Name: 실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 학습하세요 실리콘 나노 와이어를 이용한 세포 내 광학 생체 조절 기법으로 심장 및 뇌 세포의 고해상도 생물전자학적 조사를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에서 정밀한 자극과 전기적 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 과학 연구의 공군 사무실에 의해 지원됩니다 (AFOSR FA9550-18-1-0503).

윤리 기준을 준수하기 위해 설치류 심장에서 심근세포 를 분리하는 것과 관련된 모든 동물 절차는 시카고 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 처음 승인되었습니다. 또한, 모든 동물 실험은 시카고 IACUC 대학의 지침에 따라 완전히 수행되었습니다.
1. 셀-SiNWs 하이브리드의 준비
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 1차 심근세포(CM)를 분리합니다.</li>
	<li>10% 열 불활성 태아 소 혈청, 1% 페니실린-연쇄절제술, 1% L-글루타민으로 보충된 1차 세포 격리를 위한 완전한 DMEM을 준비하십시오.</li>
	<li>MFs-MC 서스펜션으로부터 근섬유세포(MFs)를 분리하기 위해, 조직 배양 접시에 격리된 세포를 미리 플레이트(100mm 접시당 1.1. 1.1. 100mm 접시당 2개의 하트로부터 분리된 세포). CM은 부착하기 위해 섬유넥틴 또는 콜라겐 처리 표면이 필요하기 때문에, 오직 MF만이 조직 배양 표면에 부착됩니다.</li>
	<li>농축된 CM 셀 서스펜션을 흡인합니다. 이러한 CM은 섹션 3에 설명된 바와 같이 이종 세포 커플링 실험에 사용될 수 있다. MF를 DMEM으로 헹신후 MF접시의 남은 CM을 제거합니다.</li>
	<li>MF에 신선한 배양 매체를 추가하고 - 80 % 컨할 때까지 확산 할 수 있습니다 (2-4 일). 격일로 매체를 변경합니다.</li>
	<li>세포가 준비되면(80% 컨캔수), 아래혼성화 단계에 대해 SiNW를 준비한다(1.7단계). 참고: 많은 유형의 SiNWs를 사용할 수 있습니다. 본 실험에서, 코어 쉘 p-i-n 접합 구성을 가진 화학 증기 증착(CVD)에 의해 성장된 SiNW는이전에설명된 바와 같이 사용되었다. CVD 성장 하는 동안, SiNWs 실리콘 웨이퍼 기판에 성장 하 고 결국 SiNWs로 덮여 실리콘 칩으로 유지 됩니다.</li>
	<li>다이아몬드 스크라이브를 사용하여 CVD 재배 SiNWs로 웨이퍼에서 3mm x 3mm 칩을 잘라냅니다. 날카로운 집게를 사용하여 웨이퍼를 처리하고 시프와 접촉하는 표면적을 최소화합니다.</li>
	<li>70% 에탄올로 헹구고 바이오 세이프티 라미나르 플로우 후드에서 자외선 아래에서 30분 동안 에탄올이 건조할 수 있도록 하여 칩을 멸균합니다.</li>
	<li>칩을 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 완전한 배양 매체를 사용하여 과도한 에탄올을 헹구십시오.</li>
	<li>문화 용 매체 1 mL을 추가하고 초음파 욕조에서 칩을 1-10 분 동안 초음파 처리하십시오. SiNWs가 미디어로 공개됨에 따라 미디어는 흐려야 합니다. 참고: 더 짧은 지속 시간 및 낮은 힘이 더 긴 SiNW를 생성하므로 초음파 처리 시간과 전력은 서로 다른 초음파 장치 또는 다른 셀에 최적화되어야 합니다.</li>
	<li>SiNWs 서스펜션을 5mL의 문화 매체에 추가하고 MF를 사용하여 100mm 조직 배양 접시에 시드하십시오. 부분적으로 내부화된 SiNWs를 사용하여 사용 전에 1h에 다른 사용자가 앉을 수 있도록 하여 내부화를 완료할 수 있도록 허용합니다. 참고: 다른 세포 유형은 다른 SiNWs 농도 및/또는 내소화 시간을 필요로 할 수 있습니다.</li>
	<li>1:50의 비율로 멸균 20 mM 아세트산으로 콜라겐 스톡 용액(3 mg/mL)을 희석하여 콜라겐 코팅 솔루션을 준비합니다. 35mm 유리 바닥 접시에 0.5 mL 코팅 용액을 추가하고 37 ° C에서 1 시간 동안 앉을 수 있습니다. 용액을 제거하고 멸균 PBS로 접시를 헹구는 것입니다.</li>
	<li>세포-SiNWs 하이브리드를 37°C에서 2분 동안 트립신 3mL로 처리하여 수확한다. 10mL의 문화 매체를 추가하고 파이펫팅을 통해 하이브리드를 적극적으로 헹신다. 내부SiNW로 세포를 손상시키지 않도록 5 분 동안 200 x g에서 세포를 부드럽게 원심 분리합니다. 과잉 매체를 제거하고 1mL 매체로 세포를 일시 중단하고 콜라겐 처리 유리 바닥 접시에 종자. 참고: 하이브리드는 단독으로 시드를 배정할 수 있으며, 세포 내 또는 세포 간 커플링을 조사하거나 CM을 사용하여 체외에서 이종 세포 커플링을 조사할 수 있습니다.</li>
	<li>37°C에서 30분 동안 세포의 사이토솔(calcein-AM, 4 μM) 및 멤브레인(멤브레인 마커, 2 μM)을 표시하고, 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미징하여 SiNW 내재화의 최종 검증을 수행한다. SiNWs는 반사성이 높기 때문에 반사된 빛을 형광 대신 사용하여 시각화할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 세포 내 및 세포 간 조사를 위한 세포 준비
<ol><li>콜라겐 코팅 용액 을 1.12로 준비</li>
	<li>세포 내 전기 자극의 경우, 낮은 종자 밀도를 가진 배양 하이브리드. 표준 혈청계를 사용하여 1.11절에서 셀을 계산합니다. 배양 배지의 35mm 유리 바닥 접시에 50,000개의 셀을 시드합니다. 세포 간 조사의 경우, 더 높은 세포 밀도 (접시 당 500,000 세포)를 사용합니다. CM과 MF 간의 세포 간 커플링의 경우 새로 분리된 CM과 하이브리드를 공동 배양합니다.</li>
	<li>광학 자극 실험을 수행하기 전에 세포가 하룻밤 사이에 부착되도록 허용합니다. 세포 간 조사의 경우, 실험이 수행되기 전에 세포 간 갭 접합을 발현하는 세포에 대해 37°C에서 48h를 허용한다.</li>
	<li>50 μg 플루오-4 AM에 DMSO의 50 μL을 추가하여 칼슘 민감한 염료 스톡 용액(-20°C)을 준비한다. DMEM의 1mL에 1 μL의 염료를 희석하여 염색 용액을 준비합니다.</li>
	<li>세포에서 배양 배지를 흡인하고 염색 용액 1mL을 추가합니다. 염료가 37°C에서 20-30분 동안 세포안으로 내면화되도록 허용한다. 멸균 PBS로 염료를 흡입하고 두 번 헹구세요.</li>
	<li>마지막으로, 미리 따뜻해지는 페놀 레드 프리 DMEM 미디어 1mL을 추가하고, 세포내 플루오-4가 37°C에서 30분 동안 탈에스테르화를 받을 수 있도록 한다.</li>
	<li>이미징 및 자극을 위해 현미경으로 세포를 전송합니다.</li>
</ol>3. 광학 이미징 및 자극
<ol><li>가습 된 마이크로 인큐베이터를 37 °C및 버블 공기 -CO2 혼합물 (95:5)으로 예열합니다.</li>
	<li>칼슘 이미징 및 광학 자극을 위해 광 경로에 결합된 레이저 라인과 현미경을 사용하십시오. 참고: 스캐닝 공초점 현미경은 점 자극 기능으로 인해 가장 간단한 옵션입니다. 그러나, 이 절차는 빔 스플리터를 사용하여 광 경로의 무한공간으로 콜라진 레이저 빔을 결합하여 임의의 표준 플로레스세임 현미경을 사용하여 수행할 수 있다. 모든 현미경 목적은 이를 통과한 레이저가 초점 평면의 회절 제한 레이저 지점에 초점을 맞출 수 있도록 설계되었습니다. 레이저 파장이 여기 빛에 가까워야하므로 이색 거울에 의해 반사되고 흥분 필터에 의해 전달됩니다.</li>
	<li>SiNWs를 시각화하고 밝은 필드 현미경 검사법, 전송 된 빛 또는 반사 광을 사용하여 자극 부위를 결정합니다. 그런 다음, SiNW의 미리 정의된 위치에서 자극 점을 유지하면서 형광 모드로 광 경로를 재구성한다.</li>
	<li>각 SiNW 크기와 세포 유형에 대한 최적의 자극 력과 펄스 길이를 검증하여 자극된 세포에 대한 광열 손상을 최소화합니다. 일반적인 자극 프로토콜의 경우, 세포내 칼슘 활성의 2-10s 기준선 기록을 수행한다. 그런 다음, 1-10mW 전력및 1-10ms 지속시간(30-300 kW/mm2에해당)의 단일 레이저 펄스를 적용하여 SiNW를 자극하고, 생성된 칼슘 파를 2-10s에 기록한다. 참고: 각 SiNW 크기와 셀에 대한 광학 전력 및 펄스 길이를 최적화하는 것이 필수적입니다. 이것은 자극된 세포에 대한 광열 손상을 최소화하는 데 필요합니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 필요한 경우 광학 자극의 녹화 된 영화를 전송합니다.</li>
</ol>4. 비디오 처리
<ol><li>각 픽셀에 대한 형광 수의 변화를 계산하고 나머지 기준선의 평균 값으로 정규화하는 ImageJ18에사용할 수 있는 "dF over F"매크로(17)를 사용하여 플루오-4 형광의 변화를 시각화합니다. 추가 처리를 위해 출력(부동 점 형식)을 8비트로 변환합니다.</li>
	<li>ImageJ에서 사용할 수 있는"이상값 제거"선택적 중앙값 필터를 사용하여 dF/F 동영상을 더 처리합니다. 매개 변수를 정의하여 값이 2픽셀 반경의 중앙값보다 10이상 인 픽셀을 제거하고 해당 픽셀 값을 중앙값으로 바꿉다.</li>
	<li>Matlab 컴퓨터 비전 툴박스에 구현된 대로 루카스-카나데 알고리즘을 통해 각 프레임의 광학 흐름을 계산합니다. 이 함수의 출력은 각 이미지의 각 지점에서 광학 흐름의 x 및 y 구성 요소를 포함하는 벡터 필드(코드는 보충 파일 1에서사용할 수 있음)이었다. 참고: 세포 내의 평균 광학 흐름,&θ>, 세포 내칼슘 플럭스의 개발에 해당합니다. 광학 흐름의 차동인 Δ&lt> 신호가 최대화된 위치를 식별하여 칼슘 신호가 활성화된 시점을 제공합니다. 또한, Δ&lt&θ>최대 크기의 칼슘 웨이브 전선이 세포를 통과하는 속도와 상관관계가 있습니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따라 칼슘 전송의 세포 간 속도를 계산합니다. vCa2 + = rij / (t최대, j - t 최대, i ), 여기서 t최대, j 및 t 최대,나는 각각 세포 J와 i에 대한 활성화의 시간이며, rij는 세포의 중심 사이의 거리입니다.</li>
</ol>

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<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
<li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).</li>
<li>Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).</li>
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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

우리는 여기에서 세포의 세포내 전기 자극을 수행하는 간단한 방법을 시연했습니다. 이 데모에서는 SiNWs와 사전 혼성화된 MF를 사용한 다음 CM과 공동 배양했습니다. 일반적으로, 대부분의 증식 세포는 SiNWs를 내면화하는 경향이 있습니다, 이는 많은 다른 세포 모형을 가진 이 방법론의 사용을 허용합니다. 더욱이, 우리는 세포의 세포 내 자극을 입증하는 동안, 동일한 원리는 세포의 세포 외 자극을 수행하기 위해 사용될 수있다. 이것은 자발적으로 그(것)들을 내면화할 세포의 내수 폭포15를 차단하거나 SiNWs를 내면화하지 않는 세포를 사용하여 행해질 수 있습니다. 예를 들어, CM은 일부 나노 구조(20,21)를내면화하는 것으로 밝혀졌지만 SiNWs15를자발적으로 내면화하지 는않습니다. 여기에 사용된 SiNWs는 화학 ...

모든 생물학적 유기체는 이온의 형태로 전기를 사용하여 세포 행동을 조절합니다. 세포막에는 이온의 수동적이고 능동적인 운반을 허용하는 다양한 유형의 특정 이온 채널을 함유하고 있습니다. 이 이온은 흥분하는 세포의 기능을 지배, 신경 활동 및 골격 및 심장 근육 수축 등. 그러나, 바이오전기는 또한 세포증식1,신경면역2,3,4,줄기세포 분화5와같은 많은 세포 기능을 지배하는 비흥분성 세포에서 중요한 역할을 한다.
최근 수십 년 동안 바이오 전기 분야는 점점 더 높은 관심을 불러 왔으며, 이는 바이오 전자 인터페이스를 위한 수많은 기술 개발에 기여했습니다. 마이크로 전극 패치 파이펫은 세포 내 기록 및 자극6의금 본위제이다. 이 방법론에서는 특정 조건에서 유리 파이펫을 당겨 공공 크기가 거의 없는 날카로운 모서리를 형성합니다. 이 파이펫은 버퍼로 채워지며 파이펫을 사용하면 세포 내 부피와 버퍼의 직접 접촉할 수 있습니다. 이로 인해 매우 높은 신호대 잡음 비, 셀룰러 전기 활동을 정밀하게 제어하며 매우 높은 시간적 분해능을 생성하는 바이오 전기 인터페이스가 생성됩니다. 이 방법론은 최근 나노 파이펫 구성7로축소 된 매우 강력한 도구이지만 몇 가지 중요한 기술적 한계와 관련이 있습니다. 사이토솔 희석 효과8,기계적 진동뿐만 아니라, 단기 심문에 유틸리티를 제한하고, 고가의 전문 장비와 높은 수준의 기술 기술이 필요합니다. 더욱이, 그것의 부피가 기록되거나 동시에 자극될 수 있는 세포의 수를 제한하고, 그것의 침략으로 인해, 실험을 통해 재구성될 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 전극 어레이가 개발되었지만 전극의 크기는 세포 내 액세스뿐만 아니라 공간 해상도를 제한합니다. 나노 전극 어레이는 세포 내 기록 및 자극을 허용하지만 사이토솔9,10에액세스하기 위해 연마 전기 포기가 필요합니다. 또한, 이러한 모든 방법론은 기판에 결합되어 따라서 체외 세포 배양, 또는 외부 피상 세포로 제한되며, 3차원(3D) 조직 내부에 있는 세포에 접근할 수 없다.
광유전학(11)은 이러한 3D 및 생체 제한 문제를 해결하기 위해 널리 사용된다. 그러나, 광유전학적 방법은 혈장 막에 분포되는 광 활성화 플라즈마 멤브레인 이온 채널의 동요를 기반으로 하며, 3D 공간해상도(12)와 세포내 기능을 제한한다.
우리는 최근에 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)가 다른 비 흥분 세포, 즉 심장 근섬유 세포 및 올리고덴드로키테(13)와하위 micron 공간 해상도와 세포 내 생물 전적 심문을 수행하는 데 사용할 수 있음을 보여 주었다. 더욱이, 우리는 3D 심장 조직 내에서 전 생체 세포 특정 심문을 수행하기 위해 이러한 SiNWs를 사용하여 심장 세포가 생체14에서전기적으로 결합하는 방법을 조사하였다. 이 방법론의 주요 장점은 단순함입니다. 그것은 어떤 유전 적 변형 또는 부피가 큰 계측을 필요로하지 않습니다. 많은 세포가 초음파 처리 또는 전기화15에대한 필요없이 자발적으로 사진 반응 SiNWs를 내면화합니다. 또한, 그들은 자발적으로 내피 캡슐화를 탈출하고 사이토솔 및 세포 내세포세포(13,15)와원활한 통합을 형성한다. 셀-실리콘 하이브리드라고 불리는 이 셀-SiNWs 복합체는 SiNWs의 연동적이고 부드럽고 다재다능한 특성뿐만 아니라 SiNWs의 광전 기능을 가지고 있습니다. 혼성화 후, 세포-SiNW 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확하고 세포내 바이오전 자극과 같은 다양한 용도에 사용될 수 있다; 체외에서 세포 간 바이오 전기 커플링을 공부; 그리고 생체 내 세포 특정 심문. 효과적인 자극은 높은 광학 전력 밀도와 SiNWs의 공동 국소화가 필요하므로 2D 및 3D 모두에서 높은 공간 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 방법론뿐만 아니라 결과를 분석할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 초점은 체외에서 세포 내 및 세포 간 조사에 배치됩니다, 그러나 이 방법론의 생체 내 구현은 많은 그밖 생물학 시나리오에 직접 이용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>35mm 유리 바닥 접시</td><td>Cellvis</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr><tr><td>3i Marianas Spinning Disk Confocal</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CellMask 주황색 플라즈마 멤브레인 염색</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리</td><td>Gibco</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>디럭스 다이아몬드 스크라이빙 펜</td><td>Ted Pella</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루베이트, 글루타민 없음</td><td>Gibco</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 무수</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 인증, 열 비활성화,</td> <td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin Human Protein, 혈장</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 112xx 시리즈 고급 초음파 세척기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB11201</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4, AM, 세포 투과성</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM 매체</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>OKO 완전 환경 제어 챔버(일정) 온도, 습도 및 CO2)</td><td>OKO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Myofibroblasts는 자발적으로 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)를 내면화 할 수 있습니다, 그들에게 바이오 전자 응용 프로그램에 대한 매력적인 대상이 될 수 있습니다. 이러한 셀-실리콘 하이브리드는 정상적인 세포 거동에 최소한의 교란을 통해 납없는 광학 변조 기능을 제공합니다. 광학 기능은 SiNWs의 광열 및 광전 특성에 의해 얻어진다. 이러한 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확한 다음 다른 생물학적 시나리오에 적용할 수 있습니다. 우리는 이 혼성이 어떻게 심장 세포의 전기 결합을 연구하고 근섬유 세포가 서로 또는 심근세포에 어떻게 결합되는지 비교하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 여기에서 보여줍니다. 이 과정은 결합 된 레이저 라인과 형광 현미경을 넘어 특별한 장비없이 달성 할 수 있습니다. 또한 배양시 다른 세포 들 사이 칼슘 전파의 정량화를 허용하는 맞춤형 MATLAB 루틴의 사용이 도시되어 있습니다. 근섬유 세포는 심근 세포보다 느린 전기 반응을 보이는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 근섬유세포 세포 간 전파는 약간 느리게 보여줍니다, 비록 그들의 세포 내 속도에 비교 속도, 갭 접합 또는 나노 튜브를 통해 수동 전파를 제안. 이 기술은 매우 적응력이 뛰어나며 생체 외뿐만 아니라 생체 내 또는 전 생체 내 조사를 위해 다른 셀룰러 경기장에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

세포 내 사이토솔에 직접 접근할 수 있도록 하는 이 방법론의 능력은 세포로 SiNW의 자발적인 내산화에 달려 있습니다. SiNWs는 많은 세포 유형으로 자발적인 내면화를 겪을 것이지만15,심근세포 및 뉴런과 같은 일부 세포는 내산화를 허용하기 위해 SiNWs를 치료해야합니다19. 이 프로토콜에서 우리는 200-300 nm 직경및 심장 MFs로 길이 ~1-3 μmp의 내화 과정을 설명합니다. 표준 상 대비 광학을 사용하여 컨물수 세포는 쉽게 명백했습니다. 그러나 SiNWs는 거의 보이지 않았지만 위치를 정의할 수 없었습니다. 따라서, 우리는 어두운 필드 현미경 검사를 사용, 반사 객체만 볼 수 있고 배경은 어두운. 그러나 이 대조적으로, 세포는 반사되지 않기 때문에 볼 수 없습니다. 세포에서 SiNW의 위치를 보여주기 위해, 우리는 세포 내의 SiNWs의 회핵 배열이 명백하도록 이미지를 함께...

이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

이 기술은 표준 광학 현미경 검사법만을 사용하여 매우 높은 공간 해상도 및 세포 특이성을 가진 세포 내 생체 전기 적 심문을 허용합니다. 이 방법은 세포 내의 세포 및 특정 위치의 자극 및 전기 적 심문을 용이하게하고 3D 전 생체 조직 제제뿐만 아니라 시험관 내에서 수행 될 수있다. 이 기술은 심장 또는 뇌 세포와 같은 많은 세포 분야의 생체 전자 조사뿐만 아니라 우리의 모든 비 흥분 세포 사이의 전기 통신을 가능하게합니다.근섬유아세포 심근세포 현탁액으로부터 근섬유아세포를 분리하기 위해 심근세포가 1시간 동안 100mm 조직 배양 접시에 분리된 세포를 미리 플레이트화하여 심근세포가 섬유목과 처리된 표면을 부착해야 하므로 부착한다. 인큐베이션의 끝에서, 다운스트림 공동 배양에 대한 상퍼를 포함하는 농축 된 심근세포이를 수집합니다. DMEM으로 심섬유 아세포를 헹구면 남은 심근세포를 제거하고 2~4일 의 추가 배양 전에 신선한 배양 배지로 세포를 공급합니다.세포가 80%에 도달하면 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 웨이퍼에서 3mm 칩을 화학 증기 증착 성 실리콘 나노와이어로 잘라냅니다. 그리고 70 %에탄올에 칩을 헹구기 위해 날카로운 집게를 사용합니다. 헹구고 바이오 안전 라미나르 플로우 후드에서 자외선 아래에서 30분 동안 칩을 공기 건조한 후 칩을 멸균 마이크로 원심분리기로 옮겨냅니다.완전한 세포 배양 배지 헹구기를 사용하여 남은 에탄올을 제거한 후 초음파 욕조에서 신선한 배양 배지의 1 밀리리터로 칩을 초음파 처리합니다. 나노 와이어가 방출될 때 상체는 흐려져야 합니다. 실리콘 나노 와이어 서스펜션을 신선한 배양 배지의 5 밀리리터에 혼합하고 나노 와이어 용액을 심섬유 아세포의 접시에 시드하십시오.세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후, 신선한 배양 배지로 접시를 5회 헹구어 어떤 비내화 나노와이어를 제거하고 일부 내재된 나노와이어가 완전히 통합될 수 있도록 세포를 또 다른 시간 동안 배양한다. 다음으로 갓 준비된 콜라겐 코팅 용액 500마이크로리터를 35mm 유리 바닥 접시에 넣습니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 잠복한 후 멸균 PBS로 접시를 헹구고 실리콘 나노와이어 근섬유아세포 하이브리드를 수확하여 트립신 3밀리리터를 섭씨 37도에서 2분간 수확합니다.세포가 분리되면 배양 배지의 10 밀리리터로 반응을 멈추고, 파이펫팅에 의해 적극적으로 헹구고 세포를 손상시키지 않도록 200G 이상 원심 분리하지 마십시오. 그런 다음 하이브리드 세포 펠릿을 신선한 배지의 1 밀리리터로 다시 중단하고 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시에 세포를 시드합니다. 나노 와이어 내산화를 확인하려면 표준 프로토콜에 따라 형광 시토솔 및 멤브레인 염료로 세포를 라벨링하고 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다.실리콘 나노 와이어는 매우 반사, 반사 광 대신 그들의 시각화에 대 한 형광 을 사용할 수 있습니다. 심오섬유블라스트 실리콘 나노와이어 하이브리드 심근세포 공동배양을 설정하려면 각 세포 유형의 적절한 수를 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시에 시드한다. 그리고 세포가 세포 간 간격 접합을 형성할 수 있도록 48 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.실험 당일, 문화상수체를 갓 준비한 칼슘 에민감한 염료로 보충한 1밀리리터의 배양 배지로 대체하여 섭씨 37도에서 20~30분 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 미리 따뜻하게 페놀 레드 프리 DMEM의 1 밀리리터로 세포를 치료하기 전에, 멸균 PBS로 접시를 두 번 세척. 그런 다음 세포 내 칼슘 염료가 기준선 이미지를 획득하기 전에 섭씨 37도에서 30 분 동안 탈 에스테르화를 겪을 수 있도록하십시오.광학 이미징 및 자극 전에, 컬리컬 레이저 라인과 현미경에 가습 된 마이크로 인큐베이터를 예열하여 광 경로에 결합되어 칼슘 이미징 및 광학 자극을 섭씨 37도및 5 % 버블 시대 이산화탄소 혼합물로 예열하십시오. 현미경이 준비되면, 심섬유 블라스트 하이브리드 심근 세포공동 배양을 마이크로 인큐베이터에 넣고 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 나노 와이어를 시각화하여 적절한 자극 부위를 찾습니다. 사이트가 확인되면, 나노 와이어의 미리 정의된 위치에서 자극 점을 유지하면서 형광 모드로 광 경로를 재구성하고, 각 실리콘 나노 와이어 크기와 셀 유형에 대해 최적의 자극 전력 및 펄스 길이를 검증한다.기준선 세포내 칼슘 활성의 2-10초 기록을 획득하고, 1-10의 레이저 펄스와 1-10밀리초의 지속 시간으로 나노 와이어를 자극하여 생성된 칼슘 파를 2~10초 동안 기록한다. 실험이 끝나면 광학 자극의 녹화된 영화를 적절한 소프트웨어 프로그램으로 전송하여 추가 분석을 한다. 표준 상 대비 광학을 사용하여, 합류 세포는 빛 현미경 검사법에 의해 쉽게 볼 수 있습니다.그러나 실리콘 나노와이어는 거의 보이지 않게 되어 이 방법으로 위치를 정의할 수 없습니다. 그러나 빛과 어두운 필드 이미지의 슈퍼 부과는 빛 반사 실리콘 나노 와이어의 페리 핵 배열의 시각화를 허용합니다. 공초점 현미경 검사는 형광 마커 염색 된 사이토솔 및 혈장 막을 시각화하는 데 사용할 수 있으며 실리콘 나노 와이어의 세포 내 위치를 보다 분명하게 만듭니다.표준 현미경 검사를 사용하여 자극되는 실리콘 나노 와이어의 위치를 식별하기 위해 밝은 필드 이미지를 얻을 수 있습니다. 자발적으로 구타 심근 세포와 휴식 심근 세포의 짧은 기준 선 비디오는 다음 취득 할 수 있습니다. 자극 후, 공동 배양 내의 칼슘 전파를 기록할 수 있다.다른 세포가 흥분되는 시간은 평균 광학 흐름의 변화가 최대치에 도달하는 지점에 의해 결정될 수 있습니다. 그런 다음 광학 흐름을 계산하여 각 세포 영역 내에서 활성화 시간을 식별하는 데 도움이 됩니다. 세포 내 속도는 카이마 그래프를 사용하여 각 세포에 대해 결정될 수 있으며, 세포 내 전파 속도의 반전을 나타내는 선의 경사와 함께 결정될 수 있다.예를 들어, 여기서, 단일 공동 배양 내의 세포 상호 작용을 위해 측정된 상이한 세포 내 및 세포 내 속도에 대한 요약을 관찰할 수 있다. 이러한 방법은 세포 실리콘 하이브리드를 조직에 직접 주입하고 3D 전 생체 내 제제를 사용하여 생체 내 전기 회사를 연구함으로써 생체 내 연구를 위해 활용할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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ChR2을 표현 성인에서 태어난 뉴런은 후각 신경 회로의 기능들에 대한 그들의 기여를 검토하기 위해 슬라이스 electrophysiological 준비로 조작할 수 있습니다.

뉴런의 사진 자극에 저렴한 LED 배열을 사용하여

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여기에서는 광 전달을위한 광섬유와 신경 기록을위한 전극 어레이가있는 옵트로드 시스템의 제조 방법을 제시합니다. 채널로돕신-2를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용한 생체내 실험은 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록을 동시에 위한 시스템의 실현가능성을 보여준다.

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이 프로토콜은 광학 및 전기 양방향 생체 인터페이스를 위한 고급 재료 제조 및 생체 외 쥐 심장 방법을 간략하게 설명하여 생체 전자 연구를 위한 정확한 심장 자극, 기록 및 경색 모델링을 가능하게 합니다.

Bidirectional electrical and Optoelectronic interfaces in healthy and ischemic ex vivo Rat Hearts(건강한 쥐와 허혈성 생체 외 쥐 심장의 양방향 전기 및 광전자 인터페이스)

학습하세요 실리콘 나노 와이어를 이용한 세포 내 광학 생체 조절 기법으로 심장 및 뇌 세포의 고해상도 생물전자학적 조사를 수행하는 방법입니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에서 정밀한 자극과 전기적 상호작용 연구에 활용됩니다.

실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

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