제노이식 모델의 혈액에서 순환 돼지 특이적 DNA의 정량화

제노이식은 치료할 수 있는 가능한 방법이지만, 이노이식의 면역 거부를 효과적으로 모니터링하는 것은 의사와 연구자의 문제입니다. 이 프로토콜은 xenotransmutation의 면역 거부를 모니터링하는 간단하고 편리하며 저렴한 비용과 덜 침습적 인 방법입니다. 이 기술은 돼지 대 인간 적 정문 이식, 신장 이식, 간 이식 및 심장 이식을 포함하여 xeno 이식 분야에서 사용할 수 있습니다.

혈액 샘플 500마이크로리터를 다른 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기는 것으로 시작합니다. 프로테아제 K 20 마이크로리터와 500마이크로리터의 용해 버퍼를 튜브에 넣습니다. 그런 다음 철저히 섞어 두십시오.

튜브를 10분간 56도의 수조에 넣고, 용액이 투명해질 때까지 인큐베이션 중에 2~3회 흔들어 튜브 커버의 내부 벽에서 액체 구슬을 제거합니다. 그런 다음 Anhydrous, 에틸 알코올의 500 마이크로 리터를 추가하고 철저하게 흔들어. 혼합물을 흡착 열로 옮킨다.

그런 다음 컬럼을 2분 동안 원심분리하고 폐액을 폐기합니다. 각 흡착 열에 800 마이크로리터의 헹구는 용액을 추가하고 원심분리기를 1분 동안 추가합니다. 남은 헹구는 용액을 건조시키기 위해 몇 분 동안 실온에서 열을 둡니다.

흡수 컬럼을 깨끗한 원심 튜브로 옮기습니다. 흡착 필름 의 중간에 용출 버퍼 50 마이크로 리터를 추가하고 2 ~ 5 분 동안 실온에 배치 한 다음 원심 분리하여 1 분 동안 배치합니다. 원고 방향에 따라 PCR 마스터 믹스를 준비한 다음 각 0.6 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 23 마이크로리터를 추가합니다.

각 튜브에 게놈 DNA의 두 마이크로 리터를 추가하고 조심스럽게 Cabot. 그런 다음 잠시 혼합하고 원심분리기를 합니다. 튜브를 PCR 사이클러에 놓고 증폭을 시작합니다.

반응이 끝나면 아가로즈 전기전도를 수행한다. 1.2 그램의 아가로즈를 100밀리미터의 TAE가 들어있는 플라스크에 넣고 전자레인지에서 5분간 끓입니다. 아가로즈가 섭씨 약 70도로 냉각되면, 5마이크로리터의 핵산 염료를 플라스크에 넣고 천천히 접시에 붓고 젤로 고화될 때까지 실온에서 둡니다.

각 샘플의 5개의 마이크로리터와 2-Log DNA 사다리 또는 DNA 마커 1을 아가로즈 젤과 전기전도의 우물에 1억 2천만 부두에 추가하여 밴드가 분리될 때까지 넣습니다. 자외선 으로 젤을 시각화합니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 변환을 수행한 후 EcoR I 및 Bam HI를 통해 이중 제한 효소 소화로 플라스미드를 확인하십시오. 소화된 제품을 1%의 아가로즈 전기전구로 분리하고 젤을 자외선에 노출시다.

농축 된 플라스미드를 돼지 DNA의 조각으로 2 배 10 에서 시작 표준 용액을 위해 밀리리터 당 11 번째 사본으로 희석하고 이중 증류수를 사용하십시오. 표준 곡선을 설정하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 qPCR 마스터 믹스를 준비하고 8튜브 스트립의 각 튜브에 믹스 40 마이크로리터를 추가합니다. 다른 농도의 표준 DNA10 마이크로 리터를 추가, 튜브를 캡 다음 잠시 혼합하고 원심 분리.

qPCR 기계에 튜브를 놓고 증폭을 수행합니다. EDTA 튜브를 사용하여 돼지-원숭이 동맥 패치 모델또는 돼지-마우스 세포 이식 모델에서 약 400마이크로리터의 혈액 샘플을 수집합니다. 그런 다음 샘플을 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기습니다.

낮은 온도및 고속으로 원심분리에 의하여 혈액 샘플에서 혈액 세포를 제거합니다. 상체를 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 10분 동안 16, 000회 G에서 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다. 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 전송하고 DNA 추출 키트를 순환하는 동안 상용 혈청을 사용하여 순환 DNA를 추출한다.

순환 DNA의 양을 40 마이크로리터로 응축시키고 음의 섭씨 20도에 저장합니다. 순환하는 돼지 특이적 DNA를 정량화하기 위해 qPCR을 수행한다. 돼지-마우스 세포 이식 모델 및 돼지-원숭이 동맥 패치, 이식 모델에서 돼지-마우스 세포 이식 모델에서, qPCR에 의해 순환 돼지 특이적 DNA를 정량화하기 위해 돼지 특이적 프라이머를 설계하고 사용했습니다.

아가로스 전기 포는 증폭 된 DNA 단편을 분리하는 데 사용되었습니다. PCR을 사용하여, 증폭된 돼지 게놈 DNA에 대한 프라이머 특이성이 확인되었다. 다음으로, 원숭이 또는 인간 게놈 DNA 의 코호트 또는 마우스 게놈 DNA의 코호트에서 이러한 프라이머의 종 특이성이 확인되었다.

마지막으로 두 종 별 프라이머, 돼지 - 원숭이 동맥 패치및 돼지에서 돼지 DNA를 마우스, 세포 이식 모델로 증폭시키는 데 사용되었다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 기억해야 할 가장 중요한 것은 모든 종류의 오염을 방지해야한다는 것입니다. 이 기술은 xeno 이식의 면역 거부를 감시하는 간단한 저가 및 비 침습적 인 방법이기 때문에 연구원이 xeno이식 내의 새로운 질문을 탐구하는 길을 열어줍니다.