EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

생물학적 소형 각 엑스레이 산란은 거대 분자 및 거대 분자 복합체의 구조적 측정을 제공합니다. 이상적으로 측정할 샘플은 단분산되어야 합니다. 경우에 따라 크기 배제 크로마토그래피 SAXS가 단조로움을 생성하기에 충분하지 않지만 SAXS 데이터의 소프트웨어 기반 감소는 이상화된 SAXS 곡선을 생성하기 위해 수행될 수 있습니다.

이러한 프로토콜에 따라, deconvolution 프로그램 및 사용자 친화적인 분산 프로그램은 바시니아 바이러스 DNA 폴리머라제 exominus 돌연변이를 분석하는 데 사용될 수 있다. 크기 제외 크로마토그래피 데이터의 배경 빼기를 수행하려면 Java 기반 Scatter 4 프로그램을 열고 SEC 탭을 엽니다. 감소된 데이터 파일을 창 아래 의 드롭 데이터에 드래그앤드롭하고 출력 디렉토리 버튼을 클릭하고 열어 데이터가 저장될 출력 디렉터리를 설정합니다.

저장상자에 샘플 이름을 상자로 입력하고 추적을 클릭합니다. 편집 세부 정보 버튼을 클릭하여 실험 세부 정보를 편집하고 적절한 필드를 작성합니다. 버퍼 프레임을 수동으로 선택하려면 버퍼 집합을 클릭합니다.

왼쪽 단추를 클릭하고 드래그하여 약 100프레임의 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 보이드 볼륨 전에 추적 곡선의 평면으로 버퍼를 다시 선택하고 세트 버퍼및 업데이트를 클릭하여 SEC 파일을 다시 계산합니다. 왼쪽 단추를 클릭하고 드래그하여 신호 플롯에서 관심 영역을 선택하고 왼쪽 단추로 클릭하고 열지도 플롯에서 십자선을 드래그하여 병합에 사용되는 프레임의 확대/축소 및 하위 집합을 선택합니다. 또 다른 왼쪽 클릭으로 십자선 오른쪽 하단의 영역에 해당하는 열지도의 프레임을 강조 표시합니다.

이상적으로, 프레임은 주로 시안 색상과 gyration의 안정적인 반경 영역을 강조해야합니다. 선택한 프레임에 만족하면 병합을 클릭하여 빼진 프레임을 병합하고 분석 탭을 클릭하여 데이터를 봅니다. 데이터를 감소시위해 데이터 집합을 디온볼루션 프로그램에서 로드합니다.

파일 아래의 제어판에서 폴더 기호를 사용하여 데이터를 찾고 모든 DAT 파일을 강조 표시합니다. 통합 강도 대 프레임 번호의 플롯이 계열 플롯에 그려집니다. 시리즈 탭에서 클릭하여 곡선을 강조하고 LC 분석 팝업 창을 엽니다.

적합한 버퍼 영역을 선택하려면 영역을 클릭하여 크로마토그램의 피크 전 과 용매 전면 후 영역을 선택하고 세트 버퍼를 클릭합니다. 팝업 창은 배경에 대해 프레임이 선택되지 않음을 나타냅니다. EFA를 시작하려면 강조 표시된 파일을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 메뉴에서 EFA를 선택합니다.

팝업 창에서 데이터 집합의 단일 값 분해를 관찰해야 합니다. 컨트롤 상자에서 사용 프레임 상자 값을 확인하여 데오볼루트에 대한 전체 피크 영역이 강도 플롯에 덮여 있는지 확인합니다. 단수 값 플롯은 기준선 위의 단수 값의 강도를 표시합니다.

왼쪽 및 오른쪽 단일 벡터가 일치하지 않으면 중요한 단수 벡터 수를 2개로 변경하고 왼쪽 및 오른쪽 단수 벡터가 유사할 때까지 프레임을 이동합니다. EFA는 계산되어 각 벡터에 대한 앞뒤로 길찾기에 플롯을 생성하고 구성 요소가 선택한 크기 배제 크로마토그래피 SAXS 데이터에 대한 솔루션 프로파일을 시작하고 종료할 때를 나타냅니다. RAW는 범위를 식별하려고 시도합니다.

필요한 경우 화살표를 사용하여 범위를 변경하여 각 원이 변곡점의 시작이되도록 하여 기준선으로 상승하거나 하락하고 다음 을 클릭합니다. 스파이크를 줄이거나 제거하려면 범위 제어 화살표를 사용하여 스파이크에 해당하는 프레임을 식별하여 구성요소 범위 컨트롤을 조정합니다. 최소 치 사각형이 달성되면 다시 클릭하여 유효성 검사 검사를 수행합니다.

원래 EFA 플롯이 여전히 유효해 보이는 경우 다음을 클릭하고 EFA 데이터를 저장하여 플롯을 저장합니다. 그런 다음 EFA 창을 닫기 위해 완료를 클릭합니다. 그런 다음 RAW 창에서 플롯 패널에서 프로파일을 열어 곡선을 봅니다.

제어판의 프로파일 탭에서 오른쪽 단추를 클릭하여 곡선을 DAT 파일로 저장합니다. SAXS 측정을 위해 분산 분석 탭을 열고 G를 선택하여 수동 Guinier 분석 도구를 선택합니다. 플롯에서 잔류에 미소 나 찡그린 피처가 없는 점을 추가하거나 제거합니다.

Guinier 적합에서 선택한 데이터는 1.3의 교간 한계를 곱한 최대 큐를 초과해서는 안 됩니다. 정규화된 Kratky를 클릭합니다. 결과 플롯은 거시 분자, 구형, 원통형, 무질서, 질량 및 농도에 대한 정규화의 구조 상태에 대한 평가를 제공한다.

상관 관계의 볼륨을 클릭합니다. Q 플롯의 함수로서 총 산란 강도의 총 산란 강도와 통합 된 영역은 산란 곡선의 품질을 검증하기위한 빠른 참조로 나타납니다. 유연성 분석을 시작하려면 유연성을 클릭합니다.

팝업 창의 각 패널은 컴팩트와 길쭉한 유연한 바이오 폴리머 사이에 존재하는 전력 법 관계를 악용하는 플롯을 보여줍니다. 상자 하단의 슬라이더를 사용하여 플롯 중 하나의 고원에 도달할 때까지 데이터 보기를 변경합니다. 유연성 분석을 수행한 직후 볼륨을 클릭합니다.

세 개의 그래프가 생성됩니다. Porod-Debye 플롯은 유연성 플롯의 슬라이더가 남아 있는 위치를 추적하고 고원 영역 데이터를 표시합니다. 파티클의 볼륨을 계산하려면 플롯의 파란색 선이 고원 영역에 맞을 때까지 시작 점과 끝점을 이동합니다.

편견없는 결과를 위해, 포로 드비 지수 전원 법의 잔류는 패턴을 표시하지 않아야합니다. R 탭의 P에서 샘플에 대한 실제 공간 분포 및 산란 곡선을 관찰할 수 있습니다. 이상적으로, 분포 곡선은 파도없이 매끄럽어야하며 X 축을 부드럽게 터치해야합니다.

샘플 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 DMAX 찾기를 클릭하여 새 창을 엽니다. 최대 차원의 제한은 제안된 최대 Q 범위, 계산에 사용할 최대 데이터 점, 낮은 및 상부 최대 치수 제한 및 낮은 알파 점수와 함께 미리 설정됩니다. 시작을 클릭합니다.

복합 분포는 제안된 최대 치수 및 알파 레벨과 함께 만들어집니다. 이러한 데이터가 허용되는 경우 창을 닫아 창을 닫아 제안된 최대 Q 범위와 일치하도록 상호 공간 플롯이 자르는 R 탭의 P로 돌아갑니다. 더 많은 모델을 선택하고 배경을 클릭하여 팝업 상자에서 제안된 값으로 알파 수준 및 최대 차원을 설정합니다.

구체화를 클릭합니다. 교차 유효성 검사 플롯이 열리므로 빨간색으로 표시된 대로 점을 거부해야 하는지 여부를 보여 집니다. 몇 개의 거부된 점만 있고 분포가 양호해 보이는 경우 모델이 좋습니다.

분석 탭에 보고서를 인쇄합니다. 왼쪽 단추를 클릭하여 샘플을 강조하고 샘플 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 단일 데이터 집합에서 보고서 만들기를 선택합니다.

주석을 허용하도록 텍스트 상자가 열리고 생성된 모든 수치와 값을 보여주는 PDF 문서가 생성됩니다. 본 대표적인 분석에서, E9 DNA 폴리머라제 외핵효소 마이너스 돌연변이는 DNA에 결합되어 크기 배제 크로마토그래피 스몰 앵글 X선 산란을 사용하여 실행되었다. 두 개의 피크가 관찰되었습니다.

첫 번째 큰 피크는 E9 DNA 중합체 외핵효소를 뺀 돌연변이 DNA 복합체를 나타낸다. 두 번째는 언바운드 상태를 나타냅니다. 프레임을 선택하는 고전적인 접근 방식은 첫 번째 피크에서 복잡한의 회전 반경을 안정적으로 제공하지만, 두 번째 피크는 명확하게 병합되고 플롯을 가로 질러 gyration의 반경은 두 번째 피크가 교차 피크 오염으로 인해 gyration의 안정적인 반경을 가지고 있지 않다는 것을 보여줍니다.

이 분석에서는 반안정된 경하반경을 보여주는 5개의 프레임만 사용할 수 있습니다. 차감했을 때, 그들은 36.3 앙스트롬의 반경을 주었다. 피크가 EFA를 사용하여 데포볼루트되었을 때, 두 번째 피크에 대한 해당 곡선은 원본과 오버레이되어 34.1 앙스트롬의 노이즈 및 하반경에 대한 신호의 명확한 감소를 보여 주었다.

데이터의 Kratky 플롯은 수축된 피크가 있는 복합체가 PR 곡선에 의해 확인된 대로 더 구형적임을 보여 주며, 이는 감축 된 곡선에 대해 최대 치수가 108.5 앙스트롬을 제공합니다. 이 분석을 위한 비deconvoluted 데이터는 120 angstroms의 최대 치수로 더 길어지며, 이는 무한E9 폴리머라제에서 발생하는 이질성으로 인해 exonuclease 돌연변이체를 뺀 값입니다. 가장 중요한 단계는 단수 값과 이로 사용되는 데이터 범위를 선택하는 것입니다.

결과는 스스로 취해서는 안되지만, 분석 원심분리 또는 다각 레이저 광 산란과 같은 추가 기술을 사용하여 추가로 평가하여 생물학적 해석을 허용합니다. 인라인 컬럼 결합 SAXS는 감출과 결합된 SAXS 및 Scatter가 제공하는 프로그램 인란트와 같은 사용자 친화적인 인터페이스는 본질적으로 어려운 시스템에서도 의미 있는 구조 데이터를 제공하는 강력한 패키지입니다.