Name: 형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 형광 염료 표지 리포솜을 저온법으로 제조하고 유세포 분석으로 세포 수용을 평가하는 방법을. 이 기술은 약물 전달 연구와 세포 생물학에 활용됩니다.

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저자는 유세포 분석 교육 및 서비스를 제공한 Michael Solga와 나머지 Flow Cytometry Core 직원에게 감사를 표합니다. 저자는 또한 리포솜 준비(SSKD, DKB), 조직 수확(MAM, JCG), 유세포 분석 염색 및 샘플 수집(AU, PS, CM)에 도움을 준 Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye 및 Prasad Srikakulapu에게 감사를 표합니다. 이 작업은 AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 및 R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 및 T32 HL007284 보조금의 지원을 받았습니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에서는 (i) 형광 지질 염료로 표지되고 항당뇨 화합물인 테사글리타자르가 로드된 리포솜을 준비하고, (ii) 역궤도 주사를 통해 마우스에 리포솜을 투여하고, (iii) 유세포 분석을 통해 세포 수준에서 리포솜 흡수를 감지하기 위해 조직을 수확, 처리 및 염색합니다. 이 프로토콜은 약 150μm 리포솜의 준비와 지방, 혈액 및 비장의 흡수 평가를 검토합니다. 리포솜 제제는 확장 가능하고 대부분 실온에서 수행되며 역상 증발을 활용하여 약물 로딩 및 유기 용매 제거를 극대화합니다. 이 프로토콜을 사용하면 정제된 리포솜 샘플에서 최대 2mg/mL 테사글리타자르 농도를 달성할 수 있습니다. 제조된 리포솜은 4°C의 HEPES 완충액에 1년 이상 보관할 수 있습니다. 우리의 경험에서, 그들은 평균 입자 크기의 최소한의 변화를 보여주었습니다. 10kDa 원심 필터를 사용하여 외부 약물로부터 리포솜을 한외여과 분리한 후 10% 미만의 약물 함량 손실이 분광광도계로 입증되었습니다.
리포솜을 준비하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계와 요소가 있습니다. 첫째, 프로토콜 단계의 순서가 중요하며 준수해야 합니다. 둘째, 테사글리타자르를 로딩할 때 사용되는 용액의 pH는 용해도와 효과적인 로딩을 최대화하기 위해 7.4로 유지되어야 합니다. 셋째, 장비와 필터의 적절한 조립은 각 단계의 출력이 적절한 크기와 순도를 갖도록 합니다. 예를 들어, 100nm 및 200nm 필터가 제대로 조립되지 않으면 더 이질적이고 부적절한 크기의 리포솜 배치가 발생할 수 있습니다. 넷째, 테사글리타자르가 리포솜으로 전달되는 것을 최대화하기 위해서는 약물 로딩 전에 Ca-아세테이트를 완전히 제거해야 합니다. Ca-아세테이트의 완전한 제거를 테스트하려면 고속 침전을 사용하여 리포솜을 제거한 다음 비리포솜 용액에서 Ca-아세테이트 수준을 측정합니다. 다섯째, 각 단계에서 리포솜 제제에 첨가되는 모든 물질의 질량을 측정하고 기록하는 것이 중요합니다. 이를 통해 적절한 농도를 계산할 수 있고 필요한 재료 비율을 유지할 수 있습니다. 마지막으로, 기술이 제대로 실행되지 않으면 바람직하지 않은 수준의 이질성이 있을 수 있습니다. DLS 및 전자 현미경과 같은 다른 접근 방식을 사용하여 이 매개변수를 철저히 확인하는 것이 중요합니다. 균질성을 향상시키려면 선택한 필터 크기를 조정하거나 두 개의 필터를 쌓는 것이 좋습니다.
또한 이 프로토콜을 완전히 수행하기 전에 유세포 분석을 위한 대조군 및 항체 패널을 계획하고 최적화하는 것이 중요합니다(표 1, 표 3). 항체는 염색에 적절한 농도가 사용되고 형광단 간의 겹침이 최소화되는지 확인하기 위해 테스트해야 합니다. 리포솜 준비 중에 사용되는 염료의 여기 및 방출도 패널 계획에 포함되어야 합니다. 우리의 결과에서, 우리는 Allophycocyanin (APC) 및 AlexaFluor 647과 같은 형광단과 유사한 여기 및 방출을 갖는 DiD를 활용했습니다. 따라서, 우리는 항체 패널에서 이러한 형광단에 접합된 항체를 선택하지 않았습니다. 또한 isotype 컨트롤은 이 프로토콜에 포함되지 않습니다. 이는 이 프로토콜을 위해 선택된 항체가 잘 검증되고 상업적으로 이용 가능한 항체이기 때문입니다. 그러나 이전에 최적화되지 않은 항체를 사용하는 데 관심이 있는 경우 전체 실험을 수행하기 전에 관심 조직의 이소타입 대조군에 대해 항체를 테스트하는 것을 고려하십시오.
이 프로토콜은 치료 후 마우스에서 혈액, 비장, 사타구니 지방 및 부고환 지방 조직을 추출하고 처리하는 방법을 보여주지만 이 일반적인 접근 방식은 다른 조직에 적용할 수 있습니다. 관심 조직에 따라 처리 및 소화 프로토콜을 변경해야 할 수도 있습니다: 폐21, 간22, 복강강 3, 골수3,23, 뇌 24.
고려해야 할 이 방법의 중요한 한계는 흡수가 동물당 한 시점에서만 평가될 수 있다는 것입니다. 따라서, 이 프로토콜을 다른 비침습적 이미징 기술과 결합하거나 평가를 수행하기 위한 충분한 자원을 보장하기 위해 그에 따라 계획하는 것이 유리할 수 있다. 리포솜은 처음 24시간 동안 몸 전체를 순환하며 리포솜을 흡수하는 세포의 수명 또는 흡수에 반응하는 방식에 따라 세포 사멸 또는 추가 식균 작용이 발생할 수 있습니다. 우리의 이전 연구는 다른 시점에서 DiD+ 인구의 인구 특성의 변화를 보여주었습니다3. 이러한 이유로 관심 메커니즘의 생물학과 가장 관련이 있는 초기 시점 또는 시점에서의 섭취를 평가하는 것이 중요합니다. 또한 이 프로토콜을 사용하여 전체 조직에서 세포 흡수의 정량화를 수행할 수 있지만 유세포 분석으로는 조직 국소화를 밝힐 수 없습니다. 이 접근법을 조직학적 방법과 결합하면 이러한 한계를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로 이 프로토콜은 조직학 및 전신 형광 이미징과 같은 기존 방법론을 보완합니다. 유세포 분석 도구 및 방법의 지속적인 발전으로 점점 더 구체적인 세포 집단에 대한 더 큰 패널의 개발이 가능해질 것입니다. 앞서 언급한 방법과 함께 이 프로토콜을 사용하면 세포 흡수 평가가 향상되고 유세포 분석으로 관찰된 결과를 검증할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 예를 들어, 지방 조직에 있는 대부분의 입자가 유세포 분석에 의해 대식세포에 흡수되었다는 것이 밝혀져야 합니다. 동일한 지방 조직의 추가 분취액의 면역형광은 세포 유형이 실제로 리포솜을 흡수하는지 확인하기 위해 대식세포 마커에 대해 저장, 고정, 절편 및 염색될 수 있습니다. 이 접근법은 세포 특이적 표적화 검증, 세포 흡수 정량화, 표적 이탈 흡수 식별, 관찰된 치료 결과에 대한 기계론적 가설을 생성하기 위한 정보 제공 등 수행된 나노입자 생체분포 분석에 엄격함을 더해야 합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 리포솜을 사용하고, 다른 조직에서의 흡수를 조사하고, 비만 및 대사 장애 또는 나노 입자 전달이 실현 가능한 치료 옵션인 기타 질병 환경에서 새로운 화합물을 테스트하는 향후 연구에 적용할 수 있습니다.

나노입자 약물 전달을 활용한 치료법 개발에 대한 관심이 높아짐에 따라 입자 분포 및 흡수를 준비하고 평가하는 방법은 계속해서 발전, 확장 및 연구 커뮤니티에서 접근할 수 있어야 합니다 1,2. 이 프로토콜은 과산화소체 증식제 활성화 수용체(PPAR)-α/γ 작용제인 테사글리타자르(tesaglitazar)가 로드된 DiD 표지 리포솜으로 처리한 후 생체 내에서 리포솜을 흡수한 정확한 세포 유형을 평가하기 위해 개발되었습니다 3,4. 이 연구에서 우리는 리포솜 테사글리타자르 치료에 의해 직접적인 영향을 받는 세포 유형, 표적 모이어티의 효능을 평가하고 관찰한 치료 결과를 설명하기 위한 가설을 생성할 수 있었습니다. 또한, 다양한 세포 유형에서 확립된 생물학적 기능은 대식세포, 수지상 세포 및 간 특이적 쿠퍼 세포와 같은 식세포가 리포솜의 대부분을 차지한다는 것을 시사합니다 5,6,7. 이 프로토콜을 활용하여 우리는 비고전적 식세포도 리포솜 3,4를 흡수할 수 있음을 입증했습니다.
이 프로토콜은 테사글리타자르를 가용화하고, 역상 증발에 의해 리포솜을 준비하고, 원격 약물 로딩을 위한 유인제로 칼슘 아세테이트를 사용하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다. 제시된 방법은 많은 실험실에서 접근할 수 있으며 고온이 필요한 구하기 어려운 재료와 단계가 부족합니다. 이 프로토콜은 생체 내 순환 증가에 최적인 크기의 리포솜을 생산한다8. 또한, Su et al.에 의해 요약된 바와 같이, 현재까지 생체 내 리포솜 분포 및 조직 흡수를 평가하는 방법이 깊이9에서 연구되고 테스트되었습니다. 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 형광 분자 단층 촬영 (FMT) 방법을 사용하여 조직 특이 적 생체 분포 및 흡수를 정량화합니다 9,10,11. 이러한 방법은 생체 내 검출을 극대화하도록 최적화되었지만 세포 분해능에서 생체 내 리포솜 흡수를 정량화하는 능력은 여전히 부족합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 유세포 분석을 사용하여 이러한 요구를 달성하는 것을 목표로 합니다. 마지막으로, 이 프로토콜의 경우 세포 흡수를 지방 조직을 포함한 몇 가지 조직으로 좁혔습니다. 비만, 신진 대사 장애 및 염증 12,13,14,15,16,17의 환경에서 치료법을 전달하기 위해 나노 입자를 사용할 가능성을 조사하는 문헌이 늘어나고 있습니다. 따라서 우리는 이러한 병리에서 중요한 역할을 하는 조직 중 하나인 지방 조직을 처리하고 분석하기 위한 효과적인 방법과 프로토콜을 공유하는 것이 중요하다고 느꼈습니다.

<table><tbody><tr><td>1-mL 주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10-mL 주사기</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>25 게이지 바늘, 역궤도 주입용 멸균</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>27 게이지 바늘, 역궤도 주입용 멸균</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>클론 RA3-6B2</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>클론 AFS98</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11b PerCP Cy5.5 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>클론 M1/70</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD11c APC ef780 항체</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>클론 N418</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>클론 1D3</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3 FITC 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>클론 145-2C11</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>클론 390</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>클론 30-F11</td></tr><tr><td>안티 마우스 F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>클론 BM8</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>탈염 스핀 컬럼</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>Zeba 스핀 컬럼</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>동적 광 산란, Nicomp 370</td><td>입자 크기 측정 시스템, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & PERM 세포 투과화 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>거즈 스폰지</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>리포좀 압출기</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>안과 윤활제</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20g/70 oz 멸균</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 16% w/v aq. soln., 메탄올 프리</td><td>Alfa Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>다진 용 폴리에틸렌 바이알</td><td>Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td>회전 증발기</td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>T/펌프 열 요법 펌프 및 패드</td><td>Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>트랙 에칭 폴리카보네이트 멤브레인</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore 폴리카보네이트 친수성 멤브레인</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS 시스템</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 염료 표지 리포솜의 in vivo tissue-specific cellular uptake의 준비, 투여 및 평가

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

특히 표적 치료 접근법을 위해 생체 내에서 화합물을 전달하기 위해 리포솜을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있습니다. 리포솜 제형에 따라 리포솜은 신체의 다른 세포 유형에 의해 우선적으로 흡수될 수 있습니다. 이는 상이한 질환의 진행이 조직- 및 세포-유형-특이적이기 때문에 치료용 입자의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에서는 DSPC, 콜레스테롤, PEG-2000 DSPE 및 지질 염료 DiD를 형광 표지로 사용하여 리포솜을 합성하고 형광 표지하는 한 가지 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 또한 생체 내에서 리포솜을 전달하고 유세포 분석을 사용하여 리포솜의 세포 특이적 흡수를 평가하기 위한 접근 방식을 제시합니다. 이 접근법은 리포솜을 흡수하는 세포 유형을 결정하고 세포 유형 및 조직 전반에 걸쳐 리포솜 흡수의 분포와 비율을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 언급되지 않았지만 세포계의 면역형광 및 단일 세포 형광 이미징과 같은 추가 분석은 세포내 염색을 평가할 수 있으므로 모든 결과 또는 결론을 강화할 것입니다. 프로토콜은 관심 조직에 따라 조정해야 할 수도 있습니다.

리포솜 생산
여기에 게시 된 결과는 이전에 게시 된 작업 3,4,20의 결과와 유사합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 활용하여 약 150-150nm 크기의 리포솜을 생산할 것으로 예상합니다. DLS는 163.2 nm의 평균 리포솜 직경과 -19.2 mV의 제타 전위를 나타냅니다(그림 1A). 극저온 전자 현미경(Cryo-EM) 이미징은 원형 리포솜을 보여주며(그림 1B), DLS 다이어그램은 평균 직경에서 상대적으로 작은 표준 편차를 보여줍니다(그림 1C).
양성 리포솜 결합에는 PBS 처리된 대조군이 필요합니다.
이 프로토콜을 사용하는 우리 그룹의 이전 연구에서는 생체 내 투여 1주 후 지방 SVF, 비장 및 혈액의 세포 하위 집합이 리포솜에 결합하는지 조사했습니다 3,4. PBS 처리된 마우스를 사용하여, 복강 및 비장 세포를 리포좀 처리된 마우스로부터의 샘플에 사용된 것과 동일한 항체 패널로 염색하였다. 처리 1주일 후에 조직을 채취하였다(도 2A). PBS 처리된 마우스의 샘플은 양성 DiD 게이트를 생성하는 DiD FMO 역할을 했습니다(그림 2B,C). DiD 양성 신호를 사용하여 포지티브 게이트를 생성할 수 있지만 DiD 신호가 없는 샘플은 양성 게이트에 DiD 음성이 포함되어 있지 않은지 확인하는 데에도 사용해야 합니다.
형광 신호를 최적화하기 위해 적정이 필요합니다
전체 실험을 실행하기 전에 세포 염색 중에 사용되는 형광 접합 항체의 농도 및 리포솜 준비 중에 사용되는 지질 염료의 농도를 포함한 다양한 조건을 최적화해야 합니다. 유세포 분석기는 형광 강도에 대한 검출 상한이 있으므로 리포솜에 너무 많은 염료가 포함되면 세포분석기를 통과하는 샘플에서 정량화할 수 없는 수준의 DiD 신호가 발생합니다. 또한 리포솜에 DiD가 너무 많으면 높은 수준의 비특이적 염료 전달이 발생하여 세포 흡수 결과가 왜곡될 수 있습니다. 그림 3은 사용된 유세포분석기의 검출 범위 내에서 최적의 신호를 생성할 수 있는 농도를 식별하기 위해 지질 염료의 농도를 적정한 실험의 결과를 보고합니다. 이것은 최종 실험을 위해 관심 조직인 혈액(그림 3A), 사타구니 지방 SVF(그림 3B) 및 부고환 지방 SVF(그림 3C)에 대해 수행되었습니다. 테스트를 위해 선택된 농도는 리포솜 1mL당 10mg의 DiD(높음, 빨간색), 1mg DiD(중간, 파란색) 또는 0.1mg의 DiD(낮음, 회색)였습니다. 리포솜에 사용된 최고 농도는 너무 높았고 세 조직 모두에서 세포분석기의 정량화 가능한 범위를 초과했습니다(그림 3A\u2012C, 빨간색). DiD의 가장 낮은 농도는 약간의 신호를 보였지만(그림 3 A\u2012C, 회색), PBS 처리된 세포(그림 3A\u2012C, 검은색)를 넘어서는 명확한 집단은 관찰되지 않았습니다. 정량화할 때 각 조직 및 농도에 대한 DiD MFI의 산술 평균은 PBS 대조군과 DiD 중간 농도 간의 명확한 차이를 보여주었습니다(그림 3D). 따라서 프로토콜에 표시된 대로 리포솜 준비에 사용할 중간 농도(그림 3, 파란색)를 선택했습니다.
다중 항체 패널을 사용하면 서로 다른 세포 하위 집합에 의한 리포솜 흡수를 식별할 수 있습니다
표 3에 요약된 패널을 사용하여, 세포를 대식세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포, 단핵구 및 내피 세포에 대한 마커에 대한 항체로 염색하였다(도 4). 각 조직 유형에 대해 약간 다른 게이팅 전략이 필요하지만 각각에서 동일한 세포 유형의 대부분을 식별할 수 있습니다. 일부 예외에는 일반적으로 혈액에서 발견되지 않는 내피 세포와 일반적으로 다른 조직보다 혈액에서 더 높은 빈도를 갖는 단핵구가 포함됩니다. 집단이 식별되면 각 세포 집단의 총 크기와 DiD+ 빈도를 정량화할 수 있습니다. DiD+ 모집단을 특성화하기 위해 추가 계산을 수행할 수 있습니다: DiD+ 세포의 몇 퍼센트가 대식세포, 내피 세포 등인지. 이는 게이팅 전략의 예이지만 샘플을 분석하는 유일한 방법은 아닙니다. 분석은 선택한 패널과 사용 가능한 유세포 분석기에 의해 결정됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> 그림 1: 제조된 리포좀의 특성 예. (A) 크기 및 제타 전위는 전술한 바와 같이 측정되었으며, 표 형태로 보고되었다. 각 모수는 표준 편차± 평균으로 표시됩니다. (B) Cryo-EM을 사용하여 제조된 리포좀을 이미지화했습니다. 흰색 눈금 막대의 길이는 50nm입니다. (C) DLS는 이 프렙에서 리포솜의 직경의 히스토그램을 생성하는 데 사용되었습니다. 이 그림은 Osinski et al.3에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> 그림 2: PBS 또는 리포솜 처리된 마우스의 대표적인 DiD 염색. (A) PBS 및 리포솜 치료에 대한 실험적 개략도. PBS 또는 리포솜을 1주일 동안 3회 주사하였다. 조직은 치료 8일째에 적출하였다. (비, 씨) 대표적인 흐름 플롯은 리포솜 처리(C)에서 양성 DiD 염색을 나타내지만 PBS 처리(B) 마우스에서는 그렇지 않습니다. FSC, 전방 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> 그림 3: 리포솜의 DiD 적정. 리포솜은 세 가지 다른 농도의 DiD로 준비되고 마우스에 주입되었습니다. 회색은 리포솜 1mL당 0.1mg DiD에서 낮은 농도를 나타내고, 파란색은 1mg DiD/mL 리포솜에서 중간 농도를 나타내며, 빨간색은 10mg DiD/mL 리포솜에서 높은 농도를 나타냅니다. PBS 처리된 마우스를 음성 대조군(검정색)으로 사용하였다. 혈액(A, 원), 사타구니 지방(B, 삼각형) 및 부고환 지방(C, 사각형)을 주사 후 24시간 후에 수확하고 처리하여 단세포 현탁액을 분리했습니다. 이 샘플은 유세포 분석기에서 검출 가능한 DiD 수준까지 실행되었습니다. 농도당 형광 강도(A\u2012C)를 입증하기 위해 각 처리 그룹의 오버레이가 있는 조직별 히스토그램이 제공됩니다. DiD의 산술 평균도 각 조직 및 농도에 대해 정량화하고 플롯팅했습니다(D). SSC = 측면 산란. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> 그림 4: 지방 SVF, 혈액 및 비장의 세포 하위 집합에 대한 대표적인 유세포 분석 분석. (A\u2012C) 지방 SVF(A), 비장(B) 및 혈액(C)에서 세포 하위 집합 및 DiD+ 세포를 식별하기 위한 게이팅 전략의 개략도를 나타냅니다. 약어: FSC = 전방 산란; LD = 살아있는/죽은; L-DCs = 림프성 수지상 세포; M-DCs = 골수 수지상 세포; SSC = 측면 산란. 이 그림은 Osinski et al.3에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>제어</td>
			<td>목적</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">PBS 또는 식염수로 치료한 마우스</td>
			<td>이 마우스의 세포를 사용하여 다음과 같은 유세포 분석 제어를 수행할 수 있습니다.</td>
		</tr><tr><td>1. 염색되지 않은 세포</td>
		</tr><tr><td>2. 살아있는/죽은 단일 얼룩</td>
		</tr><tr><td>3. 전체 패널로 염색되었지만 분석 중 리포솜 양성 신호를 결정하기 위한 리포솜 형광이 부족한 세포</td>
		</tr><tr><td>이 / 이 마우스 / 마우스는 실험에서 비 리포솜 대조군을 갖기 때문에 리포솜이 생체 내에서 어떤 영향을 미치는지 확인하는 데에도 사용됩니다.</td>
		</tr><tr><td>언로딩된 리포솜</td>
			<td>리포솜에 화합물을 로드하는 경우 리포솜 배치의 일부는 화합물 없이 합성되어야 합니다. 이것은 리포솜 단독의 생체 내 효과를 설명합니다.</td>
		</tr><tr><td>DiD 단독</td>
			<td>DiD는 또한 세포막에 의해 흡수 될 수 있기 때문에, 리포솜에서 발견되는 것과 동일한 양으로 유리 염료를 받기 위해 일부 마우스를 할당하면 배경 막 염색을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.</td>
		</tr><tr><td>FMO(Fluorescence-minus-one) 제어</td>
			<td>이들은 패널에 있는 항체 중 하나를 제외한 모든 항체로 염색된 세포입니다. 위 상자의 #3과 마찬가지로 분석 중에 해당 항체에 대한 진양성 신호를 결정하는 데 도움이 됩니다</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 이 프로토콜에서 사용할 컨트롤
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>용액</td>
			<td>구성 요소</td>
			<td>배치/마우스당 필요한 대략적인 부피</td>
		</tr><tr><td colspan="3">리포솜 준비</td>
		</tr><tr><td>칼슘 아세테이트</td>
			<td>H2O중 1 M 칼슘 아세테이트</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>hepes 버퍼</td>
			<td>H2O, pH 7.4에서 10 mM HEPES</td>
			<td>50 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>헤페스의 테사글리타자르</td>
			<td>10mM 헤페스에서</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td colspan="3">조직 채취, 가공 및 염색</td>
		</tr><tr><td>인산염 완충 용액(PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 중 증류된 H2O</td>
			<td>2 밀리리터</td>
		</tr><tr><td>PBS-헤파린</td>
			<td>PBS의 0.1 mM 헤파린</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr><tr><td>hepes 버퍼</td>
			<td>PBS의 20mM HEPES</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>소화 완충액</td>
			<td>HEPES 완충액의 2mg/mL Collagenase Type I</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr><tr><td>AKC 용해 완충액</td>
			<td>ddH2O, pH 7.2에서 0.158 MNH3Cl, 10 mMKHCO3, 0.1 mMNa2EDTA</td>
			<td>15 mL의</td>
		</tr><tr><td>FACS 버퍼</td>
			<td>PBS에서 1% BSA, 0.05%NaN3</td>
			<td>15 mL의</td>
		</tr><tr><td>Fc 블록 (희석)</td>
			<td>FACS 버퍼의 1:50 Fc 블록</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>고정 버퍼</td>
			<td>PBS의 2% 파라포름알데히드</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 준비할 솔루션.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세포외 염색(2x 항체 혼합물)</td>
		</tr><tr><td>항원</td>
			<td>형광단</td>
			<td>100 μL 시험당 Ab 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>CD45 (CD45)</td>
			<td>퍼CP</td>
			<td>0.5 μL</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td>CD11b입니다</td>
			<td>퍼씨프 Cy5.5</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.5 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>F4/80 키</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>(0.25 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594〈화이트〉</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD3 (영어)</td>
			<td>핏</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL/테스트) x (1.2) x (# 샘플)</td>
		</tr><tr><td>CD31 (영어)</td>
			<td>BV605 시리즈</td>
			<td>0.25 μL</td>
			<td>등...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115 (CD115)</td>
			<td>체육</td>
			<td>1.5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">항체 혼합물을 만들려면 컬럼 D에서 계산된 항체를 FACS 버퍼 또는 브릴리언트 바이올렛 염색 버퍼*와 결합하여 최종 부피(50μL x 1.2 x 총 # 샘플)로 만듭니다.</td>
		</tr><tr><td colspan="4">라이브/데드 염색(1x)</td>
		</tr><tr><td>라이브/데드</td>
			<td>형광단</td>
			<td>200 uL 테스트 당 L / D 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>라이브/데드</td>
			<td>아쿠아</td>
			<td>0.67 μL</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td colspan="4">세포내 염색(1x)</td>
		</tr><tr><td>항원</td>
			<td>형광단</td>
			<td>50 μL 시험당 Ab 부피</td>
			<td>필요한 총 볼륨:</td>
		</tr><tr><td>αSMA (영문)</td>
			<td>핏</td>
			<td>0.125</td>
			<td>컬럼 C x 1.2 x 총 # 샘플</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*브릴리언트 바이올렛 염색 버퍼는 브릴리언트 바이올렛 형광단에 결합된 항체가 두 개 이상 패널에 사용되는 경우 사용해야 합니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 3: 유동 염색에 사용할 염색 혼합물의 예시 및 항체 패널 계산.

이 프로토콜의 목표는 형광 표지된 리포솜을 합성하고 유세포 분석을 사용하여 세포 수준에서 리포솜의 생체 내 국소화를 식별하는 것입니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

당사의 프로토콜은 테살리타자르 적재 리포좀을 준비하기 위한 접근 가능한 방법과 세포 수준에서 리포좀 흡수를 평가하기 위한 철저한 접근 방식을 결합합니다. 이 기술은 저온 및 쉽게 구할 수 있는 장비를 사용하여 준비된 형광 표지 리포좀의 흡수를 평가하기 위한 편향되지 않은 방법을 제공합니다. 칼슘 아세테이트와 테살리타자르가 함유된 형광 표지 리포좀을 제조하려면 먼저 1/2인치 프로브를 사용하여 실온, 20킬로헤르츠 및 50% 전력에서 30초 동안 초음파 처리로 지질의 에테르 클로로포름 용액을 유화합니다.균질화된 물 및 오일 에멀젼 용액을 특수 어댑터, 나노미터 게이지 및 압력 조절기 밸브가 있는 회전 증발기로 즉시 옮기고 증발기를 진공 라인에 연결합니다. 유기 용매를 제거하려면 회전 속도를 분당 100회전으로 설정하고 진공을 0.5기압으로 설정합니다. 겔이 형성되고 사라진 후 진공을 0.9기압으로 높이고 두 개의 기밀 주사기가 장착된 리포좀 압출기에서 200나노미터 붓기 폴리카보네이트 필터를 통해 리포좀 수성 분산액을 앞뒤로 여러 번 여과합니다.동적 광 산란에 의한 크기 분포를 확인한 후 2ml 스핀 컬럼을 사용하여 리포좀에서 포착되지 않은 테살리타자르를 제거하고 분광 광도계를 사용하여 포착된 약물 농도를 측정합니다. 그런 다음 500마이크로리터 이하의 리포좀 샘플을 건조 컬럼 겔 베드에 추가합니다. 역안와 주사로 리포좀을 투여하려면 노출된 눈 위와 아래의 피부를 부드럽게 눌러 얼굴 평면 위로 눈을 들어 올립니다.그런 다음 바늘 끝을 눈의 앞쪽 모서리에 조심스럽게 삽입하고 바늘이 건드리지 않고 구체 아래에 있는지 확인하고 리포좀을 후안와 공간에 천천히 주입합니다. 혈액 샘플을 채취하기 위해 적절한 실험 종료점에서 마우스의 흉곽 꼬리 끝 가장자리에 있는 피부를 조심스럽게 절개하고 가슴근이 노출될 때까지 동물의 머리를 향해 1cm 직선으로 자릅니다. 초기 절개 부위에서 머리를 향한 선에 수직으로 두 개의 작은 절개를 만들고 노출된 부위의 흉곽 한쪽에 있는 흉근을 조심스럽게 잘라내어 바늘 삽입 부위에 더 잘 접근하고 시각화할 수 있도록 합니다.세 번째와 네 번째 갈비뼈 사이에 바늘을 삽입하고 가능한 한 흉곽의 중심선에 가깝게 유지하고 주사기를 부드럽게 당겨 혈액 채취를 시작합니다. 가능한 한 많은 부피가 수집되면 얼음 위에 10마이크로리터의 0.5몰 EDTA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브로 혈액을 옮깁니다. 마우스의 양쪽에서 서혜부 조직 패드를 추출하려면 한 세트의 집게를 사용하여 복막을 오른쪽으로 잡고 두 번째 집게 세트를 사용하여 복막막 위의 피부 가장자리를 다른 쪽에 고정합니다.피부를 멤브레인에서 부드럽게 당겨 층을 서로 분리합니다. 지방지방창고에 더 잘 접근할 수 있도록 피부의 바깥쪽 가장자리를 고정하고 피부를 따라 서혜부 지방조직 창고를 찾습니다. 그리고 필요에 따라 집게와 가위를 사용하여 림프절을 제거하기 위해 지방 저장소 중앙에 있는 서혜부 림프절을 찾습니다.림프절을 제거한 후 집게를 사용하여 고정된 지점에서 가장 가까운 지방 저장소의 끝을 조심스럽게 잡고 지방 조직과 피부 사이의 결합막을 작게 자르기 시작합니다. 멤브레인에 더 잘 접근할 수 있도록 절단하는 동안 피부에서 지방 조직을 들어 올리고 얼음 위에 HEPES 완충액이 들어 있는 폴리에틸렌 바이알에 저장소를 놓습니다. 복막강의 꼬리 끝에서 부고환 지방 저장소를 추출하려면 집게를 사용하여 마우스의 등쪽 끝에서 첫 번째 부고환 지방 저장소를 부드럽게 당기고 이 저장소에서 부착된 부고환과 정관을 찾습니다.그런 다음 지방 저장소와 부고환 및 정관 사이를 조심스럽게 잘라 지방을 다른 조직과 분리하고 얼음 위에 HEPES 완충액이 있는 폴리에틸렌 바이알에 데포를 넣습니다. 모든 조직을 채취한 후 가위 한두 쌍을 사용하여 지방 조직 샘플을 0.5mm 조직 조각으로 다집니다. 다음으로, 지방 조직 조각의 바이알에 1.5밀리리터의 2밀리리터 콜라겐분해효소 완충액을 첨가하고 바이알을 섭씨 37도, 분당 150회전의 진탕 인큐베이터에 30-45분 동안 넣습니다.30분 후 1ml 피펫을 사용하여 샘플을 여러 번 분쇄합니다. 조직 조각이 여전히 너무 커서 쉽게 피펫팅할 수 없는 경우 샘플을 추가로 15분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 샘플이 완전히 분해되면 단편을 10회 더 분쇄하여 단일 세포 현탁액이 생성되도록 하고 개별 70마이크로미터 필터를 통해 각 샘플을 샘플당 하나의 50ml 튜브로 변형시킵니다.각 파일을 5ml의 FACS 버퍼로 헹구어 남아 있는 세포를 수집하고 각 세척액을 얼음 위의 세포 샘플의 적절한 바이알로 여과합니다. 모든 샘플이 여과되면 원심분리로 세포를 수집하고 샘플에서 지방 세포 상등액을 흡인합니다. 다음으로, 기질 혈관 분획 펠릿을 그대로 둔 상층액을 조심스럽게 흡인하고 튜브당 1ml의 FACS 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 표준 프로토콜에 의한 유세포 분석이 이루어질 때까지 얼음 위의 새로운 1.5 또는 1.7 밀리리터 튜브로 현탁액을 옮깁니다. 동적 광 산란은 평균 리포좀 직경이 163.2나노미터이고 제타 전위가 마이너스 19.2밀리볼트임을 나타냅니다. 극저온 전자 현미경 이미징은 동적 광 산란에 의해 측정된 평균 직경에서 얻은 상대적으로 작은 표준 편차를 가진 원형 리포좀을 보여줍니다.PBS를 처리한 마우스의 샘플에 대한 유세포 분석은 DiD 형광에서 하나의 대조군을 뺀 값으로 사용하여 DiD 양성 게이트를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 대표적인 분석에서 알 수 있듯이, DiD의 밀리리터당 10밀리그램 리포좀 로딩 농도는 너무 높아 테스트된 세 조직 모두에서 세포분석기의 정량화 가능한 범위를 초과합니다. 밀리리터당 0.1 밀리그램 농도는 일부 신호를 보여주지만, PBS 처리된 세포를 넘어서는 명확한 집단은 관찰되지 않습니다.따라서 PBS 대조군과 명확한 차이를 보여주면서 분석기에서 판독할 수 있는 밀리리터당 1밀리그램 농도는 리포좀 제제에 사용하는 것이 좋습니다. 각 조직 유형마다 약간 다른 게이팅 전략이 필요하지만 각 조직에서 동일한 세포 유형의 대부분을 식별할 수 있습니다. 관심 있는 특정 집단이 확인되면 각 세포 집단의 총 크기와 DiD 양성 빈도를 정량화할 수 있습니다.시약과 장비를 준비하고 각 단계에 대한 결과를 예측하는 것이 중요합니다. 초기에 예상치 못한 결과가 나오면 미래의 결과를 망칠 수 있습니다. 조직학적 방법은 전체 조직 내 리포좀 국소화를 평가하는 데 사용할 수 있으며, 이미징 유세포 분석은 세포별로 리포좀 내재화를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

이 동영상은 형광 염료와 담금질제로 캡슐화된 대형 단층 소포(LUV)인 세포막 모방체를 사용하여 세포 투과 펩타이드와 세포막의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석에 대해 설명합니다.

세포를 투과하는 펩타이드와 멤브레인의 상호작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석

원형질막 단백질과 지질의 공간 분포와 시간 역학은 생물학에서 뜨거운 주제입니다. 여기서 이 문제는 개념적으로 동일한 단일 입자 추적의 물리량을 제공하지만 작은 분자 레이블과 표준 현미경 설정을 사용하는 시공간 이미지 변동 분석을 통해 해결됩니다.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

생체 내 이미징을 위한 형광단의 사용은 옵소니화, 빠른 제거, 낮은 검출 감도 및 숙주에 대한 세포 독성 효과로 인해 크게 제한될 수 있습니다. 필름 수화 및 압출에 의한 리포솜 내 형광단의 캡슐화는 형광 소멸 및 보호로 이어져 높은 검출 감도로 in vivo 이미징을 가능하게 합니다.

위한 도구로 리포좀 캡슐화 된 근적외선 형광의 형광 담금질 생체 광학 이미징

리포좀의 이질적인 종양 내 축적은 비정상적인 종양 미세환경과 관련이 있습니다. 여기에서는 영상 유도 로봇 시스템을 사용하여 관류 이미징 및 상승된 간질유체압(IFP)을 통해 종양 미세순환을 측정하는 방법을 제시합니다. 측정은 volumetric micro-CT 이미징을 사용하여 결정된 리포솜의 종양 내 축적과 비교됩니다.

관류의 공간 측정, 고체 종양에 삽입 유체 압력과 리포좀 축적

생체 전체 기관 이미징 내에서 조직 또는 치료 군간 형광 표지 된 화합물의 상대적 농도를 결정하기위한 빠른 방법이다. 더욱 노동 집약적 인 반면 반대로 정량적 형광 조직학, 표지 분자의 절대 조직 레벨의 정량을 허용한다.

사용 전의 VIVO 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

나노 의약품의 생체 내 성능에 대한 이해가 부족하여 임상 번역이 지연됩니다. 종양 보유 면역 능력이 있는 마우스에서 전신, 조직, 단세포 및 세포 내 수준에서 암 나노의약품의 생체 내 거동을 평가하는 절차가 여기에 설명되어 있습니다. 이 접근 방식은 연구자가 임상 번역을 위한 유망한 암 나노의약품을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

포괄적 인 절차를 평가하는<em&gt; 생체</em&gt; 암 나노 의학의 성능

라이브 셀 이미징은 동적 프로세스를 시각화 하는 강력한 도구입니다. 고정된 셀의 시험만 정적 사진을, 오해 및 과정에 대 한 혼란으로 이어질 수 있는 제공 합니다. 이 작품 이해, 약물 방출, 및 자주 나노 살아있는 세포에서의 세포내 지역화 하는 방법을 제공 합니다.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

이 프로토콜은 리포솜의 제조를 설명하고 이들이 어떻게 표면에 고정되고 형광 현미경 검사법을 사용하여 거대한 병렬 방식으로 개별적으로 심상될 수 있는지 설명합니다. 이는 집단의 단일 리포좀 들 사이의 크기 및 조성 불균질의 정량화를 허용한다.

개별 리포좀 간의 조성 불균질성을 검출하기 위한 정량적 형광 현미경 검사법 기반 단일 리포좀 분석

당사는 예를 들어 심장 표적 펩타이드를 사용하여 파라핀 임베딩, 단면 및 공초점 형광 현미경 검사법을 선행한 전 생체 이미징 시스템을 활용한 세포 관통 펩티드에 의한 침투 정도를 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리의 프로토콜에서, 단 하나 동물은 동일 기관의 화상 진찰 평가의 두 모형을 취득하기 위하여 이용될 수 있고, 따라서 연구 결과에 필요한 동물의 수를 반으로 삭감합니다.

심장 표적 펩타이드의 트랜스포션 효율성의 생체 내 이미징

우리는 경내 주입 후 눈에 리포좀의 스파티오 측두분포를 비침습적으로 연구하기 위해 광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사(CLM)의 사용을 위한 프로토콜을 제시한다.

광섬유 공초점 레이저 미세 내시경 검사를 사용하여 안구 약물 전달 시스템의 생체 내 측두 체 이미징

학습하세요 형광 염료 표지 리포솜을 저온법으로 제조하고 유세포 분석으로 세포 수용을 평가하는 방법을. 이 기술은 약물 전달 연구와 세포 생물학에 활용됩니다.

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

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