형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

당사의 프로토콜은 테살리타자르 적재 리포좀을 준비하기 위한 접근 가능한 방법과 세포 수준에서 리포좀 흡수를 평가하기 위한 철저한 접근 방식을 결합합니다. 이 기술은 저온 및 쉽게 구할 수 있는 장비를 사용하여 준비된 형광 표지 리포좀의 흡수를 평가하기 위한 편향되지 않은 방법을 제공합니다. 칼슘 아세테이트와 테살리타자르가 함유된 형광 표지 리포좀을 제조하려면 먼저 1/2인치 프로브를 사용하여 실온, 20킬로헤르츠 및 50% 전력에서 30초 동안 초음파 처리로 지질의 에테르 클로로포름 용액을 유화합니다.

균질화된 물 및 오일 에멀젼 용액을 특수 어댑터, 나노미터 게이지 및 압력 조절기 밸브가 있는 회전 증발기로 즉시 옮기고 증발기를 진공 라인에 연결합니다. 유기 용매를 제거하려면 회전 속도를 분당 100회전으로 설정하고 진공을 0.5기압으로 설정합니다. 겔이 형성되고 사라진 후 진공을 0.9기압으로 높이고 두 개의 기밀 주사기가 장착된 리포좀 압출기에서 200나노미터 붓기 폴리카보네이트 필터를 통해 리포좀 수성 분산액을 앞뒤로 여러 번 여과합니다.

동적 광 산란에 의한 크기 분포를 확인한 후 2ml 스핀 컬럼을 사용하여 리포좀에서 포착되지 않은 테살리타자르를 제거하고 분광 광도계를 사용하여 포착된 약물 농도를 측정합니다. 그런 다음 500마이크로리터 이하의 리포좀 샘플을 건조 컬럼 겔 베드에 추가합니다. 역안와 주사로 리포좀을 투여하려면 노출된 눈 위와 아래의 피부를 부드럽게 눌러 얼굴 평면 위로 눈을 들어 올립니다.

그런 다음 바늘 끝을 눈의 앞쪽 모서리에 조심스럽게 삽입하고 바늘이 건드리지 않고 구체 아래에 있는지 확인하고 리포좀을 후안와 공간에 천천히 주입합니다. 혈액 샘플을 채취하기 위해 적절한 실험 종료점에서 마우스의 흉곽 꼬리 끝 가장자리에 있는 피부를 조심스럽게 절개하고 가슴근이 노출될 때까지 동물의 머리를 향해 1cm 직선으로 자릅니다. 초기 절개 부위에서 머리를 향한 선에 수직으로 두 개의 작은 절개를 만들고 노출된 부위의 흉곽 한쪽에 있는 흉근을 조심스럽게 잘라내어 바늘 삽입 부위에 더 잘 접근하고 시각화할 수 있도록 합니다.

세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이에 바늘을 삽입하고 가능한 한 흉곽의 중심선에 가깝게 유지하고 주사기를 부드럽게 당겨 혈액 채취를 시작합니다. 가능한 한 많은 부피가 수집되면 얼음 위에 10마이크로리터의 0.5몰 EDTA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 혈액을 옮깁니다. 마우스의 양쪽에서 서혜부 조직 패드를 추출하려면 한 세트의 집게를 사용하여 복막을 오른쪽으로 잡고 두 번째 집게 세트를 사용하여 복막막 위의 피부 가장자리를 다른 쪽에 고정합니다.

피부를 멤브레인에서 부드럽게 당겨 층을 서로 분리합니다. 지방지방창고에 더 잘 접근할 수 있도록 피부의 바깥쪽 가장자리를 고정하고 피부를 따라 서혜부 지방조직 창고를 찾습니다. 그리고 필요에 따라 집게와 가위를 사용하여 림프절을 제거하기 위해 지방 저장소 중앙에 있는 서혜부 림프절을 찾습니다.

림프절을 제거한 후 집게를 사용하여 고정된 지점에서 가장 가까운 지방 저장소의 끝을 조심스럽게 잡고 지방 조직과 피부 사이의 결합막을 작게 자르기 시작합니다. 멤브레인에 더 잘 접근할 수 있도록 절단하는 동안 피부에서 지방 조직을 들어 올리고 얼음 위에 HEPES 완충액이 들어 있는 폴리에틸렌 바이알에 저장소를 놓습니다. 복막강의 꼬리 끝에서 부고환 지방 저장소를 추출하려면 집게를 사용하여 마우스의 등쪽 끝에서 첫 번째 부고환 지방 저장소를 부드럽게 당기고 이 저장소에서 부착된 부고환과 정관을 찾습니다.

그런 다음 지방 저장소와 부고환 및 정관 사이를 조심스럽게 잘라 지방을 다른 조직과 분리하고 얼음 위에 HEPES 완충액이 있는 폴리에틸렌 바이알에 데포를 넣습니다. 모든 조직을 채취한 후 가위 한두 쌍을 사용하여 지방 조직 샘플을 0.5mm 조직 조각으로 다집니다. 다음으로, 지방 조직 조각의 바이알에 1.5밀리리터의 2밀리리터 콜라겐분해효소 완충액을 첨가하고 바이알을 섭씨 37도, 분당 150회전의 진탕 인큐베이터에 30-45분 동안 넣습니다.

30분 후 1ml 피펫을 사용하여 샘플을 여러 번 분쇄합니다. 조직 조각이 여전히 너무 커서 쉽게 피펫팅할 수 없는 경우 샘플을 추가로 15분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 샘플이 완전히 분해되면 단편을 10회 더 분쇄하여 단일 세포 현탁액이 생성되도록 하고 개별 70마이크로미터 필터를 통해 각 샘플을 샘플당 하나의 50ml 튜브로 변형시킵니다.

각 파일을 5ml의 FACS 버퍼로 헹구어 남아 있는 세포를 수집하고 각 세척액을 얼음 위의 세포 샘플의 적절한 바이알로 여과합니다. 모든 샘플이 여과되면 원심분리로 세포를 수집하고 샘플에서 지방 세포 상등액을 흡인합니다. 다음으로, 기질 혈관 분획 펠릿을 그대로 둔 상층액을 조심스럽게 흡인하고 튜브당 1ml의 FACS 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 표준 프로토콜에 의한 유세포 분석이 이루어질 때까지 얼음 위의 새로운 1.5 또는 1.7 밀리리터 튜브로 현탁액을 옮깁니다. 동적 광 산란은 평균 리포좀 직경이 163.2나노미터이고 제타 전위가 마이너스 19.2밀리볼트임을 나타냅니다. 극저온 전자 현미경 이미징은 동적 광 산란에 의해 측정된 평균 직경에서 얻은 상대적으로 작은 표준 편차를 가진 원형 리포좀을 보여줍니다.

PBS를 처리한 마우스의 샘플에 대한 유세포 분석은 DiD 형광에서 하나의 대조군을 뺀 값으로 사용하여 DiD 양성 게이트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 대표적인 분석에서 알 수 있듯이, DiD의 밀리리터당 10밀리그램 리포좀 로딩 농도는 너무 높아 테스트된 세 조직 모두에서 세포분석기의 정량화 가능한 범위를 초과합니다. 밀리리터당 0.1 밀리그램 농도는 일부 신호를 보여주지만, PBS 처리된 세포를 넘어서는 명확한 집단은 관찰되지 않습니다.

따라서 PBS 대조군과 명확한 차이를 보여주면서 분석기에서 판독할 수 있는 밀리리터당 1밀리그램 농도는 리포좀 제제에 사용하는 것이 좋습니다. 각 조직 유형마다 약간 다른 게이팅 전략이 필요하지만 각 조직에서 동일한 세포 유형의 대부분을 식별할 수 있습니다. 관심 있는 특정 집단이 확인되면 각 세포 집단의 총 크기와 DiD 양성 빈도를 정량화할 수 있습니다.

시약과 장비를 준비하고 각 단계에 대한 결과를 예측하는 것이 중요합니다. 초기에 예상치 못한 결과가 나오면 미래의 결과를 망칠 수 있습니다. 조직학적 방법은 전체 조직 내 리포좀 국소화를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 이미징 유세포 분석은 세포별로 리포좀 내재화를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.