Name: EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 SEC-BioSAXS 데이터 분석 방법으로 생물학적 대분자의 용액 구조를 정밀하게 규명하는 기술입니다. Scatter와 BioXTAS RAW 소프트웨어를 활용한 EFA 분해 및 분산 분석 프로토콜을 익혀보세요.

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우리는 프랑스 보조금 REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014에서 프로젝트에 대한 재정 적 지원을 인정하고 서비스 드 산테 데 아르메와 데레지레이션 제네랄 부어 l'Armement의 연구 보조금을 통해. 우리는 SAXS 빔 시간에 대한 ESRF에 감사드립니다. 이 작품은 그르노블 지시 -에릭 센터 (ISBG)의 플랫폼을 사용; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) 구조 생물학을 위한 그르노블 파트너십(PSB)에 포함되며, 프리스비(ANR-10-INBS-05-02)와 GRAL이 지원하며, 대학 그르노블 알프스 대학원(Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS(ANRE-EU-10)에서 자금을 지원받았습니다. IBS는 그르노블의 학제 간 연구소 (IRIG, CEA)에 통합을 인정합니다. 우리는 Wim P. Burmeister와 Frédéric Iseni에게 재정적 및 과학적 지원을 주셔서 감사드리며, 그의 도움과 BioXTAS RAW 개발에 대한 APS의 BioCAT 박사 제시 홉킨스에게 감사드립니다.

<ol><li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22General+Physiology+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li>
<li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+SAXS+versatility%3A+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture%2C+functional+landscapes%2C+and+integrative+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li>
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<li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li>
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<li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li>
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<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li>
<li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+%28US-SOMO%29+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li>
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<li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioXTAS+RAW%3A+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li>
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<li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li>
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<li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

SAXS 실험을 시작하기 전에 단분산 샘플을 갖는 것이 바람직하지만 실제로는 많은 데이터 수집이 이를 충족시키지 못하며 대부분의 경우 SEC인 인라인 크로마토그래피(INline chromatography)와 측정을 결합하여 개선되어야 합니다. 그러나, 샘플의 정제와 데이터 수집 단조화 사이의 시간 부족조차도 보장되지 않습니다. 가장 일반적으로 이는 구성 요소가 크기가 너무 가깝거나 물리적 특성이 분리되거나 빠른 역학에 취약한 실험에 적용됩니다. 여기서, 우리는 단일 값 분해와 진화하는 인자 분석을 결합하여 DNAbound E9 exo의 영향을 언바운드 형태로부터제거하여 SAXS 패키지 Scatter IV로 분석할 수 있었던 단일 분산 산란 프로파일을 생성합니다.
SEC-SAXS 데이터의 EFA를 갖춘 SVD는 SAXS 데이터를 감소시키고 분석을 개선하기 위해 개발된 매우 강력한 방법이지만 제한이 있습니다. SEC-SAXS의 버퍼 기준선에서 노이즈 또는 드리프트를 최소한으로 유지하도록 요구합니다. 여기에는 샘플 로딩 전에 추가 열 평형(버퍼에 따라 3개 이상의 열 볼륨을 사용하는 것이 좋습니다)이 포함될 수 있습니다. 그러나 가장 중요한 단계는 단수 값 수와 사용된 데이터 범위의 선택입니다. 이러한 이유로 결과는 스스로 복용해서는 안 되지만 생물학적 해석을 위한 분석 적 극심분리(AUC) 또는 다각 레이저 광 산란(MALLS)과 같은 기술을 사용하여 추가로 분석되어야 합니다.
Scatter IV는 전문가가 아닌 사용자 인터페이스를 통해 연구 및 산업용으로 무료로 사용할 수 있는 새로운 소프트웨어 패키지로, 비전문가도 데이터를 분석할 수 있습니다. Scatter IV에는 신호 플롯에 연결된 열 맵과 같은 SEC-SAXS 데이터의 분석을 개선하는 데 도움이 되는 몇 가지 새로운 기능이 있어 프레임 선택을 선택할 때 정확도를 높일 수 있습니다. 기본 데이터 분석에서 Guinier Peak 분석 및 P(r) 분석과 관련된 교차 유효성 검사 플롯은 소프트웨어에서 통합된 문제 해결 기능을 제공합니다.
다른 많은 프로그램을 기본 데이터 분석에 사용할 수 있음을 언급해야 합니다. 이들은 동일한 기본 기능을 포함하고 또한 BioXTAS RAW17 ATSAS 패키지24 및 미국-SOMO15와 같은 정기적으로 업데이트됩니다.
그러나 분석에 사용되는 SAXS 패키지에 관계없이 주요 제한 사항은 수집 및 분석 전에 샘플 준비라는 주요 제한 사항입니다. 도시된 E9 exo마이너스 예에서, 단일분산 시료와연관된 Rg의 감소와 함께 노이즈 비에 대한 신호의 개선을 볼 수 있음이 분명하다. 이렇게 하면 알려진 고해상도 구조로 피팅 또는 모델링과 같은 데이터를 추가 로 처리하는 데 크게 도움이 됩니다.

생물학적 거대 분자는 너무 작아서 가장 좋은 광 현미경으로도 볼 수 없습니다. 그들의 구조물을 결정하는 현재 방법은 일반적으로 동시에 동일 분자의 광대 한 숫자에 단백질 또는 측정을 결정화 포함. 결정학은 원자 수준에 대한 정보를 제공하지만, 대부분의 거대 분자가 세포에서 결정성 형태로 제시되지 않는다는 점을 감안할 때 인공 샘플 환경을 나타냅니다. 지난 몇 년 동안 냉동 전자 현미경 검사는 대형 거대 분자 / 거대 분자 복합체의 유사한 고해상도 구조를 전달했지만 샘플이 생리적 상태에 가깝지만 여전히 동결되어 움직이지 않으며 정적입니다. 바이오 스몰 앵글 X선 산란(BioSAXS)은 생물학과 관련된 조건에서 거대 분자의 구조적 측정을 제공합니다. 이 상태는 나노미터 척도에서 결정된 저해상도 3-D 형상으로 시각화될 수 있으며 용액에서 거대 분자의 전체 형태 공간을 캡처합니다. BioSAXS 실험은1,2,3사이의 유연성뿐만 아니라 올리고머 상태, 도메인 및 복잡한배열을효율적으로 평가합니다. 이 방법은 정확하고 대부분 파괴적이지 않으며 일반적으로 최소한의 샘플 준비 및 시간만 필요합니다. 그러나 데이터를 가장 잘 해석하려면 샘플이 단일 분산되어야 합니다. 이것은 도전이다; 생물학적 분자는 종종 오염, 가난한 정제 및 집계에 취약하며, 예를 들어 동결 해동4에서. 즉각적인 SAXS 측정에 이어 인라인 크로마토그래피의 개발은 이러한 효과를 완화하는 데 도움이 됩니다. 크기 배제 크로마토그래피는 대부분의 오염 물질및 집계5,6,7,8,9,10을제외한 크기별로 샘플을 분리한다. 그러나, 어떤 경우에는 SEC-SAXS조차도 단일 분산 시료를 생성하기에 충분하지 않습니다, 혼합물은 크기가 너무 가깝거나 물리적 특성 또는 빠른 역학이 SEC UV 추적에서 겹치는 피크로 이어질 수 있기 때문이다. 이러한 경우, 획득한 SAXS 데이터의 소프트웨어 기반 디온볼루션 단계는 개별 구성 요소5,11,12의이상화된 SAXS 곡선으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 프로토콜 섹션 2에서, 우리는 DNA와 복잡한에서 암시니아 E9 DNA 폴리머라제 엑소뉴클레아제 마이너스 돌연변이체(E9 exominus)의표준 SEC-SAXS 분석을 보여 준다. 박시니아는 여러 병원균을 함유하는 가족인 Poxviridae의 모델 유기체, 예를 들어 인간 천연두 바이러스를 나타낸다. 중합체는 생화학적 접근법에서 DNA에 단단히 결합하는 것으로 나타났으며, 최근 X선결정학(13)에의해 해결된 복합체의 구조와 함께.
대부분의 싱크로트론 시설은 데이터 정규화 및 통합을 수행하여 subtracted 프레임 집합을 생성하는 자동화된 데이터 처리 파이프라인을 제공합니다. 그러나 이 원고에 설명된 접근 방식은 SEC-SAXS가 수행되는 경우 실험실 소스와 함께 사용할 수도 있습니다. 또한, 방사선 손상 된 프레임을 거부하고 버퍼뺄셈(14)을수행하는 추가 자동화가 가능할 수 있다. 사전 처리된 데이터에 대한 기본 데이터 분석을 수행하고 섹션 2에서 사용 가능한 데이터를 최대한 활용하도록 하는 방법을 보여 드리겠습니다.
섹션 3에서는 SEC-SAXS 데이터를 감소시키고 곡선을 효율적으로 분석하는 방법을 보여줍니다. 미국-SOMO15및 GUinier 최적화된 최대 가능성 방법으로 구현된 가우시안 피크 데온볼루션과 같은 여러 가지 절충볼루션 방법이 있지만, DELA소프트웨어(16)에서구현된 Guinier최적화 최대 가능성 방법, 이들은 일반적으로 피크형상(12)에대한 모델이 필요하다. 우리가 조사하고있는 개별 피크의 유한 크기는 피크 형상 또는 산란 프로파일5,11에의존하지 않고 중첩 피크를 감소시키기 위해 단수 값 분해 (SVD)의 향상된 형태로 진화하는 인자 분석 (EFA)의 사용을 허용합니다. SAXS 전용 구현은 BioXTAS RAW17에서찾을 수 있습니다. EFA는 2D 다이오드 어레이 데이터가 보존 시간 및 파장데이터(18)에대한 흡수도에서 매트릭스를 형성할 수 있게 했을 때 크로마토그래피 데이터에 처음 사용되었다. EFA가 탁월한 점은 단일 값의 진화하는 특성, 새로운 구성 요소의 모양으로 어떻게 변화하는지에 초점을 맞추고 있으며, 인수10에고유 순서가 있다는 것을 주의합니다. 다행히 SEC-SAXS 데이터는 체계적인 2D 데이터 어레이에서 필요한 모든 주문 수집 데이터를 제공하여 EFA 기술에 잘 빌려주입니다.
섹션 4에서는 버퍼 백 빼기 SAXS 곡선에서 모델 독립적 인 SAXS 분석의 기본을 시연할 것입니다. 모델 독립적 분석은 입자의 반지름(Rg), 상관관계 볼륨(Vc), 포로드 볼륨(Vp), 포로드-디비 지수(PE)를 결정합니다. 이 분석은 치수 없는 Kratky 플롯2,4,19를통해 입자의 열역학 상태에 대한 반정적 평가를 제공한다.
마지막으로 SAXS 데이터는 상호 공간 단위로 측정되며 SAXS 데이터를 실제 공간으로 변환하여 쌍 거리 P(r), 분배 기능을 복구하는 방법을 보여줍니다. P(r)분포는 파티클 내에 있는 모든 거리의 집합이며 파티클의 최대 치수, d최대 값을포함한다. 이는 열역학 측정이므로 P(r)-분포는 입자의 형성 공간에 의해 점유되는 물리적 공간을 나타냅니다. SAXS 데이터 집합을 적절히 분석하면 결정학 및 저저온 EM의 고해상도 정보를 보완하는 솔루션 상태 통찰력을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>빔라인 제어 소프트웨어 BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>로컬 개발</td></tr><tr><td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td><td>MacCHESS</td><td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td><td>2008년 Soren Skou가 생물학적 X선 전체 분석 시스템(BioXTAS) 프로젝트의 일환으로 처음 개발했습니다. 그 이후로 광범위하게 개발되었으며, 최근에는 Jesse B. Hopkins</td></tr><tr><td>HPLC 프로그램 LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015)에 의해 수행되고 있습니다. Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>지역 개발</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>Scatter</td><td>Diamond Light Source Ltd</td><td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td><td>SIBYLS 빔라인(ALS 버클리, 캘리포니아) 및 Bruker Cororation(독일 칼스루에)에 의해 지원됨</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td>SEC-SAXS 컬럼 사용</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr></tbody></table>

efa 감소 및 분산을 통한 sec-saxs 데이터 분석

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS는 분자 및 구조 생물학에 사용되는 인기있는 기술로 용액 구조, 입자 크기 및 모양, 표면 대 부피 비율 및 거대 분자 및 거대 분자 복합체의 형성 적 변화를 결정합니다. 구조 모델링을 위한 고품질 SAXS 데이터 집합은 단분산, 균일한 샘플에서 이루어져야 하며 이는 종종 인라인 크로마토그래피와 즉각적인 SAXS 측정의 조합에 의해서만 도달됩니다. 가장 일반적으로 크기 배제 크로마토그래피는 샘플을 분리하고 단일 단백질 종의 잘 해결된 크로마토그래피 피크에서 SAXS 측정을 할 수 있도록 관심 입자로부터 오염 물질및 응집을 배제하는 데 사용됩니다. 그러나, 어떤 경우에는, 심지어 인라인 정제는 단일 분산 시료의 보장이 아니며, 여러 구성 요소가 크기가 너무 가깝거나 바인딩 변경을 통해 유도된 모양의 변화가 인식된 용출 시간을 인식하기 때문이다. 이러한 경우, 개별 성분의 이상화된 SAXS 곡선을 얻기 위해 혼합물의 SAXS 데이터를 감소시킬 수 있다. 여기에서는 이것이 어떻게 달성되고 SEC-SAXS 데이터의 실제 분석이 이상적이고 어려운 샘플에서 수행되는지 보여줍니다. 구체적으로, 우리는 백신의 SEC-SAXS 분석을 보여 주며, 암시니아 E9 DNA 폴리머라제 외핵체마이너스 돌연변이체.

고전 프레임선택(13)에 대한 분축을 사용하는 장점은 종들이 서로 에 미치는 영향을 제거하고 단분산 산란 신호를 생성하는 것이다. 이것은 또한 종종 소음 비율에 더 나은 신호와 함께 따릅니다. E9 엑소마이너스가 DNA에 바인딩되어 SEC-SAXS를 사용하여 실행하면 2개의 피크가 관찰됩니다(그림1). 첫 번째, 큰 피크 (약 프레임 420\u2012475)는 E9 엑소마이너스-DNA 복합체 두 번째 (약 프레임 475\u2012540), 언바운드 상태(보충 데이터: 그림 2참조)이다. 프레임을 선택하는 고전적인 접근 방식은 첫 번째 피크에서 복잡한의 안정적인 Rg를 제공하지만 (보충 데이터: 그림 3 참조), 두 번째 피크가 명확하게 병합되고 플롯을 가로 질러 Rg는 관심의 두 번째 피크가 교차 피크 오염으로 인해 안정적인 Rg가 없는 것을 보여줍니다. 만 5 프레임은 반 안정 Rg를 보여 사용할 수 있습니다, 그들은 Rg = 36.3 Å(그림 2,녹색)를 준 차감 할 때. 피크가 EFA를 이용하여 데콘볼루트되었을 때 두 번째피크(도 2,blue)에 대한 해당 곡선은 원본과 겹쳐져 노이즈에 신호가 뚜렷하게 감소하고, Rg, 34.1 Å가 기록되었다. Kratky 플롯(그림 3)은장식 된 피크 (파란색)가 더 구형인 복합체를 보여줍니다. 이는 P(r) 곡선(도4)이데콘볼루트 곡선(blue)에 대해 dmax 108.5Å를 제공하는 반면, 비-데콘볼루트는 dmax 120 Å(녹색)로 더 길어지는 반면, 이는 언바운드 E9에서발생하는 이질성으로 인해 가장 가능성이 높다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> 그림 1: E9 엑소의 신호 플롯은 단독으로 DNA를복합체로 빼는 것으로. 상단 패널에는 SEC-SAXS 실행(밝은 파란색)의 각 프레임에 대한 모체 비율의 플롯이 표시됩니다. 빨간색 점은 피크 위에 각 프레임에 Rg를 표시합니다. 하단 패널은 Durbin-Watson 자동 상관 관계 분석에 따라 각 프레임에 대한 잔류를 보여주는 해당 열맵을 보여 주며, 유사성이 높은 영역은 시안으로 지정되고 유사성이 높은 영역은 어두운 파란색을 분홍색으로 따라 마지막으로 빨간색으로 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> 그림 2: 강도 대 산란 벡터의 플롯입니다. 빼진 SAXS 데이터의 오버레이는 E9exo를 뺀 값입니다. 녹색 5 프레임 (프레임 517\u2012522)은 SEC-SAXS 피크의 EFA 감소에서 파생 된 대표적인 산란 곡선을 반안정 Rg 영역과 파란색으로 평균 및 빼는 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> 그림 3: 치수 없는 크라키 곡선. E9 엑소마이너스를 나타내는 데온볼루트(파란색) 및 비데온볼루트(green) 크라키 커브의 오버레이는 구형이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> 그림 4: P(r) 곡선. E9 엑소마이너스용데온볼루트(파란색) 및 비데온볼루트(녹색) 커브의 오버레이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

생물학적 거대 분자의 SEC-BioSAXS 측정은 거대 분자와 그 복합체의 용액 구조를 결정하기위한 표준 접근 방식입니다. 여기에서 는 SEC-BioSAXS 데이터를 두 가지 유형의 SEC 추적(완전히 해결되고 부분적으로 해결된 피크)의 크로마토그램에서 분석합니다. 우리는 분산 및 BioXTAS RAW를 사용하여 분석 및 deconvolution을 시연합니다.

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

생물학적 소형 각 엑스레이 산란은 거대 분자 및 거대 분자 복합체의 구조적 측정을 제공합니다. 이상적으로 측정할 샘플은 단분산되어야 합니다. 경우에 따라 크기 배제 크로마토그래피 SAXS가 단조로움을 생성하기에 충분하지 않지만 SAXS 데이터의 소프트웨어 기반 감소는 이상화된 SAXS 곡선을 생성하기 위해 수행될 수 있습니다.이러한 프로토콜에 따라, deconvolution 프로그램 및 사용자 친화적인 분산 프로그램은 바시니아 바이러스 DNA 폴리머라제 exominus 돌연변이를 분석하는 데 사용될 수 있다. 크기 제외 크로마토그래피 데이터의 배경 빼기를 수행하려면 Java 기반 Scatter 4 프로그램을 열고 SEC 탭을 엽니다. 감소된 데이터 파일을 창 아래 의 드롭 데이터에 드래그앤드롭하고 출력 디렉토리 버튼을 클릭하고 열어 데이터가 저장될 출력 디렉터리를 설정합니다.저장상자에 샘플 이름을 상자로 입력하고 추적을 클릭합니다. 편집 세부 정보 버튼을 클릭하여 실험 세부 정보를 편집하고 적절한 필드를 작성합니다. 버퍼 프레임을 수동으로 선택하려면 버퍼 집합을 클릭합니다.왼쪽 단추를 클릭하고 드래그하여 약 100프레임의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 보이드 볼륨 전에 추적 곡선의 평면으로 버퍼를 다시 선택하고 세트 버퍼및 업데이트를 클릭하여 SEC 파일을 다시 계산합니다. 왼쪽 단추를 클릭하고 드래그하여 신호 플롯에서 관심 영역을 선택하고 왼쪽 단추로 클릭하고 열지도 플롯에서 십자선을 드래그하여 병합에 사용되는 프레임의 확대/축소 및 하위 집합을 선택합니다. 또 다른 왼쪽 클릭으로 십자선 오른쪽 하단의 영역에 해당하는 열지도의 프레임을 강조 표시합니다.이상적으로, 프레임은 주로 시안 색상과 gyration의 안정적인 반경 영역을 강조해야합니다. 선택한 프레임에 만족하면 병합을 클릭하여 빼진 프레임을 병합하고 분석 탭을 클릭하여 데이터를 봅니다. 데이터를 감소시위해 데이터 집합을 디온볼루션 프로그램에서 로드합니다.파일 아래의 제어판에서 폴더 기호를 사용하여 데이터를 찾고 모든 DAT 파일을 강조 표시합니다. 통합 강도 대 프레임 번호의 플롯이 계열 플롯에 그려집니다. 시리즈 탭에서 클릭하여 곡선을 강조하고 LC 분석 팝업 창을 엽니다.적합한 버퍼 영역을 선택하려면 영역을 클릭하여 크로마토그램의 피크 전 과 용매 전면 후 영역을 선택하고 세트 버퍼를 클릭합니다. 팝업 창은 배경에 대해 프레임이 선택되지 않음을 나타냅니다. EFA를 시작하려면 강조 표시된 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 메뉴에서 EFA를 선택합니다.팝업 창에서 데이터 집합의 단일 값 분해를 관찰해야 합니다. 컨트롤 상자에서 사용 프레임 상자 값을 확인하여 데오볼루트에 대한 전체 피크 영역이 강도 플롯에 덮여 있는지 확인합니다. 단수 값 플롯은 기준선 위의 단수 값의 강도를 표시합니다.왼쪽 및 오른쪽 단일 벡터가 일치하지 않으면 중요한 단수 벡터 수를 2개로 변경하고 왼쪽 및 오른쪽 단수 벡터가 유사할 때까지 프레임을 이동합니다. EFA는 계산되어 각 벡터에 대한 앞뒤로 길찾기에 플롯을 생성하고 구성 요소가 선택한 크기 배제 크로마토그래피 SAXS 데이터에 대한 솔루션 프로파일을 시작하고 종료할 때를 나타냅니다. RAW는 범위를 식별하려고 시도합니다.필요한 경우 화살표를 사용하여 범위를 변경하여 각 원이 변곡점의 시작이되도록 하여 기준선으로 상승하거나 하락하고 다음 을 클릭합니다. 스파이크를 줄이거나 제거하려면 범위 제어 화살표를 사용하여 스파이크에 해당하는 프레임을 식별하여 구성요소 범위 컨트롤을 조정합니다. 최소 치 사각형이 달성되면 다시 클릭하여 유효성 검사 검사를 수행합니다.원래 EFA 플롯이 여전히 유효해 보이는 경우 다음을 클릭하고 EFA 데이터를 저장하여 플롯을 저장합니다. 그런 다음 EFA 창을 닫기 위해 완료를 클릭합니다. 그런 다음 RAW 창에서 플롯 패널에서 프로파일을 열어 곡선을 봅니다.제어판의 프로파일 탭에서 오른쪽 단추를 클릭하여 곡선을 DAT 파일로 저장합니다. SAXS 측정을 위해 분산 분석 탭을 열고 G를 선택하여 수동 Guinier 분석 도구를 선택합니다. 플롯에서 잔류에 미소 나 찡그린 피처가 없는 점을 추가하거나 제거합니다.Guinier 적합에서 선택한 데이터는 1.3의 교간 한계를 곱한 최대 큐를 초과해서는 안 됩니다. 정규화된 Kratky를 클릭합니다. 결과 플롯은 거시 분자, 구형, 원통형, 무질서, 질량 및 농도에 대한 정규화의 구조 상태에 대한 평가를 제공한다.상관 관계의 볼륨을 클릭합니다. Q 플롯의 함수로서 총 산란 강도의 총 산란 강도와 통합 된 영역은 산란 곡선의 품질을 검증하기위한 빠른 참조로 나타납니다. 유연성 분석을 시작하려면 유연성을 클릭합니다.팝업 창의 각 패널은 컴팩트와 길쭉한 유연한 바이오 폴리머 사이에 존재하는 전력 법 관계를 악용하는 플롯을 보여줍니다. 상자 하단의 슬라이더를 사용하여 플롯 중 하나의 고원에 도달할 때까지 데이터 보기를 변경합니다. 유연성 분석을 수행한 직후 볼륨을 클릭합니다.세 개의 그래프가 생성됩니다. Porod-Debye 플롯은 유연성 플롯의 슬라이더가 남아 있는 위치를 추적하고 고원 영역 데이터를 표시합니다. 파티클의 볼륨을 계산하려면 플롯의 파란색 선이 고원 영역에 맞을 때까지 시작 점과 끝점을 이동합니다.편견없는 결과를 위해, 포로 드비 지수 전원 법의 잔류는 패턴을 표시하지 않아야합니다. R 탭의 P에서 샘플에 대한 실제 공간 분포 및 산란 곡선을 관찰할 수 있습니다. 이상적으로, 분포 곡선은 파도없이 매끄럽어야하며 X 축을 부드럽게 터치해야합니다.샘플 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 DMAX 찾기를 클릭하여 새 창을 엽니다. 최대 차원의 제한은 제안된 최대 Q 범위, 계산에 사용할 최대 데이터 점, 낮은 및 상부 최대 치수 제한 및 낮은 알파 점수와 함께 미리 설정됩니다. 시작을 클릭합니다.복합 분포는 제안된 최대 치수 및 알파 레벨과 함께 만들어집니다. 이러한 데이터가 허용되는 경우 창을 닫아 창을 닫아 제안된 최대 Q 범위와 일치하도록 상호 공간 플롯이 자르는 R 탭의 P로 돌아갑니다. 더 많은 모델을 선택하고 배경을 클릭하여 팝업 상자에서 제안된 값으로 알파 수준 및 최대 차원을 설정합니다.구체화를 클릭합니다. 교차 유효성 검사 플롯이 열리므로 빨간색으로 표시된 대로 점을 거부해야 하는지 여부를 보여 집니다. 몇 개의 거부된 점만 있고 분포가 양호해 보이는 경우 모델이 좋습니다.분석 탭에 보고서를 인쇄합니다. 왼쪽 단추를 클릭하여 샘플을 강조하고 샘플 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 단일 데이터 집합에서 보고서 만들기를 선택합니다.주석을 허용하도록 텍스트 상자가 열리고 생성된 모든 수치와 값을 보여주는 PDF 문서가 생성됩니다. 본 대표적인 분석에서, E9 DNA 폴리머라제 외핵효소 마이너스 돌연변이는 DNA에 결합되어 크기 배제 크로마토그래피 스몰 앵글 X선 산란을 사용하여 실행되었다. 두 개의 피크가 관찰되었습니다.첫 번째 큰 피크는 E9 DNA 중합체 외핵효소를 뺀 돌연변이 DNA 복합체를 나타낸다. 두 번째는 언바운드 상태를 나타냅니다. 프레임을 선택하는 고전적인 접근 방식은 첫 번째 피크에서 복잡한의 회전 반경을 안정적으로 제공하지만, 두 번째 피크는 명확하게 병합되고 플롯을 가로 질러 gyration의 반경은 두 번째 피크가 교차 피크 오염으로 인해 gyration의 안정적인 반경을 가지고 있지 않다는 것을 보여줍니다.이 분석에서는 반안정된 경하반경을 보여주는 5개의 프레임만 사용할 수 있습니다. 차감했을 때, 그들은 36.3 앙스트롬의 반경을 주었다. 피크가 EFA를 사용하여 데포볼루트되었을 때, 두 번째 피크에 대한 해당 곡선은 원본과 오버레이되어 34.1 앙스트롬의 노이즈 및 하반경에 대한 신호의 명확한 감소를 보여 주었다.데이터의 Kratky 플롯은 수축된 피크가 있는 복합체가 PR 곡선에 의해 확인된 대로 더 구형적임을 보여 주며, 이는 감축 된 곡선에 대해 최대 치수가 108.5 앙스트롬을 제공합니다. 이 분석을 위한 비deconvoluted 데이터는 120 angstroms의 최대 치수로 더 길어지며, 이는 무한E9 폴리머라제에서 발생하는 이질성으로 인해 exonuclease 돌연변이체를 뺀 값입니다. 가장 중요한 단계는 단수 값과 이로 사용되는 데이터 범위를 선택하는 것입니다.결과는 스스로 취해서는 안되지만, 분석 원심분리 또는 다각 레이저 광 산란과 같은 추가 기술을 사용하여 추가로 평가하여 생물학적 해석을 허용합니다. 인라인 컬럼 결합 SAXS는 감출과 결합된 SAXS 및 Scatter가 제공하는 프로그램 인란트와 같은 사용자 친화적인 인터페이스는 본질적으로 어려운 시스템에서도 의미 있는 구조 데이터를 제공하는 강력한 패키지입니다.

analysis-of-sec-saxs-data-via-efa-deconvolution-and-scatter

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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SAXS 빔라인에 온라인 크기 배제 및 이온 교환 크로마토 그래피

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형광 크기 배제 크로마토그래피를 통한 멤브레인 단백질 품질의 신속한 평가

배우세요 SEC-BioSAXS 데이터 분석 방법으로 생물학적 대분자의 용액 구조를 정밀하게 규명하는 기술입니다. Scatter와 BioXTAS RAW 소프트웨어를 활용한 EFA 분해 및 분산 분석 프로토콜을 익혀보세요.

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

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