Name: 뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 유동 세포 측정법을 이용하여 쥐의 B 세포 발달을 분석하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작된 마우스의 면역 세포 이형성을 연구하는 데 활용됩니다.

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원고를 비판적으로 읽어주신 매튜 슬리먼에게 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구를 지원해 준 Regeneron의 Vivarium 운영 및 플로우 세포측정 핵심 부서에 감사드립니다.

모든 마우스 연구는 Regeneron의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 감독되고 승인되었습니다. 이 실험은 잭슨 연구소에서 3개의 C57BL/6J 암컷 마우스(17주)에서 조직에 대해 수행하였다. 이상적인 농도를 결정하기 위해 실험을 시작하기 전에 모든 항체를 적중시한다. 단일 색상 보정을 위해 보상 구슬을 사용할 때 샘플보다 밝거나 밝은 얼룩이 있는지 확인하십시오. 모든 완충제, 항체 및 세포를 얼음 또는 4°C로 유지합니다. 생존 성 염료를 추가 한 후, 저조도 또는 어둠 속에서 4 ° C에서 모든 단계와 인큐베이션을 수행합니다.
1. 회간 세포 수확 및 단일 세포 격리
<ol><li>CO2또는 승인된 프로토콜에 따라 마우스를 안락사시합니다.
</li>
	<li>마우스를 등에 놓고 70% 에탄올로 스프레이하고 복막을 자르지 않도록 주의하면서 가위로 바깥복부 피부를 잘라냅니다.</li>
	<li>DPBS [vol/vol]에 3mL의 얼음 냉세척 버퍼(0.5% 소 세럼 알부민(BSA)를 복막 구멍에 주입하여 25게이지 바늘이 장착된 3mL 주사기로 복막 구멍에 넣습니다.</li>
	<li>손끝으로 회대를 부드럽게 마사지하세요.</li>
	<li>1.3 및 1.4 단계를 반복합니다.</li>
	<li>회리수통을 통해 18G 바늘이 장착된 3mL 주사기를 삽입하여 장기와 지방을 피하십시오.</li>
	<li>지금 하중 세포를 포함하는 세척 버퍼를 추출하고 얼음에 15 mL 원뿔 튜브로 전송.</li>
	<li>1.3 및 1.4 단계를 반복합니다.</li>
	<li>핀셋을 들고 있는 동안 회리음의 작은 구멍을 잘라냅니다.</li>
	<li>일회용 이송 파이펫을 구멍에 삽입하고 남은 세척 버퍼를 수집하여 지방과 장기를 다시 피하십시오.</li>
	<li>수집된 잔류 세포를 얼음 위에 있는 15mL 원뿔관으로 이송한다. 참고: 혈액 오염이 명백한 경우 샘플을 폐기하십시오.</li>
	<li>비장과 뼈 추출이 완료될 때까지 얼음에 세포를 배양합니다.</li>
	<li>4°C에서 8분 동안 300 x g 의 세포 원심분리기. 상체를 흡인합니다.</li>
	<li>세척 버퍼의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 깨끗한 15mL 원피스 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>세포 카운터 기기 또는 혈혈계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.</li>
</ol>2. 비장 수확 및 단일 세포 격리
<ol><li>마우스를 배에 놓고 깨끗한 가위를 사용하여 왼쪽 뒤쪽의 복막을 잘라냅니다. 비장을 잘라 지방과 결합 조직을 제거합니다.</li>
	<li>비장을 얼음 에 1 mL의 세척 버퍼를 포함하는 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.</li>
	<li>뼈 추출이 완료될 때까지 비장을 얼음에 배양합니다.</li>
	<li>적혈구 용해 버퍼의 5 mL로 자동 해리 튜브로 비장을 이동합니다. 튜브를 조직 해리기 기기에 놓고 60s용 해리를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 참고: 세척 버퍼에서 서리가 내린 유리 슬라이드 사이를 분쇄하는 것과 같은 단일 셀 비장 현탁액을 얻는 다른 일상적인 방법을 사용하는 것도 허용됩니다. 다른 해리 방법이 사용되는 경우, 2.5 단계로 계속하기 전에 적혈구 용해 완충제의 5 mL에서 원심 분리, 포부 및 재발과 함께 해리를 따르십시오.</li>
	<li>3 분 동안 실온에서 세포를 배양.</li>
	<li>2mM EDTA를 포함하는 4 °C 세척 버퍼의 10 mL을 추가합니다.</li>
	<li>깨끗한 15mL 원물 튜브로 옮김합니다.</li>
	<li>4°C에서 8분 동안 300 x g 의 세포 원심분리기. 상체를 흡인합니다.</li>
	<li>4°C 세척 버퍼의 5mL에서 셀 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 깨끗한 15mL 원피스 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>세포 카운터 기기 또는 혈혈계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.</li>
</ol>3. BM 수확 및 단일 세포 격리
<ol><li>마우스 본체의 하반부에서 피부를 제거합니다. 다리에서 여분의 근육을 손질. 대퇴골을 자르지 않도록 주의하면서 가위로 다리 전체를 제거합니다. 남은 근육, 지방 및 발을 제거하여 대퇴골과 경골을 청소하십시오.</li>
	<li>뼈를 얼음 에 1 mL의 세척 버퍼를 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.</li>
	<li>0.5mL 마이크로센심분리기 튜브의 바닥을 천공하여 다리 뼈가 돌출되지 않을 정도로 작은 구멍을 남깁니다. 0.5 mL 튜브를 깨끗한 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 삽입합니다. 대퇴골과 경골 근위가 무릎에 스니핑하고 0.5 mL 튜브로 아래로 향하는 컷 끝을 놓습니다.</li>
	<li>4°C에서 2분 동안 6,780 x g 의 세포 원심분리기.</li>
	<li>적혈구 리시스 완충제의 1mL에서 세포 펠릿을 재연하고 적혈구 리시스 완충제의 추가 3mL를 포함하는 15 mL 원상관으로 이송한다.</li>
	<li>실온에서 3분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>2mM EDTA를 포함하는 4 °C 세척 버퍼의 10 mL을 추가합니다.</li>
	<li>4°C에서 8분 동안 300 x g 의 세포 원심분리기. 상체를 흡인합니다.</li>
	<li>4°C 세척 버퍼의 3mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>70 μM 셀 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 깨끗한 15mL 원피스 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>세포 카운터 기기 또는 혈혈계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.</li>
</ol>4. 스테인 셀 및 보상 준비
<ol><li>각 동물에서 96 웰 U 바닥 플레이트에 각 세포 유형의 Aliquot 106 세포.<ol>
<li>전체 얼룩, 형광 -마이너스 - 원 (FMO), 얼룩이없는, 마지막으로 사용되는 각 형광에 대한 선택적 단일 색상 보상을 포함하여 모든 샘플 및 컨트롤에 대한 충분한 우물을 포함해야합니다.</li>
		<li>BM 성숙 패널 및 비장 성숙 패널의 경우, 각 전체 얼룩 샘플에 대해 2 개의 우물, 106 개의 세포로 알리쿼트 세포를 넣습니다. 단일 색상 보정 실행 가능성 컨트롤의 경우 각 셀 유형의 2 x 106 셀을 개별 우물에 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4 °C에서 2 분 동안 845 x g 에서 플레이트를 원심 분리합니다. 재빨리 접시를 뒤집어 싱크대에 쓸어 넘기고 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의함으로써 상체를 제거합니다.</li>
	<li>DPBS의 200 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다(BSA 또는 FBS 제외). 이 단계는 아민 반응성 생존성 염료로 염색하기 전에 단백질을 제거하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>4.2 및 4.3 단계를 반복합니다.</li>
	<li>4.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>DPBS에서 1:1,000을 희석한 100 μL 생존성 염료에서 세포를 다시 중단합니다. 참고: 단일 색상 보정을 위해 셀을 사용하는 경우 해당 우물에 생존 성 염료를 추가하지 마십시오.<ol>
<li>각 얼룩 세트에 대해 완전히 얼룩지지 않은 샘플과 필요할 수 있는 기타 컨트롤에 대해 얼룩이 없는 여러 우물을 남겨 둡니다.</li>
		<li>각 얼룩 세트에 대해 생존 가능성 FMO 제어를 위해 추가미염색을 잘 남깁니다.</li>
		<li>단일 색상 생존 가능성 보정 컨트롤: 2x 106 셀을 다시 일시 중단, 단계 4.1에서 알리인용, 200 μL에서 희석 된 생존 성 염료. 세포의 100 μL을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고, 65°C에서 5분 동안 열세포를 가열하고, 100 μL의 살아있는 세포를 본래우물로 다시 이송한다.</li>
	</ol></li>
	<li>4°C에서 세포를 30분 동안 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>4 °C에서 2 분 동안 845 x g 에서 플레이트를 원심 분리합니다. 재빨리 접시를 뒤집어 싱크대에 쓸어 넘기고 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의함으로써 상체를 제거합니다.</li>
	<li>DPBS의 200 μL에서 세포를 다시 일시 중지합니다(BSA 또는 FBS 제외).</li>
	<li>4.8 및 4.9 단계를 반복합니다.</li>
	<li>4.8 단계를 반복합니다.</li>
	<li>분동블록의 50μL에서 세포를 스테인 버퍼(DPBS에서 0.5% BSA[vol/vol])로 희석하였다.<ol>
<li>회중 세포의 경우 - 또한 비특이적 얼룩을 줄이기 위해 5 μL의 단핵 차단제를 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4°C에서 세포를 배양하여 빛으로부터 보호하여 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>106셀당 100 μl의 최종 부피를 위해 얼룩 버퍼에 전체 얼룩 마스터 믹스와 FmOs를 준비합니다. 항체 목록에 대한 표 1 표 4를 참조하십시오. 참고: FmOs는 모든 항체를 얼룩 세트에 포함시킴으로써 만들어집니다. 얼룩 세트에 각 항체에 대한 FMO를 준비합니다. 얼룩 세트에 여러 개의 화려한 염료가 포함되어 있는 경우, 샘플당 얼룩 버퍼에 대한 50 μL의 화려한 얼룩 버퍼를 대체합니다.</li>
	<li>Fc 블록을 제거하지 않고 선택한 우물에 전체 얼룩 믹스와 FmOs 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>얼룩 세트의 각 항체에 대한 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다.<ol>
<li>보상 구슬을 사용하는 경우 사용시 제조의 지시를 따릅니다.</li>
		<li>세포를 사용하는 경우, 100 μL 얼룩 버퍼에서 생존 성염없이 4.6.1 단계에서 이전에 예약 된 106 세포에 적정 항체를 추가하십시오. 시료의 모든 세포가 특정 마커에 대해 양성인 경우, 유동 세포계에 대한 보상 데이터를 획득할 때 사용할 스테인드되지 않은 세포를 따로 둡니다.</li>
	</ol></li>
	<li>세포와 구슬을 빛으로부터 보호하여 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에서 2 분 동안 845 x g 에서 플레이트를 원심 분리합니다. 재빨리 접시를 뒤집어 싱크대에 쓸어 넘기고 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의함으로써 상체를 제거합니다.</li>
	<li>얼룩 버퍼의 200 μL에서 셀과 구슬을 다시 중단합니다.</li>
	<li>4.18 및 4.19 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>4.18 단계를 반복합니다.</li>
	<li>48h 내의 분석을 위해 샘플을 수정하려면 DPBS에서 2 % 파라 포름알데히드의 200 μL에서 세포와 구슬을 재일시 중단합니다. 주의: 파라포말데히드는 심각한 건강 상의 위험과 인화성입니다. 사용하기 전에 Safty 데이터 시트를 참조하십시오.</li>
	<li>세포와 구슬을 빛으로부터 보호하여 4°C에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4.18 및 4.19 단계를 두 번 반복합니다.</li>
	<li>필터 플레이트를 깨끗한 96 개의 U-바닥 플레이트 위에 놓습니다. 멀티 파이펫을 사용하여 각 샘플을 필터 플레이트의 우물로 옮기습니다.</li>
	<li>원심분리기 필터 플레이트-96 U-바닥 플레이트 셋업 845 x g 에서 2분 동안 4°C. 필터 플레이트를 제거하고 신속하게 반전하고 싱크대에 접시를 가볍게 하여 상체를 데칭, 우물을 교차 오염하지 않도록주의.</li>
	<li>BM 및 비장 성숙 패널의 경우 얼룩 버퍼의 100 μL에서 완전히 얼룩진 세포를 재연합니다. 각 동물의 2개의 우물을 1개의 우물로 잘 섞습니다. 나머지 패널, FmOs 및 컨트롤을 200μL의 얼룩 버퍼로 다시 일시 중지합니다.</li>
	<li>4°C에서 고정 셀과 구슬을 배양하여 밤새 빛으로부터 보호합니다.</li>
</ol>5. 흐름 세포 측정 데이터 수집
<ol><li>제조업체 지침에 따라 흐름 사이토미터를 초기화하고 QC를 지정합니다.</li>
	<li>각 패널에 대해 템플릿을 특정로드합니다.</li>
	<li>데이터를 기록하기 전에 각 샘플의 모든 이벤트가 크기가 조정되고 점 플롯에 표시되는지 확인합니다.</li>
	<li>4.16 단계에서 준비된 단일 얼룩 보정을 사용하여 각 얼룩 패널에 대한 보상 컨트롤을 기록합니다. 각 샘플에 대해 양수 및 음수 게이트를 설정합니다. 소프트웨어가 보상 행렬을 계산합니다.</li>
	<li>첫 번째 샘플을 획득하기 시작하고 게이트가 적절하게 설정되었는지 확인합니다.</li>
	<li>간막 B 세포 패널및 비장 Igθ 및 Igλ 패널에 대한 적어도 50,000 B 세포 이벤트를 기록하도록 기계를 설정; BM 성숙 패널을 위한 150,000 B 세포 이벤트; 및 비장 성숙 패널에 대한 300,000 B 세포 이벤트.</li>
	<li>각 얼룩 패널에 대해 각 동물, 스테인드되지 않은 샘플 및 FmOs에 대해 완전히 얼룩진 샘플을 실행하고 기록합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>유동 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행합니다. 그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4에 설명된 게이팅 전략을 따르십시오. 
</li>
</ol>

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모든 저자는 Regeneron 제약, Inc.의 직원 및 주주입니다.

림프및 비 림프구 조직의 흐름 세포 분석은 1980 년대 이후 마우스와 인간에서 B 세포 하위 집단의 동시 식별 및 열거를 가능하게했다. 그것은 유머 면역의 척도로 사용되었으며 B 세포 기능을 평가하기 위해 더 적용 할 수 있습니다. 이 방법은 희귀 한 집단에서도 B 세포 이질성의 평가를 가능하게하는 다중 매개 변수의 동시 분석을 통해 마우스와 인간에서 B 세포 성숙의 다른 단계를 평가하기 위해 시약 가용성을 활용합니다. 복잡한 이종성 샘플을 측정하는 데 사용되는 경우 개별 셀33에서 몇 분 안에 하위 집단을 감지할 수 있습니다. 흐름 사이토메트릭 분석에 가장 자주 적용되는 순차 적 게이팅 분석 전략은 특정 인구를 식별해야 할 때 간단하고 직관적일 수 있습니다34. 마지막으로, 흐름 세포 측정의 또 다른 장점은 숙련 된 사용자의 지도하에, 대부분의 학술 실험실에서 쉽게 적응 할 수 있다는 것입니다. 우리의 프로토콜은 성공적으로 B-1 인구를 설...

단일 클론 항체는 주류 의학의 일부가됨에 따라 점점 많은 인간 질환에 대한 선택 요법이되고있다1,2. 우리는 이전에 마우스 IgH constants3,4를 가진 완전히 인간 변수 지역을 항구하는 항체를 능동하게 생성하는 유전자 조작 마우스를 기술했습니다 3,4. 가장 최근에, 우리는 뚜렷한 항원 결합5가 있는 항체 같이 분자를 생성하는 유전자 조작한 마우스를 기술했습니다5. 항체는 B 세포에 의해 분비되고 적응성 유머 면역의 기초를 형성합니다. B 세포, B-1 및 B-2의 2개의 명백한 모형이 있습니다. 포유동물에서 B-1 세포는 태아 간에서 유래하고 출생 후 점막 조직및 흉막 및 복막 구멍에서 풍부하게 되며, B-2 세포는 출생 전 과 그 이후 골수 (BM)에서 태아 간에서 유래한다. B-2 세포는 비장 과 혈액6,7,8을 포함하여 이차 림프성 기관에서 농축된다. BM에서, B-2 조혈 선조는 Ig mu 무거운 사슬 재배열9,10의 개시에 프로 B 세포를 분화하기 시작합니다. Ig 중형 사슬과 조립을 사전 B세포 수용체(pre-BCR)로 성공적으로 재배열하여 시그널링 및 증식 확장과 함께 사전 B 세포로 분화합니다. 사전 B 세포가 Ig kappa(Igθ)를 재배열하거나 비생산적인 경우 Ig lambda(Igλ) 광 사슬을 재배열한 후 μ 무거운 사슬과 결합하여 표면 IgM BCR 발현이 발생합니다. IgM 표면 발현은 자가 반응성 조건하에서 감소되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 기능적으로 반응성이 없거나 식욕 부진 B cells11,12에서 자기 허용오차에 기여하는 것이 중요하다. 미숙한 B 세포는 전환 단계에 들어가서 IgD를 공동 발현하고 BM에서 비장으로 이동합니다. 비장에서, IgD 발현은 더 증가하고 세포는 과도기 B 세포의 두 번째 단계로 성숙하고, 그들의 성숙 상태 및 한계 영역 (MZ) 또는 여포 (Fol) 세포로 의 발달의 완료에 선행됩니다13,14,15. 성인 마우스에서, 비병 환경에서, 성숙한 B 세포의 수는 BM에서 매일 생성되고 10-20000,000,000미성숙 B 세포에도 불구하고 일정하게 남아 있습니다. 이 중 3%만이 성숙한 B 세포의 풀을 입력합니다. 말초 B 세포 구획의 크기는 세포 사멸에 의해 제한되며, 부분적으로자가 반응성 및 불완전한 성숙을 포함한 여러 가지 요인으로 인해 16,17,18. 유동 세포 측정 분석은 인간과 마우스에 있는 많은 면역 세포 하위 구획을 특성화하고 예매하기 위하여 광범위하게 이용되었습니다. 인간과 뮤린 B 세포 구획 사이에 는 몇 가지 유사점이 있지만,이 프로토콜은 뮤린 B 세포의 분석에만 적용됩니다. 이 프로토콜은 유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정하기 위해 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었습니다. 유동 세포측정은 또한 세포 활성화, 기능, 증식, 사이클 분석, DNA 함량 분석, 세포 분석, 세포 분류 19,20을 측정하는 등 많은 추가 응용 분야에서 큰 인기를 끌고 있다.
유동 세포측정은 비장, BM 및 혈액과 같은 복잡한 장기를 포함하여 마우스와 인간에서 다양한 림프구 구획을 특성화하는 데 선택하는 도구입니다. 유세포측정을 위한 마우스 특이적 항체 시약으로 인해, 이 기술은 세포 표면 단백질뿐만 아니라 세포내 인포단백질 및 사이토카인뿐만 아니라 기능적인 readouts21을 조사하는 데 사용될 수 있다. 본명 우리는 이차 림프구 기관에서 성숙하고 분화할 때 B 세포 하위 집합을 식별하는 데 어떻게 유동 세포 측정 시약을 사용할 수 있는지 보여줍니다. 염색 조건, 시료 처리, 올바른 계측기 설정 및 데이터 수집, 마지막으로 데이터 분석의 최적화 후, 마우스내 B 세포 구획의 포괄적인 유량 세포 측정 분석을 위한 프로토콜을 활용할 수 있다. 이러한 포괄적인 분석은 BM B-2 세포를 개발하는 것이 B220, CD43, BP-1, CD24, IgM 및 IgD22의 발현에 따라 다른 분획 (분수)으로 나눌 수 있는 하디와 동료에 의해 고안된 수십 년 된 명명율을 기반으로 합니다. Hardy 등., B220+ CD43 BM B 세포가 BP-1 및 CD24(30F1) 발현을 기준으로 4개의 하위 집합(분수 A-C')으로 세분화될 수 있는 반면, B220+ CD43-(dim to neg) BM B 셀은 이그3의 상이한 발현을 기반으로 3개의 하위 집합(분수 D-F)으로 해결할 수 있음을 보여주었다. 분수 A(pre-pro-B 세포)는 BP-1-CD24(30F1)-분수 B(초기 프로-B 셀)로 정의되며, 분수 C(초기 프로-B 셀)는 BP-1+ CD24(30F1)++, 및 분수 C(초기 BP-1)로 정의된다. 또한, 분수 D(사전 B 셀)는 B220+ CD43-IgM-B 세포로 정의되며, 분수 E(새로 생성된 B 셀, 미숙한 및 과도기의 조합)는 B220+ CD43-IgM+ B 세포 및 분수 F(성숙하고 재순환하는 B 셀)로 정의됩니다. 대조적으로, 비장에서 발견되는 순진한 B 세포의 대부분은 CD93, CD23 및 IgM의 발현에 따라 성숙한 (B220+ CD93-) B 세포 및 과도기 (T1, T2, T3) 세포로 나눌 수 있다. 성숙한 B 세포는 IgM 및 CD21/CD35의 발현에 기초하여 한계 영역 및 여포 서브세트로 해결될 수 있으며, 여포 서브세트는 그들의 IgM 및 IgD 표면 발현의 수준에 따라 성숙한 여포 타입 I 및 여포형 II B 세포 서브셋으로 더 나눌 수 있다24. 이러한 비장 B 세포 인구는 주로 Igθ 광 사슬을 표현합니다. 마지막으로, 태아 간에서 유래하고 성인 마우스의 복막 및 흉막 구멍에서 주로 발견되는 B-1 B 세포 인구는 문헌에 설명되어 있다. 이러한 회막 B 세포는 CD23 발현의 부족에 의해 이전에 설명된 B-2 B 세포와 구별될 수 있다. 그(것)들은 그 후에 B-1a 또는 B-1b 인구로 더 세분화됩니다, 전자는 CD5의 존재에 의해 정의되고 그것의 부재25에 의해 후자에 의해 정의됩니다. B-1 세포 선조는 태아 간에서 풍부하지만 성인 BM에서는 발견되지 않습니다. B-1a 및 B-1b 세포는 다른 선조에서 유래하는 동안, 둘 다 복막과 흉막 충치를 시드24. B-2 세포와는 달리, B-1 세포는 자기 재생이 유일하게 가능하고 천연 IgM 항체의 생산을 담당합니다.
B 세포 발달의 결함은 BCR26,27의 성분에 있는 결핍, BCR 신호 강도에 영향을 미치는 신호 분자의 동요 14,28,29, 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 중단을 포함하여 많은 경우에 생길 수 있습니다30,31 . 림프구의 유동 세포 분석은 이들 마우스 및 많은 다른 사람들의 B 세포 발달 블록의 특성화에 기여했다. 림프구의 유동 세포 분석의 한 가지 장점은 살아있는 해리 된 조직에서 얻은 개별 세포에 대한 측정을 할 수있는 능력을 제공한다는 것입니다. 형광의 계속 확장 범위에서 시약의 가용성은 다중 매개 변수의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게한다. 더욱이, 유동 세포측정 분석에 의한 B 세포의 열거는 림프구 기관 내에서 세포 국소화를 시각화하는 면역조직화학 방법, 유머 면역의 척도로서 순환 항체 수준을 검출하는 면역학적 분석, 그리고 실제 공간과 시간 32에서 B 세포 반응을 측정하는 2개의 광자 현미경 검사법과 같은 다른 면역학적 분석을 보완한다.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 안전 잠금 Eppendorf 튜브</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22363611</td><td>0.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>1.5mL Eppendorf 튜브&nbsp;</td><td>에펜도르프&nbsp;</td><td>22364111</td><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>15 mL Falcon 튜브&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>352097</td><td>15 mL 원뿔형 튜브</td></tr><tr><td>18 게이지 바늘</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305124</tr><tr><td>3 mL 주사기</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>70 mM MACS SmartStrainer&nbsp;</td><td>밀테니 바이오텍&nbsp;</td><td>130-110-916&nbsp;</td><td>70mM 세포 스트레이너</td></tr><tr><td>96 웰 U 바닥 플레이트&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액&nbsp;</td><td>지브코&nbsp;</td><td>A1049201</td><td>적혈구 용해 완충액</td></tr><tr><td>Acroprep Advance 96 웰 필터 플레이트</td><td>Pall Corporation</td><td>8027</td><td>필터 플레이트</td></tr><tr><td>B220</td><td>eBiosciences</td><td>17-0452-82</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Mouse Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552843</td><td>보상 구슬</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552844</td><td>보상 비즈</td></tr><tr><td>소 세럼 알부민</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>A8577</td><td>BSA</td></tr><tr><td>BP-1</td><td>BD</td><td>740882</td><td></td></tr><tr><td>브릴리언트 스테인 버퍼</td><td>BD</td><td>566349</td><td>브릴리언트 스테인 버퍼</td></tr><tr><td>C-Kit</td><td>BD</td><td>564011</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35</td><td>BD</td><td></td><td></td>562756</tr><tr><td>CD23&nbsp;</td><td>BD</td><td>740216</td><td></td></tr><tr><td>CD24 (HSA)</td><td>BioLegend</td><td>138504</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>561388</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100214</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BD</td><td>553270</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BioLegend</td><td>121206</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>BD</td><td>563194</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BD</td><td>740750</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BioLegend</td><td>136504</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>eBioscience 정착성 생존도 염료 eFluor 506</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td>생존도 염료</td></tr><tr><td>확장 미세 팁 전달 피펫</td><td>Samco</td><td>233</td><td>일회용 전달 피펫</td></tr><tr><td>FACSymphony A3 유세포 분석기</td><td>BD</td><td>맞춤 주문</td><td>플로우 사이토미터</td></tr><tr><td>Fc 블록, CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>BD</td><td>553142</td><td>Fc 블록</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Flowjo</td><td></td><td>플로우 사이토미터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>gentleMACS C 튜브&nbsp;</td><td>밀테니 바이오텍&nbsp;</td><td>130-096-334</td><td>자동 해리 튜브&nbsp;</td></tr><tr><td>젠틀MACS Octo 디스해리터와 히터&nbsp;</td><td>밀테니 바이오텍&nbsp;</td><td>130-095-937</td><td>조직 해리기 기기</td></tr><tr><td>GR1 (Ly6C/6G)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>IgD</td><td>BioLegend</td><td>405710</td><td></td></tr><tr><td>IgM</td><td>eBiosciences</td><td>25-5790-82</td><td></td></tr><tr><td>Kappa</td><td>BD</td><td>550003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lambda BioLegend</td><td>407308</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 32% 용액</td><td>전자 Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>True-Stain monocyte blocker</td><td>BioLegend</td><td>426103</td><td>monocyte blocker</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575038</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Vi-CELL XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>731050</td><td>cell counter instrument&nbsp;</td></tr></tbody></table>

뮤린 b 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

광범위한 연구는 이차 림프구 기관에서 뮤린 B 세포의 개발 및 분화를 특징으로합니다. B 세포에 의해 분비된 항체는 고립되고 잘 확립된 치료제로 개발되었습니다. murine B 세포 발달의 검증은 자가 면역 경향이 마우스의 맥락에서, 또는 수정된 면역 계통을 가진 마우스에서, 마우스에 있는 치료에이전트를 개발하거나 시험하는 중요한 분대이고 유동 세포측정의 적당한 사용입니다. 잘 확립된 B 세포 흐름 세포 계발성 파라미터는 뮤린 복막, 골수 및 비장의 B 세포 발달을 평가하는 데 사용될 수 있지만, 다수의 모범 사례를 준수해야 한다. 또한, B 세포 구획의 유동 세포 측정 분석은 또한 B 세포 발달의 추가 판독을 보완해야 한다. 이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 항체 또는 항체 와 같은 분자를 치료제로 생성하는 데 사용할 수 있는 인간화된 마우스뿐만 아니라 야생 유형, 자가 면역 경향이 마우스 모델뿐만 아니라 인간화된 마우스에 대한 우리의 이해를 더욱 발전시킬 수 있습니다.

여기서 우리는 마우스 복막, BM 및 비장의 B 세포 발달을 특성화하기위한 게이팅 전략을 제시합니다. 분석의 기초는 생존 염료로 염색의 개념을 중심으로 형성되고, 전방 분산 영역 (FSC-A) 및 전방 분산 높이 (FSC-H)에 따라 두 배를 게이팅하고, 마지막으로 FSC-A 및 측면 분산 영역 (SSC-A) 특성에 따라 세포를 선택하여 이물질을 제거하여 이물질을 제거합니다. 관심있는 인구에 게이팅하기 전에.
복막 B 세포의 흐름 세포 측정 분석은 표 1에 설명된 염색 패널을 사용하여 실행 가능한 복막 세포, 총 B 세포, B-1 및 B-2 서브세트뿐만 아니라 C57BL/6J 마우스에서 B-1a 및 B-1b 세포의 주파수를 나타낸다. 이러한 주파수의 평균 절대 셀 수는 <stro...

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

이 기술을 사용하여 생성된 데이터는 일반 항체 또는 항체 생명 치료제에 사용될 수 있는 인간화된 마우스 모델뿐만 아니라 자가면역 경향이 마우스 모델의 이해를 촉진합니다. 형광의 계속 확장 범위를 가진 시약의 가용성은 개별 적인 세포에 다중 파라미터의 동시 분석을 허용하고 B 세포 이질성의 평가를 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 유전자 조작 된 마우스를 phenotyping의 목적으로 개발되었다.유전자 조작이 B 세포 발달을 바꿀 지 여부를 결정합니다. 안녕하세요, 저는 믿음 해리스입니다. 오늘 절차를 시연할 것입니다.각 동물에서 각 세포 유형의 백만을 96웰 U-바닥 플레이트로 알리싱하는 것으로 시작합니다. 전체 얼룩, 형광 - 마이너스 - 1 샘플 및 각 형광에 대한 얼룩이없는 샘플을 포함하여 모든 샘플 및 컨트롤에 충분한 우물을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 골수 성숙 패널과 비장 성숙 패널의 경우, 각 전체 얼룩 샘플에 대해 잘 1백만 개의 세포로 알리쿼트 세포를 넣습니다.단일 색상 보정 생존가능성 컨트롤의 경우 각 셀 유형각각2백만 개의 셀을 개별 우물에 추가합니다. 섭씨 4도에서 2분간 845 x g의 플레이트원심분리기. 우물을 교차 오염시키지 않도록 주의하여 접시를 싱크대 위로 빠르게 반전시키고 쓸어 넘기면 상체를 제거합니다.DPBS의 200 마이크로 리터에서 두 번 세포를 세척합니다. 원심 분리기와 각 세척 후 상퍼를 디칭합니다. DPBS에서 희석된 생존성 염료 100마이크로리터에서 세포를 1-1000의 비율로 재일시 중단하여 단일 색상 보정에 사용되는 세포를 피한다.각 얼룩 세트에 대해 완전히 얼룩지지 않은 샘플 및 생존 가능성 FMO 제어를 위해 얼룩이 없는 추가 우물을 남기고 완전히 얼룩지지 않은 샘플 및 기타 컨트롤을 남겨 둡니다. 이러한 우물에 PBS를 추가합니다. 희석된 생존성 염료의 200 마이크로리터에서 단일 색상 보정 생존 가능성 제어의 세포를 다시 중단합니다.이 세포의 100 마이크로리터를 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 65도에서 5분 동안 가열된 세포를 나머지 살아있는 세포와 함께 원래로 다시 옮기시다. 빛으로부터 보호되는 30분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리하고 다른 우물을 교차 오염시켜 서퍼나탄을 가볍게 하거나 반전시면 상퍼를 제거합니다.DPBS의 200 마이크로 리터에서 다시 중단하여 세포를 씻어 낸 다음 원심 분리기를 하고 이전과 같이 상퍼를 데칭하십시오. DPBS 세척을 다시 반복합니다. 1-50의 비율로 스테인 버퍼로 희석된 FC 블록의 마이크로리터를 추가하여 밀리리터당 10 마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다.회중 세포의 경우, 비특이적 염색을 줄이기 위해 5개의 마이크로리터를 모노사이클 차단제를 첨가한다. 그런 다음, 빛으로부터 보호, 15 분 동안 섭씨 4도에서 세포를 배양. 텍스트 원고의 항체 테이블을 사용하여 백만 세포당 100 마이크로리터의 최종 부피를 위해 얼룩 버퍼에 전체 얼룩 마스터 믹스 및 FmOs를 준비합니다.FC 블록을 제거하지 않고, 선택한 우물에 전체 얼룩 믹스와 FmOS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 각 항체 및 얼룩 세트에 대한 단일 색상 보정 컨트롤을 준비합니다. 보상 구슬을 사용하는 경우 제조업체의 지시에 따라 다.세포와 구슬을 4°C에서 30분간 배양하여 빛으로부터 보호합니다. 그런 다음 원심 분리기를 뒤집어 접시를 가볍게 하여 상체를 장식합니다. 세포와 구슬을 200 마이크로리터의 얼룩 버퍼로 세 번 씻고 매번 상체를 원심분리하고 해독합니다.DPBS에서 2%파라포름알데히드의 200 마이크로리터에서 세포와 구슬을 다시 중단하여 분석을 위한 샘플을 수정합니다. 세포와 구슬을 섭씨 4도에서 30분간 배양하고, 빛으로부터 보호한 다음 원심분리기를 제거한 다음, 판을 뒤집거나 쓸어넘기면 상퍼를 데칭합니다. 얼룩 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포와 구슬을 다시 중단합니다.필터 플레이트를 깨끗한 96웰 U-바닥 플레이트 위에 놓고 각 샘플을 멀티 파이펫을 사용하여 필터 플레이트의 우물로 옮기습니다. 필터 플레이트를 원심 분리하고 상체를 데칭합니다. 골수 및 비장 성숙 패널의 경우 얼룩 버퍼 100 마이크로리터에서 완전히 얼룩진 세포를 다시 중단하십시오.각 동물에 대한 두 개의 우물을 하나의 우물로 결합합니다. 나머지 패널, FmOs 및 컨트롤을 스테인 버퍼 200마이크로리터에서 다시 중단합니다. 고정 된 세포와 구슬을 밤새 섭씨 4도에서 배양하여 빛으로부터 보호합니다.준비된 단일 얼룩 보정을 사용하여 각 얼룩 패널에 대한 보상 컨트롤을 기록하고 각 샘플에 대해 긍정적이고 음수 게이트를 설정합니다. 소프트웨어를 사용하여 보상 행렬을 계산합니다. 첫 번째 샘플을 획득하기 시작하여 게이트가 적절하게 설정되었는지 확인합니다.텍스트 원고에 언급된 대로 각 샘플의 다양한 셀 이벤트를 실행하고 기록하도록 컴퓨터를 설정합니다. 텍스트 원고의 게이팅 전략에 따라 흐름 세포 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 진행합니다. 복막에서 복막 B 세포의 특성화를 위한 유동 세포 측정 분석은 마우스에서 실행 가능한 복막 세포, 총 B 세포, B-1 및 B-2 서브셋뿐만 아니라 B-1a 및 B-1b 세포의 주파수를 나타낸다.골수 B 세포가 분석되었을 때, 실행 가능한 세포의 주파수, 총 B 세포, 분획 A, 사전 프로 B 세포, 분획 B, 분획 C, 분수 C'분수 D, 미성숙 분수 E, 과도기 분수 E 및 마우스내분수 F B 세포가 결정되었다. 비장 B 세포의 분석은 생쥐에서 실행 가능한 비장 세포, 총 B 세포, 과도기 B 세포, T1, T2, T3 세포, 성숙한 B 세포, 여포 I 세포, 여포 II 세포, 전구체 및 성숙한 한계 영역 세포 및 B-1 세포의 주파수를 나타낸다. 마우스내 면역글로불린 카파 및 면역글로불린 람다 B 세포의 주파수는 비장의 유동 세포 측정 분석으로 결정되었다.이 프로토콜을 수행할 때보정 컨트롤을 사용하여 한 검출기의 신호를 다음 단계로 이상 출혈로 해결해야 합니다. 이러한 컨트롤은 셀이 소독적으로 염색되거나 상업적으로 이용 가능한 보상 구슬이 있을 수 있습니다. 추가 분석법은 림프구 내세포 국소화를 시각화하기 위한 면역조직화학과 같은 유동 세포측정과 함께 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 실제 공간과 시간에 B 세포 반응을 분석하기 위해 2개의 광자 현미경 검사법을 사용할 수 있다.B 세포 구획의 유동 세포 분석은 BCR 및 관련 결핍, BCR 신호 분자의 방해 또는 B 세포 생존을 조절하는 사이토카인의 붕괴와 관련된 표현형의 특성화를 허용합니다.

flow-cytometric-characterization-of-murine-b-cell-development

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

항원 노출에 따라 활성화된 B 세포의 subpopulations는 독특한 효과기 기능 항체 isotypes를 만들어 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 공정을 받고있다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 CSR을 유도하고 분석하는 방법을...

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

이 프로토콜은 FACS - 매개 세포 분리, 유체 역학적 유전자 전달하고, Peyer의 패치 면역 부분 집합의 흐름 분석과 관련된 기술을 사용하여, 일반적인 돌기 세포의 전구 세포에서 Peyer의 패치 plasmacytoid 수지상 세포의 분화를 평가하는 실험 절차에 대해 설명합니다.

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 ​​있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.

골수성 창시자 및 정렬 전략 소설 셀을 사용 하 여 Murine 골에서 수지상 세포 선구자의 큰 숫자의 생성

가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

여기에서는 신선한 마우스 골수 및 비장에서 직접 조기 파열 형성 단위 적혈구 (BFU-e) 및 콜로니 형성 단위 적혈구 (CFU-e) 전구 세포를 전향 적으로 분리하기위한 새로운 유세포 분석 방법을 설명합니다. 단일 세포 전사체 데이터를 기반으로 개발된 이 프로토콜은 조직의 모든 적혈구 전구체를 고순도로 분리한 최초의 프로토콜입니다.

유세포분석에 의한 마우스 조직으로부터 파열 형성 단위 및 콜로니 형성 단위 적혈구 전구체의 식별 및 분리

배우세요 유동 세포 측정법을 이용하여 쥐의 B 세포 발달을 분석하는 방법을. 이 기술은 유전자 조작된 마우스의 면역 세포 이형성을 연구하는 데 활용됩니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

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