Name: 자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 배우세요 Drosophila 배아의 고함량 현미경 검사를 위한 미세 주입 및 동시 이미징 프로토콜입니다. 이 방법은 다수의 배아를 한 세션에서 촬영하여 정량적 분석과 실험적 재현성을 향상시킵니다.

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여기에서 기술된 프로토콜은 Drosophila 배아 발달에 있는 각종 단계에서 생물학 사건을 공부하기 위한 높게 다재다능하고 쉽게 적응합니다. 이 프로토콜은 오랜 기간 동안 발생하는 생물학적 과정을 연구하는 데 적합합니다. 예를 들어, 세포화29,30 또는 Drosophila31에서이종학로마티닌 도메인의 형성에 대한연구는,32이러한 프로세스가 오랜 기간 동안 발생하기 때문에 이 프로토콜에 설명된 방법을 활용하는 혜택을 누릴 수 있다. 또한, 시료 크기는 확대를 감소시켜 확대하여 확대하여 동기화부(33) 또는 위화기간(34)의타이밍과 같은 광학 적 분해능이 덜 필요한 질문을 연구할 수 있다.  마찬가지로, 20배의 목적은 두 개의 배아가 하나의 이미징 평면 내에서 촬영될 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 방법은 배아 발달을 정량적 분석을 위한 모델 시스템으로 서생물학적 질문을 하는 동적 플랫폼을 제공합니다.
이 프로토콜에는 3개의 중요한 단계가 있습니다. 50%의 표백제에서 후불양은 배아가 5배(2.3.4)로 격렬하게 헹구고 건조하는 것이 필수적이다. 이 단계는 남은 작은 초리온 조각을 제거합니다. 남은 초리온은 배아를 이미징 할 때 시야를 방해할 것입니다. 유리 커버슬립(3.5)에 배아를 장착할 때, 배아를 균일한 압력으로 접착제에 눌러야 한다. 이것은 같은 z 평면에 배아를 배치합니다. 미세 주입 바늘을 열 면, 바늘의 유량을 조정 하기 위해 플런저를 즉시 철회 하는 것이 중요 하다 또는 모든 주입을 잃게 됩니다.
우리의 연구는 두 가지 요인에 의해 제한되었다. 첫 번째 요소는 자동화된 세분화 프로세스가 없는 것이었습니다. 그러나 MATLAB을 사용하여 수동 세분화 스크립트를 설계했습니다. 유전적으로 인코딩된 스핀들 마커를 사용하면 이 과정이 자동화될 수 있습니다. 미래에 우리는 CNN-RFP21,Rtln1-GFP 및 CNN-RFP를 생산하고 싶습니다. ReepB-GFP 형질 화선은 자동화된 스핀들 세분화를 가능하게 합니다. MATLAB 스크립트 및 분석 파이프라인에 대한 자세한 내용은 Diaz 외15의보충 자료를 참조하십시오. 둘째, 우리는 또한 35s의 우리의 취득 간격에 의해 제한되었습니다, 이는 우리가 단지 6 개의 배아를 동시에 이미지할 수 있었습니다. 더 긴 획득 간격을 통해 더 많은 배아를 동시에 이미지화할 수 있습니다. 약물 전달 처리량은 투과 단계로 미세 주입을 대체하여 증가 할 수 있지만, 우리는 우리의 샘플 크기가 이미 취득 간격에 의해 제한되었기 때문에 이것이 불필요하다는 것을 발견했습니다.
이 프로토콜은 Drosophila 배아 발달을 이미지하기 위하여 이용되었지만, 전반적인 접근은 C. elegans,성게 및 제노푸스와같은 그밖 다세포 모형 시스템에서 배아 발달을 공부하기 위한 적응성이 있습니다. 배아는 수집 또는 수정을 통해 쉽게 동기화되기 때문에 정량 분석에 매우 유용합니다. 또한 배아는 시야에서 이동하거나 수영하지 않아 간단한 멀티포인트 획득 가능한 소프트웨어를 사용하여 정량적 분석을 위한 여러 시간 경과 비디오를 생성할 수 있습니다. 우리는 우리의 연구에서 높은 함량 분석기를 사용했지만, 멀티 포인트 획득 할 수있는 모든 반전 현미경 시스템은 본원에서 언급 된 방법과 결합 될 수있다.
유사한 결과는 반전된 공초점 현미경을 할 수 있는 멀티포인트 획득을 사용하여 얻을 수 있다; 그러나, 높은 함량 분석기의 장점은 샘플 크기를 증가하여 시간에 덜 해결이 필요한 질문을 연구함에 따라 나타납니다. 높은 함량 분석기를 사용하는 것이 명백한 장점은 기존 시스템의 슬라이드 1개에 비해 4개의 개별 슬라이드를 동시에 이미지화할 수 있다는 점입니다. 각 슬라이드에 4개의 슬라이드와 40개의 배아의 전체 세트를 가진, 160개의 태아는 취득 간격이 프레임 사이 적어도 15 분 인 한, 몇 시간 동안 심을 수 있습니다. 고함량 분석기를 사용하는 또 다른 중요한 장점은 형광 강도 기반 측정에 필요한 외부 광원으로부터 샘플이 완전히 밀봉된다는 것입니다. 마지막으로, 연구에 사용되는 고함량 분석기는 5.5메가픽셀 CMOS 카메라를 탑재하여 60배율의 관대한 221.87 μm 시야를 제공합니다. 이 더 큰 시야를 통해 우리는 획득 지점당 배아의 절반을 이미지화할 수 있었습니다.

지난 30년 동안, 살아있는 세포 화상 진찰을 위한 화상 진찰 기술 및 분자 프로브에 있는 발전은 세포의 복잡성 그리고 내부 작동의 우리의 이해를 발전시켰습니다. 기술의 이 진입로와 함께 높은 처리량 이미징 데이터의 수집을 위한 ex vivo 세포 배양 모델의 사용에 더 큰 의존도가 있습니다. 세포 배양 모델은 미세 유체 시스템을 통한 미세 환경 제어 및 여러 세포를 동시에 이미지화하는 기능을 포함하여 몇 가지 장점을 제공하여 고처리량 스크리닝1,2에필요한 정량적 접근 방식을 사용할 수 있게 한다. 그러나, 세포 형태학 및 그 규제3,4,5에혼동효과를 내는 2차원 유리 또는 플라스틱 표면과 같은 형태학적 연구의 맥락에서 세포 배양 모델과 관련된 유의한 단점도있다. 이러한 효과 세포 형태를 조절 하는 생물학적 프로세스의 연구에 관해서 거짓 또는 오해의 소지가 데이터를 제공할 수 있습니다.
대안은 그대로 유기체6의맥락에서 세포 형태를 연구하는 것이었지만, 소수의 적합한 손상 유기체는 이미징을 통해 전체 유기체를 살아 있게 하는 데 어려움을 겪고 큰 다세포 유기체 내부의 이미징과 관련된 어려움으로 인해 높은 처리량 정량적 라이브 세포 이미징을 용이하게 합니다. 그 결과, 그대로 유기체에 있는 세포 생물학 연구 결과는 일반적으로 견본 크기를 크게 제한하는 시간 지남에 단 하나 유기체를 관찰에 집중했습니다. 또한, 이러한 원-동물-시간 제한은 라이브 이미징을 화면 형태로 사용하기 어렵고 비용이 많이 들게 하고 샘플 수가 일반적으로 너무 작기 때문에 정량적 분석 도구를 적용하는 기능을 제한합니다. 따라서, 고함량 기반 정량적 접근법에 사용될 수 있는 다세포 모델 유기체에 대한 필요성이 발생한다.
이 프로토콜은 플레이트 기반 고함량 이미징을 위해 Drosophila 배아를 조정하여 정량 적 분석을 위한 충분한 크기의 실험 샘플 크기를 생성합니다. 드로소필라 멜라노가스터는 일반적으로 첫 번째 모델 유기체로 알려져 있다. Drosophila를 이용한 연구는 유전 정보의 전송, 세포 신호 경로의 식별 및 배아 발달의 유전 적 요구 사항을 포함하여 세포 및 분자 생물학에 있는 돌파구로 이끌어 냈습니다7,8,9. 또한, 드로소필라 배아는 세포 분부10,11,12동안 생체 내 마이크로투룰 역학을 탐구하는 데 사용되어 왔다. 작은 분자와 분자 프로브를 전달하기 위하여 미세 주입의 사용은 생체13,14에서세포 프로세스를 탐구하기 위한 Drosophila 배아 발달을 특히 강력하게 만드는 측두광을 제공합니다. 그러나, 전통적인 화상 진찰 접근으로 실험 반복의 상당수를 생성하는 것은 극단적으로 노동 집약적이며 고처리량 화상 진찰 스크린 및 정량 분석에 있는 한정된 사용이 있습니다. 우리의 접근 방식은 일반적으로 단하나 세포 분석을 위해 예약된 고함량 분석기를 사용하고 초기 Drosophila embryo의 syncytium에서 생체 내 이미징 분석에 적응합니다.
이 프로토콜은 수집, 단계 및 마이크로 주입 Drosophila 배아를 수집하는 데 사용되었다( ER) 미토시스 동안 내도성 망상 (ER)의 형태변화를 구동 하는 메커니즘을 탐구하는 15. 많은 연구가 세포 주기 동안 ER의 동적 특성을 설명했지만16,17,18,19,ER 형태에 걸쳐 여러 동요의 효과를 비교하기 어려웠다. 세포 분열에 걸쳐 ER 형태학의 변화를 구동하는 구성 요소를 식별하기 위해,이 프로토콜에 나열된 방법은 초기 Drosophila 배아에서 피질 싱크량 분열을 사용하여 미토알 ER 재구성에 미세 tubules 및 기타 사이토셀레탈 인자의 역할을 조사하는 데 사용되었다. 함께 촬영, Drosophila 지역 사회 내에서 유전 적 혼란의 가용성, 개발 하는 동안 정확한 시간에 약물과 분자 프로브를 마이크로 주입 하는 능력, 그리고 Drosophila와 함께 작업의 저렴 한 비용 높은 처리량 이미지 기반 스크리닝에 매우 순종. 여기에 설명된 방법은 Drosophila 배아(20)를사용하여 생체 내에서 다양한 세포 및 발달 과정을 연구할 수 있다. 특히, 이 프로토콜은 Drosophila 태아 피질의 100 미크론 이내및 연장된 기간 에 걸쳐 생기는 생물학 사건을 공부하기 위하여 잘 적응됩니다.

<table><tbody><tr><td>10 x 35mm 마이크로 디쉬</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10799-192</td><td>N/A</td></tr><tr><td>100% 포도 주스 농축</td>액 <td>Welch's, 100% 농축 포도 주스</td><td>N/A</td><td>식료품점에서 구매</td></tr><tr><td>250ml 삼각 플라스크, 좁은 입</td><td>VWR</td><td>Cat #: 10536-914</td><td>N/A</td></tr><tr><td>3" 비금속 체 No. 140</td><td>Gilson Company</td><td>SV-165 #140</td><td>N/A</td></tr><tr><td>4 슬라이드 이미징 트레이</td><td>그레이스 Biolabs</td><td>SKU: 400104</td><td>N/A</td></tr><tr><td>ACROS Organics, n-Heptane, 99+%, 분광학용</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: AC411255000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS 시약, absolute, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# : AC615095000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acros Organics, 메틸 4-하이드록시벤조에이트, 99%. (메틸 파라벤)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#: AC126961000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>커버 슬립, 직사각형, 25 x 75mm, #1 플로트 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 50-143-782</td><td>N/A</td></tr><tr><td>배양 웰 실리콘 시트 재료 - 1.6mm 두께</td><td>Grace Biolabs</td><td>SKU: 664273</td><td>해당 없음</td></tr><tr><td>DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET 액체 섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 03-341-71A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>배아 수집 케이지-미니</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 59-105</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>제품 코드: 10289651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon 15mL 원뿔형 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 05-527-90</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon 50mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 14-432-22</td><td>N/A</td></tr><tr><td>플라이슈만, 활성 건조 효모</td><td>Fleischmann's</td><td>N/A</td><td>식료품점에서 구매</td></tr><tr><td>포도 접시</td><td>레시피 준비</td><td>참조 N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>할로카본 27 오일</td><td>제네시 사이언티픽</td><td>고양이 #: 59-133</td><td>N/A</td></tr><tr><td>할로카본 700 오일</td><td>제네시 사이언티픽 고양이</td><td>#: 59-131</td><td>N/A</td></tr><tr><td>헵탄 접착제</td><td>레시피 준비</td><td>참조 N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>산업용 면도날 (수술용 탄소강) 단일 가장자리 No. 9</td><td>VWR</td><td>Cat #: 55411-050</td><td>N/A</td></tr><tr><td>파라필름 M 실험실 밀봉 필름, 4 인치 x 250 피트 롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>고양이 #: 50-998-944</td><td>N/A</td></tr><tr><td>스카치 양면 테이프와 디스펜서, 좁은 폭, 본딩을 위해 설계됨, 1/2" x 7 yds., 3/Pack 캐디</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>고양이 #: NC0879005</td><td>N/A</td></tr><tr><td>실리카 겔 비즈, 건조제 ~ 2 - 5 mm</td><td>Millipore Sigma</td><td>SKU: 1077351000</td><td>N/A</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 스푼/주걱</td><td>VWR</td><td>Cat #: 470149-044</td><td>N/A</td></tr><tr><td>W.A. Hammond Drierite 지시 흡수제</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat #: 23-116582</td><td>N/A</td></tr><tr><td>효모 페이스트</td><td>레시피 준비</td><td>참조 N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12 벤치탑, 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>15ml 원추형 원심분리기 인서트를 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>모든 오토클레이브가 잘 작동합니다.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II 마이크로인젝터.</td><td>Drummond Scientific</td><td>N/A</td><td>이것은 미네랄 오일 기반 주입 시스템입니다.</td></tr><tr><td>GE Healthcare IN 세포 분석기 6000.</td><td>GE 헬스케어</td><td>N/A</td><td>다점 획득이 가능한 고속 컨포칼 현미경으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>냉장고 (4C&)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>플라이 미디어와 효모 페이스트는 (4C&deg;)에 보관해야 합니다.</td></tr><tr><td>Zies Stemi 508 스테레오 현미경(Transillumination 베이스 300 및 오버헤드 구즈넥 조명).</td><td>Zeiss 현미경 검사</td><td>N/A</td><td>투과 조명 베이스와 구즈넥 조명이 필요합니다.</td></tr></tbody></table>

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 drosophila 배아 준비 및 미세 주입

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

정량적 라이브 세포 이미징의 현대 접근법은 통계 및 계산 모델링을 사용하여 생물학적 과정을 분류하고 비교할 수 있게 함으로써 세포 생물학을 탐구하는 데 필수적인 도구가 되었습니다. 세포 배양 모형 시스템은 높은 콘텐츠 화상 진찰을 위해 중대하더라도, 세포 형태학의 높은 처리량 연구 결과는 전 생체 권양이 살아있는 유기체 내의 세포에서 찾아낸 형태학적 복잡성을 재구성에 제한된다는 것을 건의합니다. 따라서, 손상되지 않은 유기체 내의 살아있는 세포를 이미지화하기 위해 확장 가능한 높은 처리량 모델 시스템이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 동시 동기 전폭 단계 동안 배아 Drosophila 멜라노가스터 발달의 다중 타임랩스 비디오를 획득하기 위해 고함량 이미지 분석기를 사용하는 프로토콜이다. 싱크로나이즈드 블라스트르름은 전통적으로 생물학적 사건을 이미징하기 위한 훌륭한 생체 내 모델로 작용해 왔습니다. 그러나, 정량적 및 고처리량 접근법을 위한 상당한 수의 실험 복제를 얻는 것은 실험반복당 단일 배아의 이미징에 의해 노동 집약적이고 제한되었다. 여기에 제시된 화상 진찰 및 미세 주입 접근은 고함량 화상 진찰 시스템, 또는 자동화된 다중점 취득을 할 수 있는 어떤 반전된 현미경든지 에 맞게 적응하는 방법입니다. 이 접근은 단 하나 화상 진찰 세션 안에, 원하는 취득 요인에 따라서 6-12 태아의 동시 취득을 가능하게 합니다.

이 프로토콜에 제시된 접근은 Drosophila 태아(15)에있는 미토시스 도중 풍요로움 Reticulum (ER) 재구성에 있는 microtubules의 역할을 검토하기 위하여 이용되었습니다. 미토시스 동안 ER의 구조는 극적인 재구성을 표시하지만 이러한 변화를 유도하는 힘은 제대로 이해되지 않습니다. 최근에는 ER 성형 단백질의 가족이28마이크로투부(28)와가까운 근접성으로 알려진 ER 튜블러25,26,27,28의형성을 촉진하는 것으로 나타났다. ER 형태학에 대한 미세 투부의 롤을 연구하기 위해 프로토콜에 제공된 방법은 미토시스 중 ER 재구성에 대한 여러 미세 주입 약물 치료의 효과를 정량적으로 비교하기 위해 데이터를 생성하는 데 사용되었습니다. 새로운 미세투불 중합화를 방지하는 콜시친은 도 5 및 도 6에도시된 바와 같이 미토시스 중 ER의 재구성을 대폭 감소시키는 것으로 나타났다. 더욱이, 여기에서 기술된 접근은 32개의 태아를 위한 시간 바퀴 화상 진찰 데이터의 생산을 가능하게 했습니다. 평균 및 최대 강도 측정은 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용하여 관심의 12,800 지역에서 생산되었다, 이는 또한 약물 치료 사이의 비교를 만들기위한 필수적인 설명과 감염 통계를 생성. 분자 프로브의 가용성과 미세 주입의 용이성으로 인해, 여기에 설명된 방법은 형광 강도 정량화를 통해 다양한 생물학적 과정을 연구하기 위해 쉽게 적응할 수 있다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> 그림 5: 미토시스 중 스핀들 폴에서 Rtnl1-GFP 및 ReepB-GFP 농축의 대표적인 이미지. (A)세포 주기 10에서 미토시스 중 ReepB-GFP의 60x 필드. 파란색 사각형은 패널 B-E에 사용되는 뷰 필드를 나타냅니다. 패널 A는 임계값 이진 필터로 처리됩니다. 이 필터는 설정된 임계값 미만의 픽셀에서 데이터를 제외하기 때문에 패널 B-E에 적용되지 않았습니다. (B,D) ReepB-GFP제어, 콜시친. (C,E) Rtnl1-GFP제어, 콜시친. 이 그림은 디아즈 외15에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> 그림 6: 미토시스 중 스핀들 폴에서 Rtnl1-GFP 및 ReepB-GFP 농축량. 10프레임에 걸친 20개의 스핀들 및 20개의 세포질 ROI는 다음 조건에서 32개의 배아를 위해 분석되었다. (A)Rtnl1-GFP. 대조군 배아에 대한 10% DMSO 대조군 주사는 비주입 시료에 비해 농축(T210의 모든 샘플에 대한 p&amp;0.001)의 0.1배 증가를 보였다(T210의 모든 샘플에 대해 p&amp;001). (B)ReepB-GFP 배아를 10% DMSO로 주입하여 대조군역할을 한다. 대조군 배아는 비주입 샘플에 비해 농축(T210의 모든 샘플에 대한 p&amp;0.001)의 0.1배 증가를 보였다(T210의 모든 샘플에 대해도 1E;p&amp;t&amp;001). (C)5 μM 콜시친을 주입한 Rtnl1-GFP 배아. 여기서 우리는 대조군 (A)에 비해 스핀들 (P &amp; T210의 모든 샘플에 대한 0.001)에 Rtnl1-GFP 농축의 감소를 측정 (P &amp; 0.001 T210에서 모든 샘플에 대한). (D)5 μM 콜시친을 주입한 ReepB-GFP 배아. 우리는 제어 (B)에 비해 스핀들 (T210의 모든 샘플에 대한 p&amp;0.001)에 ReepB-GFP 농축의 감소를 측정 (P&amp;0.001 T210에서 모든 샘플에 대한). 이 그림은 디아즈 외15에서수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. 효모 페이스트21</td>
			<td>2. 포도 접시21</td>
			<td>3화 헵탄 접착제24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 활성 건조 효모 7 그램을 원식 50ml에 넣습니다. 디 워터 9밀리리터를 넣고 금속 주걱으로 균등하게 섞습니다.</td>
			<td>2.1 솔루션 만들기: 250ml 플라스크에 140ml의 DI 물에 6그램의 한고를 넣고 오토클레이브를 만듭니다.</td>
			<td>3.1 유리 반짝임 유리병을 50인치 양면 테이프로 채웁니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 활성 건조 효모 7 그램을 원식 50ml에 넣습니다. 디 워터 9밀리리터를 넣고 금속 주걱으로 균등하게 섞습니다.</td>
			<td>2.2 용액 만들기 b: 에탄올 2ml에 메틸 파라벤 0.1 그램을 섞은 다음 이 솔루션을 60ml의 자몽 주스 농축물에 추가합니다.</td>
			<td>3.2 헵탄 20ml를 넣고 파라필름으로 유리 신발바이알을 밀봉합니다. 실온에서 하룻밤 동안 회전합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 오토클레이브 용액 직후, 용액 b에 섞어서 혼합물을 10 x 35mm 퍼티 접시에 붓습니다. (포도 접시 35개)</td>
			<td>3.3 접착제를 2 15ml 원물 튜브로 옮기고 3000 RPM에서 15분 동안 원심분리하여 플라스틱 테이프 이물질을 제거합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 포도 판을 플레이트 뚜껑을 닫고 밤새 실온에서 놓도록 허용합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 놓은 후 4C°로 보관하십시오.</td>
			<td>3.4 접착제 상체를 1.5ml 마이크로 센심 분리기 튜브로 이송하여 보관합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 미디어 및 솔루션 레시피.

여기에 제시된 프로토콜은 플레이트 기반의 고함량 이미저를 사용하여 배아 발달 중에 여러 Drosophila 배아를 마이크로주입하고 동시에 이미지화하는 프로토콜이다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

이 프로토콜은 하나의 이미징 세션 내에서 여러 배아의 동시 인수를 가능하게한다. 샘플 준비는 높은 함량 분석기를 사용하여 멀티 포인트 수집을 위해 조정되지만,이 프로토콜을 사용하여 준비된 샘플은 멀티 포인트 획득이 가능한 모든 반전 된 현미경으로 이미지화 될 수 있습니다. 시작하려면 계란 피커 도구를 사용하여 훌륭한 접시의 깨끗한 섹션에 15~20개의 배아를 두 줄로 구성합니다.전방 및 후방 끝과 관련하여 동일한 방향으로 복부 측에 배아를 정렬합니다. 스페이서를 커버슬립에 부착하고 노출된 커버슬립 글래스 인셋 아래로 헵탄 접착제 10마이크로리터를 줄입니다. 접착제가 마르는 동안 면도날을 사용하여 두 줄의 배아 주위에 직사각형을 자른다.첫 번째 사각형 옆에 두 번째 사각형을 잘라 스테인레스 스틸 주걱의 직선 가장자리 면으로 두 번째 사각형을 제거합니다. 주걱의 직선 가장자리를 첫 번째 사각형 아래에 조심스럽게 밀어 제거합니다. 그런 다음 3.5 센티미터 접시의 외부 측면에 배아로 컷아웃을 놓습니다.스테레오 현미경으로 준비된 커버슬립을 배아 위로 낮추고 두 줄의 배아를 접착제에 부드럽게 누릅니다. 미세 주입을 수행하지 않으면 실리콘 스페이서를 상단에 중간쯤 채우고 1대1 할로카본 오일(700)을 할로탄소 오일(27)으로 채우게 한다. 4슬라이드 플레이트 어댑터의 하단 가장자리를 양면 테이프로 정렬합니다.이렇게 하면 이미징 중에 슬라이드가 이동하는 것을 방지할 수 있습니다. 테이프를 객관적인 렌즈의 경로에 배치하지 않도록 하십시오. 4슬라이드 플레이트 어댑터에 커버슬립을 장착합니다.배아를 마이크로 주입하는 경우, 증식 및 미세 주입 중에 커버 슬립의 바닥이 더러워지는 것을 방지하기 위해 슬라이드 위에 배아로 커버 슬립을 놓습니다. 배아를 5-10분 동안 데카테한 다음 즉시 1대1 할로카본 오일(700)으로 덮어 할로카본 오일(27)에 덮고 실리콘 스페이서를 맨 위쪽으로 채웁니다. 확장 된 로딩 팁을 사용하여 인젝트의 약 2 마이크로 리터와 두 개 또는 세 개의 미세 주입 바늘을로드합니다.마이크로인젝터에 바늘을 장착하고 플런저를 끝의 중간쪽으로 우울시켜 유리 모세관 내부의 기압을 증가시다. 유리 바늘을 유리 슬라이드에 내리고 새로운 숫자 9 면도기로 바늘 끝을 잘라 45도 각도로 절단하여 날카로운 열린 팁을 생성합니다. 주사는 바늘에서 흐르지 않고 팁의 바닥으로 흘러 내려가야합니다.바늘 끝에 20 마이크로리터의 할로카본 오일을 조심스럽게 추가하고 45도 각도로 열어 놓은 재절단합니다. 주사는 급속하게 흐르기 시작해야 하므로 플런저를 철회하여 압력을 조정해야 합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 시야 의 중앙에 배치하십시오.그런 다음 바늘을 들어 올리고 그 아래에서 유리 슬라이드를 제거합니다. 미세 주입 바늘 아래에 스테레오 현미경 단계에 배아를 놓고 50 배율로 그(것)들에 집중하십시오. 그것은 배아와 같은 초점 평면에 올 때까지 바늘을 낮춥니다.한 손으로 슬라이드를 이동하고 다른 손으로 마이크로 인젝터를 작동, 배아의 한 행을 주입. 바늘을 들어 올리고 슬라이드를 180도 회전하여 배아의 두 번째 행을 미세 주입 바늘에 노출시킵니다. 바늘을 낮추고 배아의 두 번째 행을 주입합니다.이 프로토콜은 Drosophila 태아에 있는 미토시스 도중 폐막 reticulum 재구성에 있는 microtubules의 역할을 검토하기 위하여 이용되었습니다. ER 개편에 대한 여러 미세 주입 약물 치료의 효과는 정량적으로 비교되었다. 새로운 마이크로투블러 중합화를 방지하는 콜시친은 미토시스 중 극을 회전시키기 위해 ER의 국소화를 대폭 감소시키는 것으로 나타났다.시간 경과 이미징 데이터는 32개의 배아를 위해 취득되었습니다. 평균 및 최대 강도 측정은 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 관심 영역 12, 800 개 영역에서 분석되었습니다. 이 프로토콜을 처음으로 시도할 때 한 단계에 너무 오래 걸리지 않도록 기억하면 이미지하려는 개발 단계가 누락될 위험이 있습니다.실험을 시도하기 전에 이 프로토콜을 단계별로 연습합니다. 당사의 샘플 준비 방법은 한 실험 중에 여러 배아를 동시에 습득하여 정량적 분석을 위한 충분한 실험 복제를 생성합니다. 이 프로토콜은 발달 배아학이 질적 에서 정량적 이미징 실험으로 전환하는 데 도움이 될 수 있습니다.한 화상 진찰 세션 내에서 여러 배아를 이미지하는 기능은 복제 사이의 실험적 소음을 제거합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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배우세요 Drosophila 배아의 고함량 현미경 검사를 위한 미세 주입 및 동시 이미징 프로토콜입니다. 이 방법은 다수의 배아를 한 세션에서 촬영하여 정량적 분석과 실험적 재현성을 향상시킵니다.

자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

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