Name: 마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 마우스 심장 관상동맥 미세순환을 연구하는 ex vivo 방법으로, 동맥 관류압과 혈류를 측정하고 혈관 직경 및 동맥관 내압을 분석합니다. 이 기법은 페리사이트 기능과 심장 미세순환 역학을 평가하는 데 유용합니다.

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이 작품은 생물 의학 공학 및 기술 센터 (BioMET)에 의해 부분적으로 지원되었다; NIH (1U01HL116321) 및 (1R01HL142290) 및 미국 심장 협회 10SDG4030042 (GZ), 19POST3450156 (HCJ).

모든 동물 관리는 메릴랜드 볼티모어 대학과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 프로토콜의 지침에 따라했다.
1. 솔루션 준비
참고: 솔루션을 미리 준비합니다. 두 가지 유형의 기본 솔루션이 실험에 사용됩니다: (1) 목욕 상복부에 대한 생리식염수 용액(PSS)과 (2) 루멘 난투에 대한 타이로드의 솔루션. PSS의 pH를 유지하기 위해서는 CO2를 사용하여 연속 버블링이 필요합니다. HEPES 버퍼티로드의 용액은 기포가 내피 세포7을 손상시키고 흐름을 폐색하기 때문에 PSS 대신 루멘에서 사용됩니다.
<ol><li>PSS 솔루션: 표 1에서PSS 솔루션의 수식 및 구성을 참조하십시오. Ca2+-무료 및 포도당 없는 PSS 재고 솔루션의 10 L을 만들고 실온에서 보관하십시오. 1h 는 어떤 절차 전에, 5% CO2 (74% N 2 및 21% O2)로 스톡 용액의 1 L을 꺼내용 용액의 pH를 ~7.4로 유지한다. 포도당 1.8g과 1.8mL CaCl2 (1M 스톡)8을추가하십시오. 참고: pH가 ~7.4일 때만 부글부글 질한 후에만 Ca2+를 추가하면 Ca2+가 침전됩니다.</li>
	<li>Tyrode의 솔루션: 표 1에서Tyrode 솔루션의 수식 및 구성을 참조하십시오. 용액(0.22 μm)을 걸이면 향후 사용9를위해 4°C에 저장된다.</li>
	<li>BDM (2,3-부탄네디온 단음법)을 가진 Tyrode의 용액: 근구 세포의 수축을 방지하기 위해 가역적 인 myofilament 억제제로 BDM을추가합니다(10) 무게 600 mg BDM 과 에 추가 200 Tyrode의 솔루션의 mL. 완전히 용해될 때까지 BDM으로 솔루션을 저어줍니다. 더 이상 여과가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>BDM을 포함하는 Tyrode의 용액을 4°C에 저장하여 향후 사용을 위해 사용합니다.</li>
</ol>2. 챔버 준비
<ol><li>제조업체가 제공한 지침에 따라 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 해부 챔버와 실험 챔버를 미리 코팅합니다.</li>
	<li>BDM이 포함된 Tyrode의 용액으로 해부 챔버를 채웁니다.</li>
	<li>시술 전에 냉각기 1h를 켭니다. 온도를 4°C로 설정합니다.</li>
</ol>3. 캐뉼라 준비
<ol><li>마이크로파이펫 풀러를 켭니다. 제조업체의 지침에 따라 설정을 선택합니다.</li>
	<li>깨끗한 borosilicate 유리 튜브를 가져 가라 (사용되는 유리 튜브의 외부 및 내경은 각각 1.2mm와 0.69 mm이었다).</li>
	<li>U자형 플래티넘 가열 필라멘트가 있는 Sutter 파이펫 풀러의 홈 클램프에 유리 튜브를 삽입합니다.</li>
	<li>풀러를 활성화하여 긴 얇은 팁으로 각각 두 개의 캐뉼러를 생성합니다.</li>
	<li>각 캐뉼라의 끝을 해부 현미경으로 미세한 한 쌍의 가위를 사용하여 팁의 최종 직경을 100~ 150 μm 정도만 자른다.</li>
	<li>발사는 날카로운 가장자리를 약간 둥글게 절단 캐뉼라의 끝을 연마.</li>
	<li>끝에서 약 2mm 떨어진 샤프트 측면에 위치한 플래티넘 와이어(미세 제어로 가열)를 사용하여 샤프트를 따라 캐뉼라를 구부립니다. 캐뉼라의 굽힘의 각도는 약 45 °여야합니다.</li>
	<li>압력 근사 챔버의 홀더에 캐뉼라의 열린 끝을 삽입하고 피팅을 조입니다. 티로드의 솔루션으로 채워진 5mL 주사기를 피팅의 반대편에 연결합니다. 챔버에 장착된 미세 조작기에 캐뉼라를 연결합니다(그림 1 및 도 2참조).</li>
	<li>주사기(5mL)를 사용하여 티로드의 용액으로 캐뉼라를 채우고, 그것을 플러시하고, 기포의 튜브 와 커넥터를 세척합니다.</li>
	<li>캐뉼레이션 절차 전에, 주어진 흐름 범위(50 내지 300 μL/min, 그림 3)에걸쳐 캐뉼라 내부의 관류 압력을 측정합니다. 새 캐뉼라를 사용할 때만 그렇게 하십시오. 참고: 캐뉼라 내부의 관류 압력은 흐름에 비례하며 선형장착(도 3).</li>
</ol>4. 마우스 심장 추출
<ol><li>이소플루란과 산소의 탱크에 연결된 마취 상자에 C57BL/6 마우스(성관계, 8-16주 이전)를 넣습니다.</li>
	<li>산소 탱크를 켜고 이소플루란의 흐름을 시작합니다. 마우스가 완전히 마취 될 때까지 ~ 5 분 기다립니다.</li>
	<li>마취가 확립된 후, 마취 상자에서 마우스를 꺼내 헤파린 IP(복막 구멍, 360단위, 0.5mL/마우스)를 주입하여 혈관에서 혈전 형성을 피하십시오. 그런 다음 마우스를 마취 상자에 다시 넣습니다.</li>
	<li>헤파린을 주입한 후 10분 후, 마우스를 supine 자세로 가열된 침대로 옮기고 라벨링 테이프를 사용하여 발을 안정시합니다. 코 콘을 사용하여 이소플루란으로 마우스를 가득 차게 하십시오.</li>
	<li>마우스의 복부 피부를 집게로 다이어프램 위에 들어 올리고 수술 용 가위를 사용하여 다이어프램을 자르고 노출시합니다.</li>
	<li>다이어프램과 흉골을 잘라냅니다. 가슴을 엽니다.</li>
	<li>흉부 구멍에서 심장을 해부하고 등쪽 흉부 벽에 가능한 한 가깝게 절단합니다.</li>
	<li>30mM BDM이 들어 있는 얼음차가운 Tyrode의 용액에 하트를 넣습니다.</li>
	<li>폐와 같은 결합 조직을 제거하기 위해 심장을 청소하십시오.</li>
	<li>30mM BDM이 들어있는 Tyrode의 용액으로 채워진 미리 차가운 해부 챔버로 심장을 옮춥니다.</li>
</ol>5. 중격 동맥의 준비 및 캐누레이션
<ol><li>서보 펌프를 켭니다. 서보 펌프를 "흐름" 모드로 설정합니다. 튜브가 혈관 루멘을 견딜 수있는 Tyrode의 솔루션으로 채워질 때까지 고속으로 실행하십시오. 튜브에 거품이 없는지 확인하십시오. 그런 다음 속도를 낮춥춥습니다.</li>
	<li>심장을 PDMS에 고정하여 심장의 중간 부위에 손상을 피하십시오.</li>
	<li>오른쪽과 왼쪽 아리아를 모두 제거합니다. 오른쪽 심실을 열고 해부 현미경을 사용하여 오른쪽 심실 무료 벽을 제거합니다.</li>
	<li>중격 동맥을 노출하고 식별합니다. 격막 동맥 아래에 나일론 실(직경 30μm)을 놓고 향후 사용을 위해 느슨한 매듭을 묶습니다. 참고: 중격 동맥은 해부 현미경을 사용하여 쉽게 식별 할 수 있습니다. 중격 동맥은 대부분의 경우 오른쪽 관상 동맥에서 유래 중격에 주요 동맥입니다.</li>
	<li>미세 한 가위를 사용하여 왼쪽 심실 무료 벽을 제거합니다.</li>
	<li>캐뉼라가 배치된 실험 챔버로 유두 근육 제제를 옮김. 챔버는 BDM을 포함하는 Tyrode의 솔루션으로 채워져 있습니다. 이 챔버의 바닥은 PDMS의 얇은 (~2mm) 층으로 코팅됩니다.</li>
	<li>캐뉼라의 위치를 조정 (마이크로 조작기를 사용하여) 중격 동맥의 캐뉼레이션을 가능하게. 매듭을 조입니다.</li>
	<li>현미경 목표가 혈관의 명확한 보기를 가지고 있도록 챔버 바닥에 작은 핀을 사용하여 유두 근육을 확보. 캐뉼라의 각도와 위치에 주의를 기울이고 캐뉼라 끝이 동맥 벽에 평행하게 되어 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>주사기에서 캐뉼라를 통해 용액을 점진적으로 추방하여 캐뉼레이션을 테스트합니다. 모든 요소가 제대로 작동하는 경우, 유두 근육의 잔류 혈액은이 과정의 시작 부분에 조직을 종료하고 티로드의 용액은 나중에 볼 수 있습니다.</li>
</ol>6. 준비의 안정화
<ol><li>슈퍼퓨전 용액을 제공하는 연동 펌프를 켭니다. 그런 다음 3-4 mL /분의 속도로 사전 가스 PSS로 목욕 준비를 지속적으로 압도합니다.</li>
	<li>슈퍼퓨전 용액의 온도 컨트롤러를 켭니다. 욕조의 온도를 ~35-37°C로 조정합니다.</li>
	<li>서보 펌프에 캐뉼라를 연결합니다. 압력 서보 컨트롤러에 표시되는 압력을 읽어보십시오.</li>
	<li>흐름과 압력을 모니터링합니다. 유동(μL/min) 및 동맥 관류 압력(mm Hg)은 디지털화되어 관련소프트웨어(그림 2)를사용하여 기록된다.</li>
	<li>흐름을 조정하여 압력을 ~10mmHg로 설정하고 ~10분 동안 실행합니다.</li>
	<li>동맥의 압력을 만들기 위해 발광 용액의 흐름을 증가 ~ 60 mmHg. 캐뉼라의 압력 강하를 빼서 동맥 자체의 최종 관류 압력을얻는다(도 3). 참고: 압력 서보 컨트롤러의 "압력" 모드를 선택하면 이러한 실험에 대해 발광 압력이 ~60mmHg로 설정됩니다. 그런 다음 흐름의 변화를 모니터링합니다.</li>
	<li>유량 및/또는 압력 수준을 모니터링하여 샘플이 ~30-60분 동안 안정화하도록 합니다. 동맥 압력의 점진적인 증가는 일반적으로 수분 후에 관류의 시작 부분에서 관찰됩니다. 새로운 정상 상태는 약 30 분(그림 4)에서자체적으로 확립됩니다.</li>
	<li>관류 압력이 안정화된 후(일정한 흐름에서) 실험을 시작합니다.</li>
</ol>7. 형광 태그밀-세균 아글루티닌 (WGA)으로 준비를 로드
<ol><li>100μg의 WGA를 티로드 솔루션 5mL에 추가하여 알렉사 플루오르-488을 포함하는 Tyrode의 솔루션을 준비하십시오.</li>
	<li>퍼퓨전을 일반 Tyrode의 용액에서 형광 태그WGA를 포함하는 것으로 조심스럽게 전환합니다. 거품이 도입되지 않도록 난파를 조심스럽게 전환하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>WGA 관류의 ~30분 후 또는 WGA 용액이 다 소진되려고 할 때, 퍼서스래스를 다시 일반 티로드의 용액으로 변경합니다.</li>
</ol>8. 동맥과 모세 혈관의 공초점 이미징
<ol><li>Nipkow 디스크 공초점 현미경 시스템을 켭니다.</li>
	<li>현미경을 사용하여 송신광 모드에서 저전력 목표(4x)를 사용하여 중격 동맥을 찾습니다. 참고: 세막 동맥은 캐뉼라의 위치를 따라 위치할 수 있습니다.</li>
	<li>회전 디스크 공초점으로 공초점 이미징을 시작하고 488 nm 흥분 레이저, 40배 목표 배율 및 레이저 강도 및 샘플링 속도 조정(이미지 당 10 ~500ms)을 선택합니다.</li>
	<li>공초점 현미경에 대한 상부 및 하단 이미징 위치를 설정하여 이미징 범위를 정의하고 z 스택 이미징의 매개 변수를 입력합니다.</li>
	<li>사용 중인 시스템에 권장되는 단계 크기를 설정하거나 원하는 대로 단계 크기를 설정합니다.</li>
	<li>z 스택 설정 및/또는 타임시리즈 설정을 선택합니다.</li>
	<li>새 이미지를 저장하도록 새 폴더를 선택하거나 설정합니다.</li>
	<li>"실행"을클릭하여 향후 분석을 위한 이미징 녹화를 시작합니다(그림5).</li>
</ol>9. 예예 혈관 확장제 실험: 핀산틸리닐 유도 혈관 확장(비디오 1).
<ol><li>핀산산실 스톡 용액(DMSO 100mM)을 준비하고 4°C에 보관하십시오.</li>
	<li>티로드의 솔루션 10mL를 준비합니다. 핀산틸 스톡 용액 10μL을 추가하여 핀산틸100 μM의 최종 농도를 확인합니다.</li>
	<li>중격 동맥및 분기 동맥을 포함하는 낮은 배율 (4 배 목표)에서 유두 근육을 이미지.</li>
	<li>발광 용액을 핀산탈틸 함유 솔루션으로 전환합니다.</li>
</ol>10. 예용혈 조절 실험: 혈관 수축기 유도 동맥 관류 압력 증가 일정한 흐름(그림 6)
<ol><li>내피-1(ET-1) 스톡 용액(10 μM)을 준비하고 -20°C에 보관한다.</li>
	<li>티로드의 솔루션 10mL를 준비합니다. ET-1 스톡 용액(10μM)의 10μL을 추가하여 ET-1 10 nM의 최종 농도를 확인합니다.</li>
	<li>일정한 흐름으로 발광 압력을 기록하고 유두 근육을 이미지합니다.</li>
	<li>발광 솔루션을 ET-1 함유 솔루션으로 전환합니다.</li>
</ol>11. 회신구가 있는 모세관의 예 이미지(그림 7)
<ol><li>이 프로토콜의 섹션 4에 설명된 대로 NG2DredBAC 형질 전환 마우스를 희생한다.</li>
	<li>심장을 추출하고, 중격 동맥을 캐너리및 프로토콜 5-7 다음 의정서 5-7 다음 알렉사 플루오르-488 컨쥬게이드 WGA로 샘플을로드합니다.</li>
	<li>공초점을 사용하여 488 nm 및 560 nm 암과 510-525 nm, 575-625 nm 방출에서 유두 근육을 이미지합니다. 동맥 압력은 약 40 mmHg가 될 것입니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
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<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
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</ol>

본 연구에서는 생리적 조건 하에서 심장에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하기 위해 매우 간단하면서도 매우 실용적인 전 생체 내 방법을 도입했습니다. 이 방법은 쥐2를사용하여 기계적 조사에서 수정되었다. 도전적인 추가는 고속 및 고광학 해상도를 가진 이미징 기술이었습니다. 따라서 우리는 현재 상용화된 고급 광학 이미징 시스템을 활용할 수 있었습니다. 유두 근육의 기능을 유리한 위치에 신중하게 해부하고 배치함으로써, 우리는 동맥, 모세혈관 동맥, 모세 혈관 및 베룰뿐만 아니라 회신을 시각화할 수 있었고, 다른 부분을 제어하면서 동맥 압력 및/또는 흐름을 측정할 수 있었습니다. 동맥 및 모세관 직경 변화는 고속 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 모니터링되었다. 광학 영상과 생리식염수 용액의 내부 관류의 조합은 이러한 준비를 생물학적 치료의 효과의 평가뿐만 아니라 심장1의혈류의 생리적 및 병리학적 조절에 관여하는 메커니즘의 연구에 도움이 된다.</p...

적절한 관상 동맥 압력 -유동 조절은 신진 대사 요구를 충족하기 위해 심장에 충분한 혈액 공급을 보장1. 그러나, 그것은 단지 최근에 관상 동맥 압력 흐름은 지난 수십 년 동안 생체 내 및 체외에서 수행 된 광범위한 연구에도 불구하고, 심장에서 동적으로 조절되는 방법을 분명하게되고있다. 그 이유 중 하나는 심장의 지속적인 박동으로 인해 이러한 연구를 위한 생리적 작업 모델을 확립하는 데 어려움이 있기 때문입니다. 에 관계없이, 살아있는 조직 또는 동물에서 관상 동맥 마이크로 선박의 관찰을 위해 다양한 방법이 확립되었지만, 이러한 방법 중 어느 것도 동시에 압력, 유량 및 미세 혈관 직경의 일정한 / 안정적인 초점 과 측정을 달성 할 수 없었다2,3. 박동 심혼에 관상 동맥 마이크로 혈관의 직접적인 시각화는 수십 년 전4,3,그러나 작은 선박의 직경 측정이 도전적이었고 마이크로 순환과 관련된 많은 특수 세포 유형의 특정 기능이 균등하게 골치 아픈 것이었습니다. 스트로보스코픽 방법과 부동 목표 시스템조차도 위의 정보를 동시에 제공할 수 없다5. 그럼에도 불구하고, 관상 동맥혈류6의 조절에 관하여 더 많은 것을 이해하는 것을 도운 전술한 기술을 사용하여 귀중한 정보의 상당량이 얻어졌습니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 관상 동맥, 동맥 및 미세 혈관의 구성 요소가 자극 및 대사 요구에 다르게 반응하는 방법을 자세히 조사하고 이해하는 데 도움이 됩니다.
이러한 연구를 추진하기 위해 우리가 설립한 작업 모델은 Westerhof 외2의이전 작품에 내장되었습니다. 마우스 심장의 중격 동맥의 캐넌트에 이어, 생리식염수 용액은 심근세포와 심장 조직의 다른 성분을 영양화하기 위해 동맥을 인퓨전하는 데 사용되었습니다. 동맥 관류 압력, 유동 및 혈관 직경은 적절한 형광 지표를 사용하여 다른 생리적 기능 중에서 모니터링되었다. 이 방법을 사용하면 살아있는 조직에서 생리적 압력하에서 관상 동맥 미세 혈관 침대를 시각화하고 처음으로 미세 순환 조절의 기본 세포 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1 M CaCl2 용액</td><td>MilliporeSigma, 미국</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2 용액</td><td>MilliporeSigma, 미국</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope 소프트웨어</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉각기 / 물 인큐베이터</td><td>FisherScientific, 미국 Isotemp</td><td>3016S</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Nikon Instruments, 미국</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>사용자 정의 유리관</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>올림푸스, 일본</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>MilliporeSigma, 미국</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 Salt</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>인라인 솔루션 히터</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, Idaho, USA</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫/캐뉼라 홀더</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>NG2DsRedBAC 형질전환 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>혈관 묶기용 나일론 실</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS(폴리디메틸실록산)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson, Middleton, WI, USA</td><td>minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>압력 서보 컨트롤러</td><td>리빙 시스템 계측, 미국 버몬트주 벌링턴</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>미세 과학 도구, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>서보 펌프</td><td>리빙 시스템 계측, 미국 버몬트주 벌링턴</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>온도 컨트롤러</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>밀 배아 응글레티닌, 알렉사 플루어 488 Conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 심장의 모세혈관, 동맥 및 페리사이클의 동적 측정 및 이미징

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

관상 동맥 톤은 모세 혈관의 개폐와 함께 주로 일정한 관류 압력에서 심근세포로의 혈류를 결정합니다. 그러나, 관상 동맥과 전체 심혼에 있는 모세 혈관의 동적 변경을 감시하기 어렵습니다, 주로 그것의 운동 및 논스톱 치기 때문에. 여기에서 우리는 마우스 오른쪽 심실 유두 근육에 동맥 관류 속도, 압력 및 모세 혈관의 직경 변화의 모니터링을 가능하게하는 방법을 설명합니다. 마우스 중격 동맥은 다른 동적으로 측정된 일정한 흐름 또는 압력에서 수중 및 퍼플레이션됩니다. 형광으로 표시된 렉틴(예: 알렉사 플루어-488 또는 -633개의 밀-세균 아글루티닌, WGA)을 배설한 후, 오른쪽 심실 포세혈관 근육과 중격의 동맥 및 모세혈관(및 기타 혈관)을 용이하게 이미지화할 수 있다. 혈관 직경 의 변화는 심장 수축의 존재 또는 부재에서 측정 될 수있다. 유전적으로 인코딩된 형광 단백질이 발현되었을 때, 특정 특징은 모니터링될 수 있었습니다. 예를 들어, pericytesNG2-DsRed를 표현 마우스 심혼에 시각화되었습니다. 이 방법은 심장에 있는 모세관 pericytes의 생리적 기능을 연구하는 유용한 플랫폼을 제공했습니다. 또한 혈관/모세관 직경과 동맥 발광 압력을 동시에 측정하여 심장의 혈류에 대한 시약의 효과를 연구하는 데 적합합니다. 이 준비는 최첨단 광학 이미징 시스템과 결합되어 거의 생리적 조건하에서 심장의 세포 및 분자 수준에서 혈류량과 제어를 연구할 수 있습니다.

형광 혈관 마커가 혈관 루멘(여기 WGA가 알렉사 플루오르-488과 결합됨)에 침투하면 고속 공초점 현미경을 사용하여 도 5(왼쪽 패널)에 도시된 바와 같이 전체 혈관 나무를 시각화할 수 있다. 추가 배율은 모세관의 이미징을 자세하게 가능하게한다(도 5,오른쪽 패널). 가압 시스템은 발광 압의 지속적인 모니터링을 지원하기 때문에,이 준비는 동맥 압력과 동맥 직경의 변화를 연결하는 데 사용할 수 있습니다. 비디오 1은 핀산틸이 ATP에 민감한 K+ 채널(KATP)아고니스트가 루멘에서 제공되었을 때, 동맥의 직경이 증가하였다는 것을 보여준다. 도 6은 혈관 수축기 ET-1이 루멘으로부터 적용되었을 때, 동맥의 직경이 감소하고, 유동이 일정하게 설정되었을 때 발광 압력이 증가되었다는 것을 나타낸다.
...

여기에 제시된 것은 혈관 동맥이 수납 및 가압되기 때문에, 모세관 침대 및 백혈구를 포함하는 혈관 나무 구성 요소뿐만 아니라 압력을 유지하는 동맥 관류 압력 및 흐름의 전 생체 모니터링에 의해 살아있는 뮤린 심장 조직에서 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 프로토콜이다.

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

이 방법은 동맥 관류 압력 및 흐름의 생체 외 모니터링을 통해 살아있는 쥐, 심장 조직 및 혈관 나무 구성 요소의 관상 동맥 미세 순환을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 심장 내 주위 세포와 시약의 미세순환 기능을 연구하는 데 유용한 플랫폼을 제공하므로 혈관 직경과 세동맥 내강압을 측정하는 경향이 있습니다. 실험을 위해 캐뉼러를 준비하려면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 하나의 깨끗한 붕규산 유리관에서 길고 얇은 팁이 있는 두 개의 캐뉼러를 생성합니다.가는 가위와 해부 현미경을 사용하여 각 캐뉼라의 끝을 100-150마이크로미터의 최종 팁 직경으로 자르고 끝을 불로 연마하여 날카로운 모서리를 약간 둥글게 만듭니다. 끝에서 약 2mm 떨어진 샤프트 측면에 위치한 백금 와이어를 사용하여 샤프트를 따라 캐뉼라를 약 45도 각도로 구부리고 캐뉼라의 열린 끝을 캐뉼라 홀더에 삽입합니다. 그런 다음 피팅을 조이고 5ml 주사기를 사용하여 Tyrode의 용액으로 캐뉼라와 튜브를 세척합니다.캐뉼라 홀더를 압력 근경 챔버의 미세 조작에 장착합니다. 실험을 위해 쥐 심장을 수집하려면 먼저 한 쌍을 입력하고 마취된 8주에서 16주 된 C 57 검은색 6마리 쥐에 500마이크로리터의 헤파린을 주입합니다. 10분 후 누운 자세로 가열된 침대에 마우스를 놓고 라벨링 테이프로 발을 고정합니다.집게와 수술용 가위를 사용하여 횡격막 위의 복부 피부를 절개하고 횡격막과 흉골을 잘라 흉강에서 심장을 절개할 수 있도록 합니다. 30밀리몰 BDM이 함유된 얼음처럼 차가운 Tyrode 용액에 심장을 넣고 필요에 따라 심장에서 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 30밀리몰 BDM이 보충된 신선한 Tyrode 용액으로 채워진 미리 냉각된 해부실에 심장을 넣습니다.캐뉼레이션을 위해 중격 동맥을 준비하려면 서보 폼프를 켜고 서보 컨트롤러 압력을 흐름 모드로 설정하십시오. 심장에서 PDMS로 이동하면서 조직의 중간 영역이 손상되지 않도록 주의하고 조직을 해부 현미경 아래에 놓습니다. 한쪽 또는 양쪽 심방을 제거하고 우심실을 잘라냅니다.우심실 자유벽을 제거하고 중격 동맥을 노출시킵니다. 직경 30마이크로미터의 나일론 실을 사용하여 중격 동맥 주위에 느슨한 매듭을 묶습니다. 가는 가위를 사용하여 좌심실 자유벽을 제거하고 유두근 제제를 실험실로 옮깁니다.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 캐뉼라를 중격 동맥에 삽입하고 봉합사로 캐뉼라를 고정합니다. 그런 다음 핀을 사용하여 캐뉼라 끝이 동맥벽과 평행하도록 유두 근육을 챔버 바닥에 고정하여 혈관 구조를 명확하게 볼 수 있도록 하고 주사기를 사용하여 캐뉼라를 통해 용액을 점차적으로 세척합니다. 조직 준비를 안정화하려면 연동 펌프를 켜고 분당 3-4 밀리리터 유속으로 사전 가스 처리 된 생리 식염수로 제제를 지속적으로 수퍼 퓨징하고, 과융합 용액의 온도 조절기를 켜고, 수조 과농축 물의 온도를 섭씨 35-37도로 조정하십시오.캐뉼러를 서보 펌프에 연결하고 유량을 조정하여 압력을 약 10mm의 수은으로 설정합니다. 과융합을 약 10분 동안 실행한 다음 발광 용액의 흐름을 증가시켜 동맥 압력을 약 60mm의 수은으로 설정하고 모니터링을 통해 샘플이 30-60분 동안 안정화되도록 합니다. 시료에 밀-배아 응집소를 주입하기 위해 5ml의 Tyrode 용액과 100마이크로그램의 Alexa Fluor-488 Conjugated wheat-germ Agglutinin을 주입합니다.30분 후 관류 보조제를 일반 Tyrode의 용액으로 다시 변경하고 컨포칼 현미경 시스템을 켭니다. 더 낮은 배율에서 현미경을 사용하여 투과광 모드에서 중격 동맥을 찾고 이 회전 디스크 컨포칼로 이미징을 시작하십시오. 40X 대물렌즈 배율과 488 나노미터 여기 레이저를 선택하고 레이저 강도와 샘플링 속도를 조정합니다.이미징 범위를 정의하려면 현미경의 상단 및 하단 이미징 위치를 설정하고 스텝 크기 및 Z-stack 이미징 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 이미지를 저장할 폴더를 선택하고 실행을 클릭하여 이미지 기록을 시작합니다. 형광 혈관 마커가 혈관 내강으로 관류되면 고속 컨포칼 현미경을 사용하여 전체 혈관 나무를 시각화할 수 있습니다.추가 배율을 통해 모세관을 자세히 이미징할 수 있습니다. 핀시딜(pinacidil)과 ATP 민감성 칼륨 채널 작용제(potassium channel agonist)가 내강에서 제공되면 동맥의 직경이 증가합니다. 혈관 수축 장치 endothelin 하나가 내강에서 적용됩니다.동맥의 직경이 감소합니다. 흐름 집합이 일정하면 내강 압력이 증가합니다. 형질전환 마우스를 발현하는 NG two DS red의 유두 조직 이미지에서는 살아있는 동물의 생리를 더 잘 모방하는 조건에서 유두 근육 조직 내에서 모세혈관과 주위 세포를 모두 시각화할 수 있습니다.절차 중 어느 시점에서든 튜브 내부에 기포가 존재하지 않는 것이 중요합니다. 이 방법을 광학 이미징 기술과 결합하면 형광 기술 형질전환 마우스를 사용하여 심장의 미세 순환 및 서로 다른 세포 유형 간의 세포 간 통신을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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