자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

이 프로토콜은 하나의 이미징 세션 내에서 여러 배아의 동시 인수를 가능하게한다. 샘플 준비는 높은 함량 분석기를 사용하여 멀티 포인트 수집을 위해 조정되지만,이 프로토콜을 사용하여 준비된 샘플은 멀티 포인트 획득이 가능한 모든 반전 된 현미경으로 이미지화 될 수 있습니다. 시작하려면 계란 피커 도구를 사용하여 훌륭한 접시의 깨끗한 섹션에 15~20개의 배아를 두 줄로 구성합니다.

전방 및 후방 끝과 관련하여 동일한 방향으로 복부 측에 배아를 정렬합니다. 스페이서를 커버슬립에 부착하고 노출된 커버슬립 글래스 인셋 아래로 헵탄 접착제 10마이크로리터를 줄입니다. 접착제가 마르는 동안 면도날을 사용하여 두 줄의 배아 주위에 직사각형을 자른다.

첫 번째 사각형 옆에 두 번째 사각형을 잘라 스테인레스 스틸 주걱의 직선 가장자리 면으로 두 번째 사각형을 제거합니다. 주걱의 직선 가장자리를 첫 번째 사각형 아래에 조심스럽게 밀어 제거합니다. 그런 다음 3.5 센티미터 접시의 외부 측면에 배아로 컷아웃을 놓습니다.

스테레오 현미경으로 준비된 커버슬립을 배아 위로 낮추고 두 줄의 배아를 접착제에 부드럽게 누릅니다. 미세 주입을 수행하지 않으면 실리콘 스페이서를 상단에 중간쯤 채우고 1대1 할로카본 오일(700)을 할로탄소 오일(27)으로 채우게 한다. 4슬라이드 플레이트 어댑터의 하단 가장자리를 양면 테이프로 정렬합니다.

이렇게 하면 이미징 중에 슬라이드가 이동하는 것을 방지할 수 있습니다. 테이프를 객관적인 렌즈의 경로에 배치하지 않도록 하십시오. 4슬라이드 플레이트 어댑터에 커버슬립을 장착합니다.

배아를 마이크로 주입하는 경우, 증식 및 미세 주입 중에 커버 슬립의 바닥이 더러워지는 것을 방지하기 위해 슬라이드 위에 배아로 커버 슬립을 놓습니다. 배아를 5-10분 동안 데카테한 다음 즉시 1대1 할로카본 오일(700)으로 덮어 할로카본 오일(27)에 덮고 실리콘 스페이서를 맨 위쪽으로 채웁니다. 확장 된 로딩 팁을 사용하여 인젝트의 약 2 마이크로 리터와 두 개 또는 세 개의 미세 주입 바늘을로드합니다.

마이크로인젝터에 바늘을 장착하고 플런저를 끝의 중간쪽으로 우울시켜 유리 모세관 내부의 기압을 증가시다. 유리 바늘을 유리 슬라이드에 내리고 새로운 숫자 9 면도기로 바늘 끝을 잘라 45도 각도로 절단하여 날카로운 열린 팁을 생성합니다. 주사는 바늘에서 흐르지 않고 팁의 바닥으로 흘러 내려가야합니다.

바늘 끝에 20 마이크로리터의 할로카본 오일을 조심스럽게 추가하고 45도 각도로 열어 놓은 재절단합니다. 주사는 급속하게 흐르기 시작해야 하므로 플런저를 철회하여 압력을 조정해야 합니다. 마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 시야 의 중앙에 배치하십시오.

그런 다음 바늘을 들어 올리고 그 아래에서 유리 슬라이드를 제거합니다. 미세 주입 바늘 아래에 스테레오 현미경 단계에 배아를 놓고 50 배율로 그(것)들에 집중하십시오. 그것은 배아와 같은 초점 평면에 올 때까지 바늘을 낮춥니다.

한 손으로 슬라이드를 이동하고 다른 손으로 마이크로 인젝터를 작동, 배아의 한 행을 주입. 바늘을 들어 올리고 슬라이드를 180도 회전하여 배아의 두 번째 행을 미세 주입 바늘에 노출시킵니다. 바늘을 낮추고 배아의 두 번째 행을 주입합니다.

이 프로토콜은 Drosophila 태아에 있는 미토시스 도중 폐막 reticulum 재구성에 있는 microtubules의 역할을 검토하기 위하여 이용되었습니다. ER 개편에 대한 여러 미세 주입 약물 치료의 효과는 정량적으로 비교되었다. 새로운 마이크로투블러 중합화를 방지하는 콜시친은 미토시스 중 극을 회전시키기 위해 ER의 국소화를 대폭 감소시키는 것으로 나타났다.

시간 경과 이미징 데이터는 32개의 배아를 위해 취득되었습니다. 평균 및 최대 강도 측정은 사용자 지정 MATLAB 스크립트를 사용하여 관심 영역 12, 800 개 영역에서 분석되었습니다. 이 프로토콜을 처음으로 시도할 때 한 단계에 너무 오래 걸리지 않도록 기억하면 이미지하려는 개발 단계가 누락될 위험이 있습니다.

실험을 시도하기 전에 이 프로토콜을 단계별로 연습합니다. 당사의 샘플 준비 방법은 한 실험 중에 여러 배아를 동시에 습득하여 정량적 분석을 위한 충분한 실험 복제를 생성합니다. 이 프로토콜은 발달 배아학이 질적 에서 정량적 이미징 실험으로 전환하는 데 도움이 될 수 있습니다.

한 화상 진찰 세션 내에서 여러 배아를 이미지하는 기능은 복제 사이의 실험적 소음을 제거합니다.