텐트 (DES)는 VSMC 확산을 방지하기 위해 개발되었다; 그러나, 이들 약물은 내피세포에대한 오프표적 세포독성 효과가4,5. 따라서, 늦은 스텐트 혈전증은 DES6,,7과관련된 일반적인 합병증이다. 폴리 L-lactide와 같은 생분해성 폴리머로 만든 스텐트는 동물 실험과 초기 임상 시험에서 많은 약속을 보였지만, 결국 "실제" 임상 사용이3세대 DES8에대한 열등감을 입증했을 때 리콜되었다. 따라서, 더 나은 환자 결과를 위해 베어 메탈 스텐트의 생체 적합성을 개선할 필요가 있다.
CD47은 본선 수용체 신호 조절 단백질 알파(SIRPα)9에결합될 때 타고난 면역 반응을 억제하는 유비쿼터스로 발현된 대막 단백질이다. SIRPα 수용체는 면역 세포 티로신 억제 모티프(ITIM) 도메인및 SIRPα-CD47 상호작용에 따른 신호 발생을 가지며 궁극적으로 염증성 세포 활성화10,,11,12,,13의하향 조절을 초래한다., 우리의 실험실에서 연구는 재조합 CD47 또는 그 펩티드 유도체, CD47 (pepCD47)의 세포외 영역의 22 아미노산 Ig 도메인에 대응하는 것으로 나타났습니다, 임상적으로 관련된 생체 물질의 범위에 호스트 면역 반응을 감소시킬 수있습니다 14,,15,,16. 최근에는 pepCD47이 스테인레스 스틸 스텐트 표면에 고정되어 있으며 레스테인노시스와 관련된 병리생리학적 반응을 현저히 감소시킬 수 있음을 입증했습니다. 참고로, 펩CD47 변형 표면은 장기 저장 및 에틸렌 산화물멸균(17)과같은 관련 사용 조건에 따라 절단된다. 이를 위해 펩CD47은 혈관 내 스텐트의 임상적 한계를 해결하는 데 유용한 치료 대상이 될 수 있다.
금속 표면에 pepCD47의 공유 부착에 대한 전략은 금속 표면의 일련의 새로운 화학 적 변형을 포함한다. 금속 표면은 먼저 잠복 티올 그룹 (PABT)으로 폴리 에일라민 비스포스포네이트로 코팅된 다음 티올의 보호 및 설치된 피리딜디티오 그룹 (PDT)을 갖춘 폴리에틸렌네이민 (PEI)의 부착을 제거합니다. 비보호 된 PABT 티올과의 반응에서 소비되지 않은 PEI의 PDT 그룹은 다음 말단 시스테인 잔류물에 티올을 통합 pepCD47로 반응하여 이황화물 결합14,17,,18을통해 금속 표면에 결합 펩CD47을 초래한다.,17 우리는 펩티드의 최대 표면 고정을 초래하는 펩티드의 입력 농도를 결정하기 위해 플루오로포어 컨쥬게이드 펩CD47(TAMRA-pepCD47)을 사용했다. 마지막으로, 당사는 Chandler 루프 장치 및 단핵 부착/대식세포 팽창 분석등을 이용하여 펩CD47 코팅 금속 표면, 전 생체의 급성 및 만성 항염증 능력을 각각 평가하였다.
본 백서는 금속 표면에 티오라드 펩티드의 부착을 위한 체계적인 프로토콜을 제공한다; 펩티드의 최대 고정 밀도를 결정; 전혈 및 절연 단핵구에 노출된 pepCD47 코팅 금속 표면의 항염증 특성을 평가한다.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCL</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td>pH - 7.5</td></tr><tr><td>4 % 글루 타르 알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16539-07</td><td></td></tr><tr><td>4 % 구연산 나트륨</td><td>시그마</td><td>S5770</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>품질 생물학적 제제</td><td>118-156-721</td><td></td></tr><tr><td>안티 CD45RA Ab (마우스 안티 마우스, 클론 OX-19)</td> <td>Biolegend</td><td>202301</td><td></td></tr><tr><td>항-CD5 Ab (생쥐 항-쥐; 클론 OX-19)</td><td>Biolegend</td><td>203501</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD6 Ab (생쥐 항-쥐; 클론 OX-52)</td><td>BD Biosciences</td><td>550979</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD68 Ab (생쥐 항-쥐; 클론 ED-1)</td><td>BioRad</td><td>MCA341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8a Ab (생쥐 항-쥐; 클론 OX-8)</td><td>Biolegend</td><td>201701</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름 인증 ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 포름맘미드(DMF)</td><td>Alfa Aesar</td><td>39117</td><td></td></tr><tr><td>Embra 스테인리스강 그리드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>E200-SS</td><td>스테인리스강 메쉬 메쉬 디스크</td></tr><tr><td>Ficoll Hypaque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>ACROS 유기</td><td>148930025</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor</td><td>ThermoFisher</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>Sagent 제약</td><td>402-01</td><td></td></tr><tr><td>인간 pepCD47</td><td>Bachem</td><td>4099101</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A426P-4</td><td></td></tr><tr><td>금속 어댑터</td><td>Leur 피팅</td><td>6515IND</td><td>1 방향 어댑터 316 ss 1/4 "-5 / 16"괭이 끝</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>RICCA 화학 회사</td><td>4829-32</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon Eclipse</td><td>TE300</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>중탄산 칼륨(KHCO3)</td><td>Fisher Chemical</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>PVC 튜브</td><td>Terumo-CVS</td><td>60050</td><td>1/4" X 1/16 8'0.1M</td></tr> <tr><td>염화나트륨 전자가 포함된 카코딜산나트륨 완충액</td><td> Microscopy Sciences</td><td>11653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Bio-Rad laboratories</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Sodum Actetate (C2H3NaO2)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184</td><td></td></tr><tr><td>Src 펩타이드</td><td>Bachem</td><td>4092599</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 (AISI 304) 루멘 마이크로 그룹이있는 실린더 모양 샘플</td><td>, Medway, MA</td><td>20097328</td><td>1 cm X 6 mm OD</td></tr><tr><td>스테인리스강 호일(AISI 316L)</td><td>Goodfellow, Coraopolis, PA</td><td></td><td>100mm X 100mm X 0.05mm</td></tr><tr><td>테트라메틸로다민 복합 pepCD47(TAMRA-pepCD47)</td><td>Bachem</td><td>4100277</td><td></td></tr><tr><td>TMB(3,3', 5,5' -테트라메틸벤지딘) 기질 및 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 염산염(TCEP)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PG82089</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad 실험실</td><td>170-6531</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant CFDA SE 세포 추적 키트</td><td>Invitrogen</td><td>V12883</td><td></td></tr></tbody></table>

cd47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

베어 메탈 스텐트와 약물 용출 스텐트와 관련된 주요 합병증은 각각 스텐트 내 레스타디스와 늦은 스텐트 혈전증입니다. 따라서 금속 스텐트의 생체 적합성을 개선하는 것은 여전히 중요한 과제입니다. 이 프로토콜의 목표는 혈관 내 스텐트를 포함하여 혈액 접촉 의료 임플란트의 생체 적합성을 높이기 위해 생물학적활성 펩티드에 의한 금속 표면 변형의 견고한 기술을 설명하는 것입니다. CD47은 면역학적 종별 자가 마커이며 항염증 성질을 갖는다. 연구 결과에 따르면 세포외 영역(pepCD47)에서 CD47의 Ig 도메인에 대응하는 22개의 아미노산 펩티드가 전길이 단백질과 같은 항염증 성질을 갖는다. 쥐의 생체 내 연구, 그리고 우리의 실험실에서 토끼와 인간의 혈액 실험 시스템에서 전 생체 연구 는 펩CD47 금속에 고정 염증 세포 부착 및 활성화를 방지 하 여 그들의 생체 적합성을 향상 입증 했다. 이 백서는 금속 표면 및 펩타이드 부착의 기능화를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 금속 표면은 잠복 티올 그룹(PABT)을 사용한 폴리알리알라민 비스포스페이트(polyallylamine bisphosphate)를 사용하여 수정한 다음, 피리딜디티오 군(PEI-PDT)으로 설치된 폴리에틸렌네이민과의 반응을 통해 티올의 보호 및 티올 반응성 부위의 증폭을 한다. 마지막으로, 펩CD47은 이중 8-아미노-3,6-디옥사 옥타노일 스페이서를 통해 코어 펩타이드 서열에 연결된 말단 시스테인 잔류물을 통합하여, 디설파이드 결합을 통해 금속 표면에 부착된다. 금속 표면에 대한 펩타이드 부착의 이 방법론은 효율적이고 상대적으로 저렴하므로 여러 금속 생체 재료의 생체 적합성을 향상시키기 위해 적용 될 수있다.

금속 표면은 도 1에도시된 바와 같이 일련의 화학 적 변형을 통해 펩타이드 부착에 대한 티올 반응성 렌더링된다. PEI-PDT 처리뒤에 PABT 인큐베이션은 펩티드 부착을 위해 금속 표면을 가능하게 합니다. 펩타이드 CD47(pepCD47)은 C-terminus에서 시스테인 잔류물을 함유하고 있으며, 유연한 듀얼 AEEAc 브리지를 통해 코어 펩CD47 서열에 결합되어 이설화 결합을 통해 티올 반응성 표면에 공유하게 부착된다. 이 프로토콜을 사용하여 pepCD47은 최대 6 개월 동안 금속 표면에 안정적으로 부착되어 있으며 정상적인 생리 전단 응력 및 살균 절차(17)를견딜 수 있음을 입증했습니다.
최대 펩티드 보존은 TAMRA-컨쥬게이드 펩CD47을 금속 표면에 추가한 다음 광범위한 세척을 통해 비동시결합 펩티드를 제거하고, 타마-펩CD47의 분열은 펩티드를 표면에 스테더링하는 이설...

여기에 제시된 펩티드 CD47(pepCD47)을 다비스포산 화학을 이용한 금속 스텐트에 대한 프로토콜이 제시된다. pepCD47을 사용하여 금속 스텐트의 기능화는 염증 세포의 부착 및 활성화를 방지하므로 생체 적합성을 향상시키게 합니다.

CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

The key complications associated with bare metal stents and drug eluting stents are in-stent restenosis and late stent thrombosis, respectively. Thus, ...

이 프로토콜은 금속 표면에 치료 펩티드를 추가하는 새로운 화학 전략을 포함하고, 금속 생체 재료의 넓은 범위의 생체 적합성을 향상시킬 수있는 잠재력을 가지고있다. 이것은 생체 임플란트의 맨금속 표면에 펩티드와 치료 단백질을 부수는 보편적이고 강력한 기술입니다. 우리는 스텐팅에 의해 유발되는 염증 반응을 방지하기 위해 CD47 펩티드를 부속시킴으로써 금속 스텐트의 생체 적합성을 개선하기 위해이 기술을 사용했습니다.스테인레스 스틸 호일 쿠폰 이나 메쉬 디스크를 셰이커에 2-이소프로판올을 5 분 동안 세척하. 이 세척을 두 번 수행한 다음 세척당 10 분 동안 클로로포름으로 샘플을 두 번 씻으시다. 정화된 스테인리스 스틸 샘플을 섭씨 220도에서 30분간 오븐에 놓습니다.구운 호일 이나 메쉬 디스크를 PABT의 0.5% 수성 용액으로 담그고 1시간 동안 셰이커에 인큐베이션합니다. 폐기된 증류수로 PABT 변형 샘플을 5회 세척합니다. 시편을 새로운 바이알로 옮기고 세근을 반복합니다.셰이커의 실온에서 샘플을 TCEP로 15분 동안 처리합니다. 디가스 는 리오필라이저와 같은 진공 생성 장치로 둥근 바닥 플라스크에서 증류수를 분해하고, 호일 또는 메쉬 디스크를 탈가스물로 5회 세척한다. 샘플을 새 바이알로 옮기고 세서스를 반복합니다.주식 PEI-PDT의 212.5 마이크로리터와 125 마이크로리터의 0.4 마이크로리터를 탈가스 수역에서 아세테이트1%의 PEI-PDT 용액 5밀리리터를 준비한다. 세척된 스테인리스 스틸 시편을 1%PEI-PDT로 배양합니다. 공기를 아르곤 가스로 교체하고, 유리병을 밀폐밀봉하고, 셰이커에 1시간 동안 섞습니다.펩타이드 컨쥬게이션으로 즉시 진행하거나 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 샘플을 저장하십시오. 밀리리터 인간 펩타이드 CD47 스톡 용액을 탈가시 50% 아세트산으로 용해한 다음, 500마이크로리터를 탈가스 PBS4.5 밀리리터로 용해시켜 작업 용액을 준비한다. 세척된 PEI-PDT 코팅 시료를 실온에서 펩타이드 CD47의 작동 용액과 함께 1시간 동안 흔들어 줍니다.완료되면 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 펩타이드 CD47 코팅 샘플을 세척한다. 펩타이드 CD47 또는 스크램블 펩타이드로 금속 호일을 코팅한 후, 분기 인치 PVC 튜브를 38센티미터 길이의 3개로 자르고 수정되지 않은 스크램블 펩타이드 또는 펩타이드 CD47 수정 금속 호일을 3개의 다른 튜브에 삽입합니다. 어떤 항 혈소판 약물무료 건강한 인간 기증자로부터 혈액의 30 밀리리터를 수집, 수집 된 혈액의 응고를 방지하기 위해 4 %의 나트륨 구연산나트륨의 한 밀리리터와 주사기를 미리로드.10 밀리리터 주사기를 사용하여 각 튜브에 10 밀리리터의 혈액을 넣고 끝을 금속 어댑터와 연결합니다. Chandler 루프 장치의 바퀴에 피가 가득한 튜브를 놓고 4 시간 동안 섭씨 37도에서 바퀴 회전으로 금속 호일을 따라 혈액을 전달합니다. 튜브에서 혈액을 배출하고 IRB 요구 사항에 따라 폐기 한 다음 메스로 튜브를 잘라 포일을 회수합니다.염화 나트륨 0.1과 나트륨 cacodylate 버퍼에 70% 용액을 희석하여 2% 글루타랄데히드 용액을 준비합니다. 2% 글루타랄데히드 용액을 15분 동안 배양하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 금속 호일을 분석하기 전에 PBS로 세 번 씻으시기를 바하십시오.섭씨 37도의 수조에서 PBS8 밀리리터를 따뜻하게 합니다. 10 밀리머 CFDA 염료 재고 용액을 하나의 CFDA 바이알에 90 마이크로리터를 추가하여 10 밀리미터 CFDA 염료 스톡 솔루션을 준비한 다음, 따뜻한 PBS에 주식 CFDA의 75 마이크로리터를 추가하여 작업 용액을 준비합니다. 튜브를 몇 번 반전하여 알루미늄 호일로 혼합하고 덮습니다.각 호일을 CFDA 염료 1밀리리터에 24웰 플레이트에 넣습니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 접시를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양한 다음 PBS에서 포일을 세 번 씻은 다음 형광 현미경으로 이미지를 만듭니다. 공자된 TAMRA 공주 펩타이드 CD47의 농도는 금속 표면상에 펩타이드의 최대 고정 밀도를 결정하기 위해 정량화되었다.최대 펩티드 보존은 밀리리터당 100 마이크로그램의 입력 농도로 달성된 약 180 나노그램의 센티미터 제곱이었습니다. 변형된 금속 표면에 TAMRA 컨쥬게이드 펩타이드 CD47의 고정은 형광 현미경 검사법에 의해 더욱 확증되었고, 이는 TAMRA 컨쥬게이트 펩타이드 CD47 처리 메쉬 디스크의 표면에서 방출되는 균일한 형광을 보였다. 변형이 부족한 제어 매시 표면에서 최소한의 형광만 검출되어, 비특이적으로 결합된 TAMRA 공주 펩티드 CD47을 형광의 주요 원천으로 배제한다.또한 펩타이드 CD47 코팅 표면이 스크램블 수정 및 수정되지 않은 펩티드 컨트롤에 비해 혈액 매개 세포 부착의 급격한 감소를 보이는 것으로 확인되었다. 쥐 버피 코트 세포로부터 분리된 단핵구는 베어 메탈및 펩타이드 CD47 변형 스테인리스 스틸 호일에 배양되었다. 급성 단세포 부착의 58% 감쇠, 대식세포로의 변환 및 대식세포 증식은 기능화된 표면에서 관찰되었다.이 프로토콜을 시도하는 동안, 가능한 한 빨리 수행될 탈가스 물 또는 시약을 포함하는 단계를 수행하고 산소에 대한 노출을 최소화하는 것이 매우 중요합니다. 당사의 기술은 금속 표면과의 세포 상호 작용을 선택적으로 조절하고 RT-PCR, 유동 세포측정 및 면역 형광과 같은 전형적인 세포 유형 식별 분석법은 이 기술과 호환됩니다. 다양한 생체 활성 펩티드를 위해 개발될 때, 이 기술은 조직 재료 인터페이스에서 생체 적합성을 증가시켜 기악할 수 있다.

mitigation-blood-borne-cell-attachment-to-metal-implants-through-cd47

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는, 우리는 그들의 기능을 개선하고 세포의 이동을 제어하는​​ 다공성 금속 임플란트에 대한 수정 방법을 보여줍니다. 기술은 3D 및 기저막의 생산은 2-D에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 모방에서 세포의 움직임을 제어하는​​ 기공 그라디언트의 개발을 포함한다. 또한, 혈액 단백질의 분석을 통해 생체의 모니터링 임플란트 통합을위한 HPLC 기반 방법이 설명되어 있습니다.

모공 그라디언트, 고분자 전해질 및 그들의 간접적 인 모니터링과 금속 임플란트의 멀티 스케일 변경<em&gt; 생체 내</em

우리는 표면에 BMP-2를 효율적으로 고정화를 달성하기위한 방법을 설명합니다. 우리의 접근은 유리 아민 잔기를 통해 BMP-2 공유 결합을 달성하기 위해 자기 조립 단분자막의 형성에 기초한다. 이 방법은 세포막에서 신호를 연구 할 수있는 유용한 도구입니다.

공유 결합은 자기 조립 단분자막의 접근 방식을 사용하여 표면에 BMP-2의 결합

고분자 혈액 도관에 대한 혈액 노출은 임상 합병증과 관련된 이물질 반응을 시작합니다. 여기에서는 이러한 도관을 통한 혈액 관류를 모방하는 실험 도구인 Chandler Loop Apparatus에 대해 설명합니다. 재조합 CD47의 부속물은 이러한 도관에서 이물질 반응의 증거를 감소시킵니다.

사용 전의 VIVO 챈들러 루프 장치 수정 된 고분자 혈액 도관의 생체 적합성을 평가하기 위해

세포 접착성은 생체 재료 연구 및 조직 공학의 많은 접근 방식에서 핵심입니다. 펩타이드를 함유한 중요한 고분자 PTFE의 표면 개질을 위해 습식 화학을 사용하여 단계별 기술을 제시합니다.

향상된 세포 접착 폴리 테트라 플루오로 에틸렌에 젖은 화학 및 펩티드 고정화

의료 기기에서 박테리아 표면 결합을 감소시키는 폴리머를 식별하기 위한 고처리량 마이크로어레이 방법에 대해 설명합니다.

의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

생체 재료 뼈 Morphogenetic 단백질 2 (BMP2) 실수로 비-연합 뼈 골절을 치유 하 새로운 치료 전략으로 사용 되었습니다. 요인의 통제 자료에서 발생 하는 부작용을 극복 하기 위해 제안 하는 사이트를 새로운 전략-직접 따라서 향상 된 osteogenic 기능으로 자료를 만드는 요소를 고정.

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

이 프로토콜은 레이저 컷 신경 혈관 임플란트를 사용하여 혈액 접촉 장치의 포괄적 인 혈전 성 평가를 설명합니다. 신선한, 헤파린화 인간의 혈액과 흐름 루프 모델은 혈류를 모방하기 위해 적용됩니다. 관류 후, 다양한 혈액학적 마커를 분석하고 시험된 장치의 혈적합성 평가를 위해 혈액 수집 직후 얻은 값과 비교한다.

인간의 혈류를 모방하는 흐름 루프 모델에서 혈액 접촉 임플란트의 혈적합성 테스트

이 프로토콜은 금속 임플란트 물질에 대해 슬라이딩 하는 골연드랄 실린더의 준비, 생체 교정 테스트 및 분석을 설명합니다. 이 프로토콜에 포함된 결과 측정은 대사 활동, 유전자 발현 및 히스토로지입니다.

임플란트용 금속에 대한 관절 연골 슬라이딩의 생체 립학 테스트 및 분석

여기서, 우리는 혈소판 용해 (PL)에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 티타늄(Ti) 임플란트 표면코팅에 대한 이들의 사용에 대한 방법을 제시한다. 우리는 낙하 주조 코팅 방법, 표면에서 의 EV 방출 프로파일, 그리고 티 표면 코팅 된 전기 EV의 생체 내 생체 적합성을 설명합니다.

티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화

본 프로토콜은 임플란트 관련 감염을 조사하기 위해 피하 등쪽 이식을 사용하는 마우스 모델을 설명하며, 이를 통해 병태생리학적 메커니즘을 포괄적으로 조사할 수 있고 표적 치료 전략으로 진단 기준 개발을 지원할 수 있습니다.

마우스의 임플란트 관련 감염에 대한 동물 모델

배우세요 금속 스텐트 표면에 CD47 펩타이드를 고정화하여 혈액 세포 부착과 염증 반응을 감소시키는 생체재료 공학 기법을. 이 방법은 다양한 금속 생체재료의 생체적합성을 향상시킬 수 있습니다.

CD47 유래 펩타이드 고정화를 통해 금속 임플란트에 대한 혈액 매개 세포 부착 완화

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