Name: CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 학습하세요 CRISPR 매개 시토신 베이스 편집기를 이용한 BRCA1 변종 기능 평가 방법을. 내인성 BRCA1을 직접 변형하여 암 위험 예측과 약물 표적 발굴에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 한국국립연구재단(2017M3A9B4062419, 2019R1F1A1057637, 2018R1A5A2020732)에서 지원했다.

참고: 방법 1(HAP1-BE3 세포주 생성)은 선택 사항입니다. BE3 발현 세포주 대신, BE3-인코딩 플라스미드 DNA는 gRNA 인코딩 플라스미드 DNA와 공동 으로 연관될 수 있다. BE4max와 같은 사이토신 베이스 에디터의 다른 변종도 고효율 베이스 편집에 사용될 수 있습니다.
1. HAP1-BE3 세포주 생성
<ol><li>플라스미드 DNA 의 건설<ol>
<li>렌티바이러스 생산을 위한 렌티베3-블라스미드 DNA를 구성하기 위해, 고충실도 폴리머라제를사용하여 PCR에 의한 PCMV-BE3(재료표)에서 BE3 코딩 서열을 증폭시다. PCR 프라이머를 설계하여 소화된 벡터의 중첩 시퀀스(1.1.2단계로부터)를 포함하여 다음과 같은 이더스모 조립에 대해다음 17: 프라이머-F:5'-TTTGCCGCCA가아가카가카가ACCACCTTC타그A GCCGCCACCATGAGCTCAGAG-3', 프라이머-R:5'-CAGAGAGAAGTGTGTTGCGCCGGATCC GACTTTCCTCTCTTTGGG-3' 참고: 밑줄에 표시된 뉴클레오티드는 소화된 벡터와 겹쳐져 있으며 이러한 서열은 사용자가 선택한 대상 벡터에 특이합니다.</li>
		<li>다이제스트 렌티카스9-블라스트(재료표) 37°C에서 1시간 동안 제한 효소, XbaI 및 BamHI(1μg당 1단위)를 함유한 플라스미드 DNA. 소화된 제품을 0.8% 아가로즈 젤로 실행하고 상업용 젤 추출키트(재료 표)를사용하여 적절한 크기의 밴드(8.6 kb)를 정화합니다.</li>
		<li>증폭된 BE3 PCR 생성물 및 소화된 렌티카스9-블라스트 벡터를 복제하여 이더스모조립키트(재료표)를사용한다. DNA 단편의 총 0.02-0.5 pmol및 벡터:삽입의 1:3 비율을 사용합니다. 조립 제품을 DH5 알파 유능한셀(18)으로변환한다. 암피실린(100 μg/mL)을 함유한 한천 판에 변압제를 넣고 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한다.</li>
		<li>여러 개의 식민지를 선택하고 암피실린 (100 μg/mL)을 함유 한 LB (리소제니 국물) 배지의 4 mL에서 접종하고 180 rpm에서 흔들리는 인큐베이터에서 문화를 성장시다.</li>
		<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 플라스미드 DNA 정제 키트(재료의 표)를사용하여 플라스미드 DNA를 정화합니다.</li>
		<li>DNA 복제 성공을 확인하기 위해, 표준 및 BE3 특이 프라이머(보충 표 1)를사용하여 Sanger 시퀀싱에 의해 각 정제 된 플라스미드 DNA (1.1.5 단계에서)의 BE3 서열을 분석하고 정확한 복제 렌티베3 폭발 구조를 선택합니다. 참고: Sanger 시퀀싱 결과를 분석하기 위해 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 CLUSTALW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)와 같은 여러 도구를 권장했습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>HAP1-BE3 세포주 세포 배양 및 생성<ol>
<li>건강한 상태와 적극적으로 분할 상태에서 세포를 유지합니다. 이스코브의 변형된 덜벡코 의 배지내의 배양 HAP1세포(재료표)10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/연쇄절제술을 함유하고 있다. Dulbecco의 수정된 독수리배지(재료 표)에서배양 HEK293T/17 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/연쇄 절제술을 함유하고 있습니다. 참고 : HAP1 세포는 거의 haploid 세포이기 때문에 유전 연구에 유용합니다. 그러나, 세포는 세포 배양에서 디플로이드 상태로 자발적으로 돌아갈 수 있다. 농축 Hoechst 34580 스테인드 1 n-계량체를 이용한 혼성구는 HAP1세포(19)의haploidy의 유지에 도움이 될 것이다.</li>
		<li>종자 5 x 106 HEK293T/17 셀 100 nm 접시에 1 일 전에 형질 전환. 트랜스펙트 당일, 플라스미드 DNA(렌티베3-블라스트 15μg, 바이러스 포장용 psPAX2 9 μg,2nd 세대 렌티바이러스 포장 시스템의 바이알 봉투용 pMD2.G 6 μg)를 제조사의프로토콜(재료표)20에따라 상업적인 트랜스페션 시약을 사용한다. 배지를 6h 후 트랜스페션에서 변경하고 바이러스 함유 배지를 48h 또는 72h에서 경질 후 변경한다. 0.45 μm 필터를 사용하여 상체를 필터링합니다.</li>
		<li>BE3의 렌티바이러스 입자를 HAP1 세포로 0.1의 MOI(복합감염)로 변환합니다. 적절한 MOI에 맞게 조정하려면 바이러스의 연속적으로 희석된 농도를 사용하십시오. 매체를 제거하고 조정 된 바이러스 성 상수 및 신선한 배양 매체로 대체하십시오.</li>
		<li>1일 전도 후, 배지를 10 μg/mL의블라스팅딘(재료표)으로변경하고, 세포를 3일 동안 셀리시딘으로 선택한다. blasticidin 선택 후 다음 단계에 대해 생존 셀의 ~10 %를 가진 우물을 선택합니다.</li>
		<li>블라스팅시딘 선택 후, 단일 클론을 분리하기 위해 96웰 플레이트에 변환된 세포를 0.5 세포/웰밀도로 시드하여 단일 클론(예를 들어, 20mL(200 μL당 0.5세포)에 50개의 세포를 희석시키고 96개의 잘 된 판당 200 μL을 원한다. 2 주 동안 96 웰 플레이트를 배양하고 BE3 활동을 확인하기 위해 단일 식민지를 선택합니다.</li>
		<li>단일 콜로니를 두 세트로 나누고, BE3 활동을 테스트하기 위한 세트와 유지 보수를 위해 다른 집합을 나눕니다. gRNA의 렌티바이러스 입자를 BE3 활성을 확인하기 위한 세트 중 하나로 변환합니다. T7 엔도누클리스 I(T7E1, 재료표)분석 또는 표적 심층 염기서열분석기(Step 4)21을수행하여 각 콜로니의 돌연변이 주파수를 분석한다. 건강하고 능동적인 BE3가 있는 적절한 단일 클론을 선택합니다. 참고: 정확한 돌연변이 주파수를 검증하려면 T7E1 분석보다 표적 깊은 시퀀싱을 권장합니다. HEK2(5'-GAACACAAGAGAGAGACTGGGGG-'3)는 BE3의 검증대상 사이트입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GRNA를 대상으로 하는 BRCA1의 설계 및 시공
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig02.jpg"> 그림 2: gRNA 플라스미드 DNA의 예. (A)BE3로 표적 서열을 효과적으로 편집하기 위해서는, 표적 C(표적 G)를 5-뉴클레오티드 창 내에 배치하는 NGG PAM(CCN PAM)이 요구된다. NGG PAM은 빨간색으로 표시되고 기본 편집 창은 회색 상자로 표시됩니다. (B)c.8047C&gt;T(H1283Y) 베이스 편집을 위한 gRNA 서열이 표시되고 대상 C:G 쌍이 빨간색으로 표시되고 활성 창은 회색 상자에 의해 강조된다. gRNA 복제의 경우 굵게 표시된 오버행 서열이 5 엔드 모두에 추가됩니다. gRNA에 대한 템플릿은 두 개의 보완적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 생성되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: BRCA1 변종의 양수 및 음수 제어는 필수적입니다. 이 연구에서는 c.5252G&gt;A(R1751Q) 및 c.4527C&gt;T(Y1509Y)가 양성 컨트롤로 사용됩니다. c.191G&gt;A(C64Y), 81-1G&gt;A, c.3598C&gt;T(Q1200*)는 병원성 대조군으로 사용됩니다. 각 gRNA의 표적 서열은 보충표 1에나열됩니다.
<ol><li>NCBI22에서GenBank에서 BRCA1 게놈 서열을 획득하십시오.</li>
	<li>관심의 돌연변이 주위에 프로토 스페이서 인접 모티프 (PAM) 시퀀스 "NGG"와 "CCN"으로 20 bp 대상 사이트를 검색합니다. 관심의 돌연변이는 GRNA 표적 서열의 PAM-distal 말단인 BE3의 활성 창으로 인해 4-8뉴클레오티드에 위치해야한다. c.8047C&gt;T(H1283Y)-c.5252G&gt;A(R1751Q)-표적 gRNA, 5~TCAGGAACATCACCTTAGTG-AGG-3및 5°C-CCA-CCAAGGTCCAAAGCGAGAA의경우, 3차 면에 사용됩니다. C ~T 및 G에서 A로 의 전환은 각각 NGG 및 CCNPAM(그림 2A)과함께 발생합니다. 참고: BE-Designer(http://www.rgenome.net/be-designer/)(23)는 gRNA 설계를 위한 유용한 웹 기반 도구입니다.</li>
	<li>gRNA 당 두 개의 보완적인 올리고뉴클레오티드를 주문; 전방 올리고뉴클레오티드의 경우 가이드 서열의 5엔자 끝에 "CACCG"를 추가하고, 역방향 올리고뉴클레오티드의 경우 5엔드에 "AAAC"를 추가하고 3엔드에 "C"를 추가합니다. 이러한 추가 서열은 이 프로토콜에 사용되는 대상 gRNA 발현 벡터(2.5단계에서)에 특이적이며, 사용자는 대체 gRNA 발현벡터(그림 2B)에대해 조정되어야 한다.</li>
	<li>100 μM의 최종 농도에서 증류수에서 올리고뉴클레오티드를 재연. 두 개의 보완적인 올리고뉴클레오티드를 T4 계합버퍼(재료 표)로10 μM의 최종 농도로 혼합하고 95°C에서 5분간 가열하여 실내 온도에서 냉각시 냉각시.</li>
	<li>37°C(재료표)에서 1h에 대한 제한 효소, BsaI(1 μg당 1단위)를 사용하여 pRG2를 소화한다. 소화된 제품을 1% 아가로즈 젤로 실행하고 적절한 크기의 밴드(2.5kb)를 정화합니다. 참고: 고전적인 소화 및 결찰 방법을 사용하는 대신 골든 게이트 복제와 같은 다른 복제 방법을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>제조자의 프로토콜에 따라 구입한 DNA 리개아제(재료표)를 사용하여 벡터DNA에 아닐드 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 리게이트하고 이를 DH5 알파 유능한 세포로 변환(다른 대장균 균주도 사용할 수 있음).</li>
	<li>암피실린(100 μg/mL)을 함유한 한천 판에 변압제를 추가하고 37°C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양한다. 여러 변압제에서 플라스미드 DNA를 정화하고 U6프로모터(재료표)에서프라임하는 프라이머를 사용하여 Sanger 시퀀싱에 의한 gRNA 서열을 분석합니다.</li>
</ol>3. CRISPR 중재 기본 편집 도구를 사용하여 BRCA1 변형 생성
참고: HAP1-BE3 세포주가 사용되지 않으면 BE3-인코딩 플라스미드 DNA가 BRCA1-표적gRNA와 공동 으로 전염될 수 있습니다. BE3 및 gRNA 플라스미드의 공동 배회와 비교하여, HAP-BE3 세포에 gRNA 플라스미드의 트랜스포팅은 우리의 손에 있는 표적 궤적에서 최대 3배까지 효율적인 베이스 편집을 유도합니다.
<ol><li>종자 5 x 105 HAP1-BE3 세포 (또는 공동 형질 전환 방법의 경우 HAP1 세포) 24 웰 플레이트에서 잘 1 일 전에. 배양 세포가 적절한 밀도(70%-80% 합류)에 도달할 때 배양 세포.</li>
	<li>Transfect BRCA1-제조 업체의 프로토콜에 따라 구입 한 형질 전환 시약(재료의 표)을사용하여 gRNA를 타겟팅. BRCA1표적 사이트에서 C:G에서 T:A 변환을 유도하기 위해 BRCA1-targeting gRNA(공동 트랜스코딩 방법의 경우 BE3-인코딩 플라스미드 DNA의 1 μg)를 사용합니다. 3-4일마다 37°C및 하위 배양에서 세포를 배양합니다.</li>
	<li>세포 펠릿을 수확하여 염기 편집 효율을 분석하기 위해 전환 후 3일, 10 일 및 24일 동안 의질 편집 효율성을 분석합니다(전환 후 3일 이후의 샘플은 0일 샘플로 다시 분해되는 것으로 분석됩니다).</li>
	<li>유전체 DNA 정제 키트(재료표)를 사용하여 게놈DNA를 추출합니다. 참고: 시약의 가변 비율로 DNA에 대한 변액 비율로 형질 전환 조건을 최적화하는 것이 좋습니다. HAP1 트랜스페션에 대한 최적의 상태는 우리 손에 있는 DNA에 시약의 4:1 배급입니다.</li>
</ol>4. 일루미나 차세대 염기서열 분석(NGS)에 대한 샘플 준비
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig03.jpg"> 그림 3: 차세대 시퀀싱 준비. 1st PCR 프라이머는 게놈 DNA에 BRCA1 표적 사이트를 증폭하도록 설계되었습니다. 2nd PCR 프라이머는 시퀀스가 1st PCR 프라이머 시퀀스보다 내부에 더 많이 위치하도록 설계되었습니다. 2nd PCR 프라이머의 양쪽 끝에 노란색 막대로 표시된 추가 시퀀스가 추가되어 차세대 시퀀싱을 수행하기 위한 필수 시퀀스를 부착했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol><li>BRCA1 대상 사이트를 증폭하기 위해 1st PCR 프라이머를 디자인합니다. 1st PCR 제품의 크기에는 제한이 없지만 특정 영역(그림3)을효율적으로 증폭시키는 것이 좋습니다.</li>
	<li>1st PCR 제품 내부에 위치한 2nd PCR 프라이머를 디자인합니다. NGS 판독 길이에 따라 앰플리시온의 크기를 고려하십시오(예를 들어, 앰플리턴 제품의 크기는 각 읽기를 병합하기 위해 2 × 150bp 쌍끝 실행에 대해 300 bp보다 작아야 합니다). NGS 분석을 위한 필수 서열을 부착하기 위해, 다음과 같이 2nd PCR 프라이머의 5'끝에 추가 시퀀스를 추가 : 앞으로 프라이머에 대한, 5'끝에 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTTCCGATCT-3'시퀀스를 추가하고, 역 프라이머에 대한, 추가 5'GTGACTGGAGTTCAGACGGGTTTTTTTTTTCC TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 참고: 중첩된 PCR을 사용하여 프라이머가 비대상 시퀀스에 연결되지 않도록 하여 비특이적 결합의 앰플리턴을 줄입니다.</li>
	<li>3개의 시간 지점에서 얻은 게놈 DNA에 BRCA1 표적 사이트를 증폭시합니다. PCR 오류를 최소화하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 고충실도 폴리머라아제사용하십시오. 1st PCR 반응의 경우 15 사이클 에 걸쳐 증폭을 위해 게놈 DNA 100 ng를 사용하십시오. 2nd PCR 반응의 경우 1st PCR 제품의 1 μL을 사용하여 20사이클 이상 증폭하십시오. 2nd PCR 제품의 5 μL을 2% 아가로즈 젤에 실행하고 크기를 확인합니다.</li>
	<li>NGS 분석을 위한 필수 서열을 부착하기 위해 아래에 나열된 프라이머를 사용하여2nd PCR 제품을 증폭시합니다. PCR 반응의 경우,2nd PCR 제품의 1 μL은 고충실도 폴리머라제를 사용하여 최대 30사이클의 증폭에 사용된다.<ol>
<li>많은 라이브러리를 동시에 풀링하고 시퀀싱할 수 있도록 멀티플렉스 시퀀싱을 수행하려면 고유한 인덱스 시퀀스가 있는 앞으로(D501 – D508) 및 역(D701 – D712) 프라이머를 사용합니다(보충 표 1). 고유한 이중 인덱싱 전략을 수행하기 위해 서로 다른 프라이머 세트를 사용하여 각 샘플을 증폭합니다.</li>
		<li>PCR 제품의 5μL을 2% 아가로즈 젤에 실행하여 크기를 확인하고 상용 PCR 정리키트(재료 표)를사용하여 앰플리턴을 정화합니다. 각 샘플을 동일한 양으로 혼합하여 NGS 라이브러리를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분광광계를 사용하여 260 nm 파장에서 NGS 라이브러리를 정량화하고 반사 액수 버퍼 또는 10m Tris-HCl, pH 8.5를 사용하여 NGS 라이브러리를 1 nM의 농도로 희석한다. 라이브러리 유형에 따라 적절한 하중 농도로 희석된 라이브러리의 100 μL을 준비합니다(예를 들어, Nextera DNA Flex용 라이브러리의 200pM준비).<ol>
<li>컨트롤로, 키트의 유형에 적합한 희석 된 샘플과 phiX를 결합합니다.</li>
		<li>라이브러리를 카트리지에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 NGS를 실행합니다. 일루미나 iSeq 100 또는 Miseq 시스템은 단일 읽기 또는 페어링 엔드에 대해 최대 300bp의 다양한 길이의 앰플리컨을 시퀀스할 수 있습니다. 기본 편집 효율을 심층 분석하기 위해 대상 앰플리턴당 10,000개 이상의 읽기를 권장했습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. BRCA1 변종의 기능 성 평가를 위한 기본 편집 효율 분석
<ol><li>MAUND24를사용하여 기본 편집 효율성을 분석합니다. 기본 편집 효율은 아래에 설명된 대로 계산됩니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61557/61557equ01.jpg"> 여러 사이토신이 BE3 활성 창에 존재하는 경우 BRCA1 변종을 평가하기 위한 C ~ T 변환만 고려됩니다. 예를 들어, BE3 활성 창의 시퀀스가 "C4A5T6C7T8,"기본 편집에 의해 생성된 가능한 시퀀스는 "T 4 A 5 T 6 C 7 T8","C4A5T6T7T T 8", "T 4 A 5 T6T7T8","T4A5T 6 T7TT 8"이다. 이때, 위치 4가 원하는 BRCA1 변종에 대한 표적 위치인 경우, "T4A5T6C7T8"시퀀스만 기본 편집 효율을 계산하는 것으로 간주됩니다. 참고: CRISPResso2 25 및 BE분석기(23)와같은 기본 편집 활동을 분석하기 위해 다른 웹 도구도 추천합니다.</li>
	<li>BRCA1 변종의 양수 및 음수 제어를 사용하여 결과를 확인합니다. 양성 제어의 기본 편집 효율성은 동일하게 유지되어야하는 반면 병원성 제어의 효율성은 시간이 지남에 따라 감소해야합니다.</li>
	<li>BRCA1 변종의 상대적 기본 편집 효율을 계산하고 병원성을 결정합니다. 0일째와 21일 샘플 간의 유의한 차이는 t-test와같은 적절한 통계 분석을 분석합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+and+BRCA2%3A+different+roles+in+a+common+pathway+of+genome+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).</li>
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<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine%2C+but+not+adenine%2C+base+editors+induce+genome-wide+off-target+mutations+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice.</a> Science. 364 (6437), 292-295 (2019).</li>
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<li>Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+minimization+of+Cas9-independent+off-target+DNA+editing+by+cytosine+base+editors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evaluation and minimization of Cas9-independent off-target DNA editing by cytosine base editors.</a> Nature Biotechnology. 38 (5), 620-628 (2020).</li>
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<li>Anzalone, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Search-and-replace+genome+editing+without+double-strand+breaks+or+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.</a> Nature. 576 (7785), 149-157 (2019).</li>
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이 프로토콜은 CRISPR 명상 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변종의 기능 평가를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 표적 궤적에서 gRNA의 설계 및 그들이 표현되는 플라스미드 DNA의 시공에 대한 방법을 설명합니다. Cytosine 염기 편집기는 활성 창에서 뉴클레오티드 변환을 유도합니다(BE3의 경우, 뉴클레오티드 4-8gRNA 표적 서열의 PAM-말단 말단에서). 활성 창에 있는 모든 사이토신은 백분으로 대체할 수 있기 때문에 연구원은 신중하게 표적 순서를 선택해야 합니다. 더욱이, 5단계에서 설명한 바와 같이, 활성 창내의 다중 사이토신은 BRCA1 변종의 기능을 평가하기 위해 신중하게 분석되어야 한다.
가장 중요한 단계 중 하나는 BRCA1 기능 성 평가를 위한 초기 돌연변이 주파수에 영향을 미치는 표적 세포주에서 의 질염입니다. 초기 돌연변이 빈도를 향상시키기 위해, 연구원은 관심있는 세포주에 ...

유방암 제1형 감수성유전자(BRCA1)는널리 알려진 종양 억제유전자이다. BRCA1 유전자는 DNA 손상의 복구와 관련이 있기 때문에, 이 유전자에 있는 돌연변이는 개별1에있는 암 발달의 더 중대한 리스크로 이끌어 낼 것입니다. 유방, 난소, 전립선 및 췌장암은 BRCA1 유전자2의승계된 기능 상실 (LOF) 돌연변이에 연결됩니다. BRCA1 변이체의 기능적 평가 및 식별은 다양한 질병을 예방하고 진단하는 데 도움이 될 수 있습니다. BRCA1 변이체의 기능을 해결하기 위해, 배아 줄기 세포 생존성 감수제, 형광 기자 감수제 및 치료약물 기반 감도 감수제3,4,5,6과같은 BRCA1 변종의 병원성을 조사하기 위해 여러 가지 방법이 개발되고 광범위하게 사용되고 있다. 이러한 방법은 BRCA1 변이체의 많은 기능을 평가했지만, 외인성 발현 BRCA1 변이체를 포함하는 방법은 다운스트림 조절, 유전자 투여량 및 단백질 접이식7에영향을 미칠 수 있는 과발현 측면에서 한계를 제기한다. 더욱이, 이러한 소하는 mRNA 접합, 성적증명서 안정성, 번역되지 않은영역8,9의효과와 같은 전사 후 조절에 활용될 수 없다.
CRISPR-Cas9 시스템은 살아있는 세포 및 유기체10에서표적 게놈 편집을 가능하게 합니다. 단일 가이드 RNA를 통해 Cas9는 두 가지 DNA 수리 경로를 활성화하기 위해 특정 게놈 로맥에서 염색체 DNA에서 이중 가닥 브레이크(DSBs)를 유도하여 오류 발생하기 쉬운 비homologous 엔드 결합(NHEJ) 경로 및 오류 없는 homology 지향 수리(HDR)경로(HDR)경로를 활성화할 수 있다. HDR은 정밀한 수리 메커니즘입니다. 그러나, HDR에 대 한 Cas9 핵에 의해 유도 된 DSBs 종종 원치 않는 삽입 및 삭제 결과 (indel) 돌연변이. 추가적으로, DNA 손상을 복구하기 위한 동종 기증자 DNA 템플릿이 필요하고 상대적으로 낮은 효율성을 가지고 있습니다. 최근에는, Cas9 니카아제(nCas9)는 C:G ~T:A 대체를 대상으로 하는 시티딘 데아미나제 도메인과 융합되어 왔으며, 동종 DNA 템플릿및 DNA 이중 가닥 브레이크12,13,14,15에대한 필요 없이. 시토신 베이스 에디터를 사용하여 BRCA1변종(16)의기능적 분석을 위한 새로운 방법을 개발했습니다.
본 연구에서는, CRISPR 매개 사이토신 베이스 에디터, BE314를사용했는데, 이는 효율적인 C:G를 T:A 포인트 돌연변이로 유도하고, BRCA1 변이체의 기능적 평가를 구현하고 여러 BRCA1 변종의 기능을 성공적으로 식별하였다(그림1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61557/61557fig01.jpg"> 그림 1: 기능 평가를 위한 워크플로에 대한 개요입니다. (A) BRCA1의기능성 평가를 보여주는 회로도. BRCA1의 LOF는 세포 생존에 영향을 미치기 때문에 BRCA1 돌연변이가 병원성일 때, 세포는 통로 수가 증가함에 따라 죽는다. (B) BRCA1의기능성 평가 단계 . 점선 상자는 선택 사항입니다. 그것은 plasmids DNA를 표현하는 gRNA 표현 및 BE3의 공동 형질으로 대체 될 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61557/61557fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113903</td><td>형질도입 세포 선택을 위한 약물</td></tr><tr><td>BsaI</td><td>NEB</td><td>R0535</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>게놈 DNA 준비 키트</td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 매체</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>HEK293T/17 세포용 배지</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>16000036</td><td>세포 배양을 위한 유연한 금속</td></tr><tr><td>FuGENE HD 형질주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>형질주입 시약</td></tr><tr><td>Gibson 어셈블리 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Gibson 어셈블리 키트</td></tr><tr><td>Iscove' s 수정된 Dulbecco' s 매체</td><td>Gibco</td><td>12440046</td><td>HAP1 세포용 배지</td></tr><tr><td>lentiCas9-Blast</td><td>Addgene</td><td>52962</td><td>Llasmids DNA for lentiBE3 cloning</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td>Transfection 시약</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>Transfection materials</td></tr><tr><td>pCMV-BE3</td><td>Addgene</td><td>73021</td><td>Plasmids DNA for lentiBE3 cloning</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>세포 배양을 위한 Supplemetal</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530SQ</td><td>High-fidelity polymerase</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>바이러스 준비를 위한 플라스미드 DNA.</td></tr><tr><td>pRG2</td><td>Addgene</td><td>104174</td><td>gRNA 클로닝 벡터</td></tr><tr><td>psPAX2 Addgene</td><td></td><td>12260</td><td>바이러스 준비를 위한 플라스미드 DNA.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Plasmid DNA prep. Kit</td></tr><tr><td>QIAquick Gel extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Gel extraction kit</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR product prep. kit</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>NEB</td><td>M2200</td><td>Ligase for gRNA cloning</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Materials T7E1 분석용</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td>제한 효소</td></tr></tbody></table>

crispr 중재 베이스 편집기사용 brca1 변종 기능 평가

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

최근 연구는 형광 기자 의 소사, 배아 줄기 세포 생존 가능성 연구, 치료 약물 기반 감도 검사와 같은 다양한 기능성 평가 방법을 사용하여 BRCA1 유전자 돌연변이와 관련된 위험을 조사했습니다. 그들은 BRCA1 변종을 많이 명확히했지만, 외인성 발현 BRCA1 변종의 사용을 포함하는 이러한 소는 과발현 문제와 관련이 있으며 전사 후 규제에 적용 할 수 없습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 이전에 살아있는 세포에서 표적 뉴클레오티드 대체를 유도하는 CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 통해 BRCA1 변이체의 기능적 분석을 위한 방법을 보고했습니다. 이 방법을 사용하여 c.-97C>T, c.154C>T, c.3847C>T, c.5056C>T, c.4986+5G>A 등 기능이 모호한 변종을 확인했으며 CRISPR 미디어 베이스 에디터가 BR1의재분류 에 유용한 도구임을 확인했습니다. 여기에서 CRISPR 기반 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변종의 기능 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대상 사이트 선택, 기능 분석 및 BRCA1 변형 평가에 대한 지침을 제공합니다.

이 프로토콜에 설명된 실험 적 접근은 CRISPR 기반 사이토신 베이스 편집기에서 생성 된 내인성 BRCA1 변종의 기능적 평가를 가능하게합니다. BRCA1 변이체의 기능적 평가를 위한 적당한 세포주를 선택하기 위하여는, 연구원은 BRCA1이 표적으로 한 세포주에서 필수적인 유전자이다는 것을 확인해야 합니다. 예를 들어, 우리는 먼저 CAS9와 gRNA를 HAP1 세포주로 전환하여 BRCA1을 방해하고 표적 깊은 시퀀싱에 의해 돌연변이 주파수를 분석했습니다. 우리는 HAP1 세포주에서 시간이 지남에 따라 돌연변이 주파수가 현저히 감소한다는 것을 발견했습니다(그림 4A). 이러한 결과는 BRCA1이 HAP1 세포주에서 세포 생존가능성을 위한 필수적인 유전자임을 보여주었습니다. C:G ~T:A 대체 변이체가 BRCA1의기능에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 각 돌연변이를 유도할...

BRCA1 돌연변이를 가진 사람들은 BRCA1 변이체의 기능의 정확한 평가를 보증하는 암 발전의 고위험이 있습니다. 본명, 우리는 살아있는 세포에서 표적 C:G ~T:A 변환을 가능하게 하는 CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변이체의 기능적 평가를 위한 프로토콜을 기술했습니다.

CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 포인트 돌연변이를 효율적으로 유도함으로써 질병 예방 및 진단에 중요한 BRCA1 변이체의 기능을 식별할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 발성된 BRCA1을 직접 돌연변이시키는 것으로, 이는 외인성 발현 BRCA1을 사용하여 기능성 평가의 한계를 극복한다는 것이다. BRCA1의 기능 돌연변이의 손실의 확인은 유방, 난소, 전립선 및 췌장암과 같은 BRCA1 돌연변이와 관련되었던 암발전의 기회를 예측하기 위하여 이용될 수 있습니다.그것은 또한 그의 생존능력이 기능고갈을 통해 감소되는 필수 유전자를 찾아서 잠재적인 약 표적을 찾아내기 위해 이용될 수 있습니다. 우선, NCBI의 GenBank로부터 BRCA1 게놈 서열을 획득하고 관심의 돌연변이 를 중심으로 프로토스페이서 인접 모티프 서열인 NGGNCCN을 사용하여 20개의 기본 쌍 표적 부위를 검색한다. 관심의 돌연변이는 가이드 RNA 표적 서열의 PAM-말단에서 4~8개의 뉴클레오티드 내에 위치해야 한다.가이드 RNA당 2개의 무료 올리고뉴클레오티드를 주문하십시오. 전방 올리고뉴클레오티드의 경우, 가이드 서열의 5엔드에 CACCG를 추가하고 역방향 올리고뉴클레오티드에 대해 AAC를 5엔드와 C에 3엔드에 추가한다. 올리고뉴클레오티드를 받은 후 증류수에서 100 마이크로몰라의 최종 농도로 재보종한다.두 개의 무료 올리고뉴클레오티드를 T4 계합 버퍼와 10 마이크로몰라의 최종 농도에 혼합하고 5 분 동안 섭씨 95도로 가열 한 다음 어닐링을위해 실온으로 냉각하십시오. pRG2를 사용하여 섭씨 37도에서 1시간 동안 PSa1을 소화한 다음, 소화된 제품을 1%의 아가로즈 젤로 실행하고 적절한 크기의 대역을 정화합니다. 제조 자의 프로토콜에 따라 구입 한 DNA 리개아제를 사용하여 벡터 DNA에 아닐드 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 리게이트하고 DH5 알파 유능한 세포로 변환합니다.밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램이 들어 있는 한천 접시에 변압제를 넣고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 여러 변압제에서 플라즈마 DNA를 정화하고 Sanger가 U6 프로모터에서 프라임프라이머로 시퀀싱하여 가이드 RNA 서열을 분석합니다. 종자 5회 10-5회 HAP1-BE3 세포는 1일 전 24웰 플레이트에서 24웰 플레이트에서 70~80%의 결합에 도달한다.Transfect BRCA1 타겟팅 가이드 RNA 는 제조업체의 프로토콜에 따라 구입한 트랜스페트 시약을 사용한다. BRCA1 표적 가이드 RNA의 마이크로그램 1개를 사용하여 BRCA1 대상 사이트에서 CG를 TA 변환으로 유도한 다음 3~4일마다 섭씨 37도및 하위 배양에서 세포를 배양합니다. 세포 펠릿을 3, 10 및 24일 동안 수확하여 기본 편집 효율성을 분석합니다.게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다. BRCA1 대상 사이트를 증폭하기 위해 최초의 PCR 프라이머를 디자인합니다. 첫 번째 PCR 제품의 크기에는 제한이 없지만 특정 영역을 효율적으로 증폭하려면 1킬로베이스 미만의 제품 크기가 권장됩니다.NGS 판독 길이에 따라 앰플리톤의 크기를 고려하여 제1 PCR 제품 내부에 위치한 두 번째 PCR 프라이머를 디자인합니다. NGS 분석에 필수적인 시퀀스를 부착하려면 두 번째 PCR 프라이머의 5'끝에 추가 시퀀스를 추가합니다. 고충실도 폴리머라제를 사용하여 3시간 지점에서 얻은 게놈 DNA상 BRCA1 표적 부위를 증폭한다.첫 번째 PCR 반응에 대 한, 사용 100 100 15 주기 에 걸쳐 증폭에 대 한 게놈 DNA의 나노 그램. 두 번째 PCR 반응의 경우 20사이클 이상의 증폭을 위해 첫 번째 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 사용하십시오. 2%아가로즈 젤에 제2 PCR 제품의 마이크로리터 5기를 실행하고 크기를 확인합니다.그런 다음 텍스트 원고에 나열된 프라이머를 사용하여 제2 PCR 제품을 증폭하여 NGS 분석을 위한 필수 서열을 부착합니다. 서로 다른 프라이머 세트를 사용하여 각 샘플을 증폭시합니다. 고충실도 폴리머라제로 최대 30사이클의 증폭을 위해 제2 PCR 제품의 마이크로리터 1개를 사용하십시오.PCR 제품의 마이크로리터 5척을 2%의 아가로즈 젤에 사용하여 상용 PCR 정리 키트를 사용하여 크기를 확인하고 앰플리턴을 정화합니다. 각 샘플을 동일한 양으로 혼합하여 NGS 라이브러리를 만듭니다. 분광계를 사용하여 NGS 라이브러리를 정량화하고 pH 8.5에서 재서스펜션 버퍼 또는 10 밀리머 트리-HCl을 사용하여 1 나노 몰러의 농도로 희석한다.적절한 적재 농도로 희석된 라이브러리의 마이크로리터 100개를 준비합니다. 대조군으로서 PhiX를 희석된 시료와 결합하였다. 라이브러리를 카트리지에 로드하고 제조업체의 프로토콜에 따라 NGS를 실행합니다.기본 편집 효율을 심층 분석하기 위해 대상 앰플리턴당 10개, 000개 이상의 읽기를 얻습니다. 이 프로토콜은 CRISPR 기반 사이토신 베이스 편집기에서 생성된 내인성 BRCA1 변종의 기능적 평가를 수행하는 데 사용되었습니다. CAS-9 및 가이드 RNA는 BRCA1을 방해하기 위해 HAP1 세포주로 전염되었고, 돌연변이 주파수를 분석하였다.돌연변이 주파수는 HAP1 세포주에서 시간이 지남에 따라 현저하게 감소, BRCA1이 세포에서 세포 생존을위한 필수적인 유전자임을 나타내는. CG에서 TA 대체 변이체가 BRCA1의 기능에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해 각 돌연변이를 유도할 수 있는 DNA 플라스미드 및 코딩 가이드 RNA는 HAP1-BE3 세포주를 갖는 것으로 감염되었다. 그리고 대체 주파수를 분석했다.3598C에서 T까지의 상대적 대체 주파수는, 말도 안되는 돌연변이를 유도하는 병원성 이체, 극적으로 감소하였다. 4527C에서 T에 대한 반면, 말도 안되는 돌연변이를 유발하는 양성 변이체는 시간과 비슷한 상태를 유지했습니다. 이 세 가지 변이체의 뉴클레오티드 치환 주파수가 시간 의존적인 방식으로 감소하는 것으로 나타났다.날짜의 경과와 함께 세포 생존가능성의 변화를 명확하게 인식하기 위해서는 높은 초기 돌연변이 주파수를 얻을 필요가 있기 때문에 최적화된 전환 조건을 확립하는 것이 우선이다. 이 절차는 BRCA VUS와 같은 그밖 알려지지 않은 유전 이체를 확인하기 위해 적용될 수 있습니다. 그것은 환자 파생 된 알 수 없는 이체및 그들의 처리의 병원성에 단서를 제공할 수 있습니다.

functional-assessment-brca1-variants-using-crispr-mediated-base

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 RNAi를 사용하여 세포의 내생 BRCA1 단백질을 파괴하고 코딩 변경을 포함하는 BRCA1 포인트 돌연변로 대체하여 DNA 손상의 동종 재조합의 수리를 위해 조직 문화를 기반으로 분석에서 BRCA1 변종을 테스트하기위한 방법을 제공합니다.

내생 와일드 타입 BRCA1을 표현 세포를 사용하는 동종 재조합에 BRCA1 변이의 효과를 확인

이 동영상은 CRISPR-Cas9을 사용하여 게놈이 변형된 형질전환 초파리 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9은 과학자들이 유기체의 게놈을 조작하는 방식에 혁명을 일으킨 강력한 게놈 편집 도구입니다. 예제 프로토콜에서는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 확인할 수 있으며, 여기서 transactivation sequence의 삽입은 branchless(bnl) 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하여 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인인 bnl-LexA를 생성합니다.

유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

이 동영상은 표적 뉴클레오티드 치환을 유도하기 위한 CRISPR 매개 사이토신 염기 편집기의 개념을 설명합니다.

CRISPR 매개 염기 편집 도구: 표적 염기 치환을 유도하는 게놈 편집 기술

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

이 프로토콜의 목표는 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체와 스크리닝을 위한 dpy-10 공동 CRISPR 마커를 사용하여 C. elegans 게놈의 원활한 CRISPR/Cas9 편집을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 삽입, 삭제, 유전자 대체 및 코돈 대체를 포함하여 C. elegans에 있는 유전 수정의 각종을 만들기 위하여 이용될 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

이 프로토콜은 zSpRY-ABE8e를 사용하여 정확한 제브라피쉬 질병 모델을 구성하기 위해 PAM 제한 없이 효율적인 아데닌 염기 편집을 수행하는 방법을 설명합니다.

zSpRY-ABE8e를 사용한 인간 유전 질환의 Zebrafish 모델링을 위한 효율적인 PAM 없는 염기 편집

CRISPR과 같은 기술의 주요 장벽은 중요한 유전자를 파괴할 수 있는 off-target 이벤트입니다. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing'(CIRCLE-seq)은 의도하지 않은 절단 부위를 식별하기 위해 고안된 기술입니다. 이 방법은 CRISPR-Cas9의 게놈 전체 활성을 높은 감도로 편향 없이 매핑합니다.

off-target 유전자 편집에 대한 조사를 위한 CIRCLE-Seq

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

학습하세요 CRISPR 매개 시토신 베이스 편집기를 이용한 BRCA1 변종 기능 평가 방법을. 내인성 BRCA1을 직접 변형하여 암 위험 예측과 약물 표적 발굴에 활용할 수 있습니다.

CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가

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