Name: 흉막 보급의 마우스 모형을 위한 근적외선 광면역요법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 학습하세요 근적외선 광면역요법(NIR-PIT)을 이용하여 흉막 전이성 폐암 마우스 모델에서 항종양 효과를 평가하는 방법을. 생체발광 영상으로 종양 반응을 실시간 모니터링하여 치료 효과를 정량적으로 분석할 수 있습니다.

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모든 생체 내 실험은 나고야 대학 동물 관리 및 사용 위원회의 실험실 동물 자원 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하여 수행되었습니다 (승인 #2017-29438, #2018-30096, #2019-31234, #2020-20104). 나고야 대학의 동물 센터에서 6 주 된 호모자고테 자티믹 누드 마우스를 구입하고 유지했습니다. 마우스에서 절차를 수행할 때, 그들은 이소플루란으로 마취하였다 (소개: 4-5%, 유지 보수 2-3%); 발은 마취의 깊이를 확인하기 위해 핀셋으로 눌렀습니다.
1. MAb와 IR700의 컨쥬게이션
<ol><li>IR700 NHS 에스테르(66.8 mg, 34.2nmol, DMSO의 5mmol/L)를 1h에 대해 15-25°C에서 0.1 몰/L Na2HPO4(pH 8.6)로 인큐베이션멜(1 mg, 6.8nmol)을 장착했다.</li>
	<li>컬럼(예: 세바덱스)을 사용하여 혼합물을 정화합니다. PBS로 컬럼을 준비하고 씻으시다. 이어서, 혼합물을 컬럼에 적용하고 정제된 IR700-공주 항체를 포함하는 방울을 수집한다. 이러한 IR700-공주 항체는 항체 광합성기 컨쥬게이트(APC)라고 한다.</li>
	<li>APC에서 단백질 및 IR700 농도를 측정합니다.<ol>
<li>분광광계를 사용하여 단백질 및 IR700에 대한 교정 곡선을 준비합니다.</li>
		<li>키트 프로토콜에 따라 단백질 분석 키트와 알부민의 표준 농도를 혼합합니다(재료표,쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 단백질 염색 참조). 595nm 파장에서 알부민의 흡광도를 측정하고, 다음 방정식을 사용하여 단백질에 대한 교정 곡선(선형 근사치 포뮬러)을 플롯합니다: y = 도끼 + b(x: 농도, y: 흡광도).</li>
		<li>동일한 절차를 사용하여 690 nm에서 흡수된 IR700에 대한 교정 곡선을 가져옵니다. IR700의 표준 농도는 0.1-5 μM(0.1954-9.77 μg/mL)에서 권장됩니다.</li>
		<li>교정 곡선 [x = (y-b)/a(x: 농도, y: 흡광도)]를 사용하여 APC의 단백질 농도 및 IR700 농도를 측정합니다.</li>
		<li>어금니 농도의 결과로 mAb당 IR700 염료의 수를 결정한다. 참고: mAb 분자당 IR700 분자의 최적의 컨쥬게이션 수를 결정하는 것이 중요합니다. 일반적으로 단일 mAb 분자에 결합된 약 3개의 IR700 분자는 시험관 내 및 생체 내모두에서 효과적일 것이다. 항체 당 많은 IR700 바운드 (예를 들어, 6) 쉽게 생체 내 실험 동안 간에서 갇혀 할 수 있습니다. IR700에 결합된 항체의 비율은 1:2-1:4의 범위에 있었다. 필요한 경우 IR700의 비율이 감소했습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>APC의 형성을 위한 확인으로 나트륨 도데딜 황산폴리아크릴라미드 젤 전기포진(SDS-PAGE)을 수행한다. 겔은 700 nm에서 형광 이미저를 사용하여, 키트 프로토콜에 따른 단백질 염색 키트를 사용하여 젤내단백질을 염색한다(재료의 표,CBB 단백질 염색 참조).</li>
</ol>2. 흉막 보급 모델의 생성
<ol><li>루시파라아제를 발현하는 표적 세포를 준비하고 1.0 × 106개의 표적 세포를 인산염 완충식염수(PBS)의 100μL에서 일시 중단합니다. 참고: 폐암 및 MPM과 같은 내트라토라시암세포는 표적세포로서 적합하다. 루시파아제 발현 세포는 루시파라제 유전자 이식을 통해 제조되었고, 루시파아제의 높은 발현은 > 10개의 세포 구절 후에 확인되었다. 세포는 10% 태아 소 혈청과 페니실린 (100 IU/mL) 및 연쇄상 구균 (100 mg/mL)으로 보충된 매체에서 배양되었다. 세포의 수는 종양 증가율 및 치료 시간 과정에 따라 조정되었다 (10 × 5-6.0 × 106 세포 / 체중).</li>
	<li>8-12주 된 암컷 호모자고테 아티믹 누드 마우스를 준비하여 19-21 g의 체중이 좋습니다.</li>
	<li>이소플루란과 시술 중 마우스 마취 (소개: 4-5%, 유지 보수 2-3%); 꼬리를 핀셋으로 눌러 반응이 없는지 확인합니다.</li>
	<li>폴리스티렌 폼으로 스토퍼를 만들고 폐 손상을 방지하기 위해 팁이 5mm에 유지되도록 스토퍼를 30 G 바늘에 부착하십시오. 바늘 끝을 깨끗한 집게로 구부리거나 70% EtOH로 세척된 단단한 물체에 대해 눌러 기압호르몬(그림1)을피하십시오. 주의: 자신을 관통하지 않도록 주의하십시오. 바늘을 구부리기 위해 집게를 사용합니다. 바늘에 부착 할 때 스토퍼를 보유하지 마십시오. 세포를 주사기에 채우기 전에 스토퍼를 붙이는 것이 더 안전합니다.</li>
	<li>표적 셀로 주사기(1mL)를 채우고 스토퍼로 30G 바늘을 부착한다.</li>
	<li>시술 전에 70% EtOH로 동물의 가슴을 소독하십시오.</li>
	<li>늑간 공간을 통해 마우스 의 가슴에 바늘을 관통. 그 당시 갈비뼈에 부딪히는 동안 저항으로 인해 바늘 끝이 위아래로 움직였다. 늑간 공간을 통과한 후, 마우스에 대한 주사기를 누르고 표적 셀의 100 μL을 주입한다(도2). 참고: 바늘이 가슴 구멍에 제대로 들어갈 때 마우스는 깊이 숨을 들이습니다. 바늘 끝의 구부러짐으로, 폐렴과 폐에 세포의 부적당한 주입을 피할 수 있었습니다. 참고: 오른쪽 가슴 벽 펑크심장 벽 펑크의 위험을 피하기 위해 권장 됩니다.</li>
	<li>마우스를 2-3번 굴려 흉부 구멍 전체에 세포를 퍼뜨리습니다.</li>
	<li>마우스를 깨끗하고 따뜻한 케이지에 넣고 외래가 될 때까지 모니터링합니다. 절차 후, 마우스는 마취에서 일어나 정상적으로 행동합니다.</li>
</ol>3. 생물 발광의 측정
참고: 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어는 재료 표에나열됩니다.
<ol><li>흉막 보급 모델의 생성을 확인하기 위해 흉부 구멍에 세포를 주입 한 후 매일 생체 발광 이미지를 평가하십시오.</li>
	<li>마우스(2.3단계)를 마취하고 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)으로 인트라피언으로 주입한다.</li>
	<li>마우스가 이미징 전후에 정상적으로 호흡하고 있는지 확인합니다. 마취 중 저체온증을 방지하기 위해 필요한 경우 히터를 사용합니다.</li>
	<li>주입 후 10분 후, 생체 발광 이미징(BLI) 측정 장비에 마우스를 설정합니다. 이미지 수집을 위해 소프트웨어의 인수 제어판을 엽니다. 발광, 사진및 오버레이 (그림 3)를선택합니다.</li>
	<li>노출 시간을 자동으로설정합니다. 비닝을 작게 설정합니다.</li>
	<li>f/stop을 발광용 1개, 사진의 경우 8로 설정합니다. f/stop은 충전된 결합 장치 검출기에 의해 수신된 빛의 양을 제어합니다.</li>
	<li>뷰 필드를 C로설정합니다.</li>
	<li>마우스 샘플이 이미징에 대한 준비가 되면 이미징 수집을 클릭합니다. 충분한 루시파아제 활성을 가진 마우스는 추가 연구를 위해 선택되었다. 참고: 적합한 흉막 보급 모델은 복부 측에서 볼 때 가슴의 확산 부위에 강한 발광을 보여줍니다. BLI 이미지가 흉부에서 확산되지 않고 주사 부위에서만 종양을 피하로 이식할 수 있다.</li>
	<li>이미지를 표시한 후 표시 형식을 래디언스로 설정합니다. 도구 팔레트 패널을 엽니다(그림4A).</li>
	<li>ROI 도구를 선택합니다. 원(Circle)을 사용하여 이미지의 생물 발광 영역범위를 조정하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>표면 생체 발광 강도를 측정하려면 측정 ROI를 클릭합니다(그림4B).</li>
	<li>ROI 측정 패널의 왼쪽 모서리에 측정 구성을 사용하여 필요한 값/정보를 선택합니다. 이 데이터 테이블을 .csv파일(그림 4C)으로내보냅니다.</li>
	<li>총 플럭스(p/s)의 값을 .csv 파일의 생체 발광 강도 정량화로 사용합니다.</li>
</ol>4. 확산 발광 화상 진찰 단층 촬영 (DLIT)
참고: 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어는 재료 표에나열됩니다.
<ol><li>X선 무장 버튼을 켭니다.</li>
	<li>마우스(2.3단계)를 마취한 다음 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)을 마우스에 내회음주사한다. 3.2에서 3.7까지 DLIT를 연속 촬영하려면 이 단계를 건너뜁니다.</li>
	<li>주입 후 10 분, BLI 장비에 마우스를 설정합니다.</li>
	<li>소프트웨어의 인수 제어판을 엽니다. 발광, 사진, CT, 스탠다드 원 마우스및 오버레이를선택합니다. 다른 설정은 3.4-3.6(그림 5A)과동일했습니다.</li>
	<li>수집 제어판에서 이미징 마법사를 선택합니다.</li>
	<li>생물 발광을 선택한 다음 DLIT (그림 5B)를선택합니다.</li>
	<li>측정할 파장으로 반딧불을 선택합니다(그림 5C).</li>
	<li>이미징 피사체를 마우스로설정, 노출 매개 변수를 자동 설정으로설정, 시야필드는 C-13.4cm,피사체 높이를 1.5cm(그림 5D)로설정합니다.</li>
	<li>활력을 불어넣으면 X선을 밀어붙입니다. 획득.</li>
	<li>CT 순차적 이미지 데이터를 엽니다.</li>
	<li>도구 팔레트에서 표면 지형을 엽니다. 표시(그림 6A)를선택합니다.</li>
	<li>보라색 디스플레이가 바디표면(도 6B)만표시할 때 임계값을 조정합니다. 그런 다음 피사체 누드 마우스를 선택하고 생성 표면을 클릭합니다. 마우스의 윤곽선이 정확하게 그려졌는지 확인하십시오(그림6C).</li>
	<li>도구 팔레트를엽니 다, DLIT 3D 재건 속성 탭. 마우스 조직으로 조직 속성을 선택하고 반딧불로 소스 스펙트럼(그림 6D). 다음으로 분석 탭을 열고 선택한 각 파장 데이터에 대한 데이터를 확인합니다. 마지막으로 재구성 버튼(그림6E)을클릭합니다.</li>
	<li>구성된 DLIT 이미지에서 흉부 캐비티에 BLI의 존재를 확인합니다.</li>
</ol>5. 생체 내 흉막 보급 모델에 대한 NIR-PIT
<ol><li>파워 미터로 690 nm 파장 (NIR) 레이저의 광 용량을 측정하고 출력을 100 mW / cm2로조정합니다. 참고 : 레이저 빛은 정확한 코일 크기와 일치합니다. 따라서, 빛 에너지는 50cm 이내의 거리에 관계없이 거의 변하지 않습니다. 화상과 같은 부작용이 많은 경우 40mW/cm2범위 내에서 출력을 줄입니다.</li>
	<li>70% EtOH로 꼬리를 청소하고 NIR 조사 전에 24h의 꼬리 정맥을 통해 APC(100 μg)를 정맥 주사합니다. 출혈을 제어하기 위해 주사 부위에 압력을 가하십시오. 참고: APC의 부피를 주입시 50-200 μL로 조정합니다.</li>
	<li>마우스 (단계 2.3)를 마취시키고 등에 놓습니다. 비대상 부위에 대한 NIR 조사를 피하기 위해 알루미늄 호일로 다른 부위를 보호하십시오(도7A). 100 J/cm2의레이저로 NIR 빛으로 조사; 종양이 배로 다시 보급되는 경우, NIR 라이트 조사 용량은 여러 방향으로 나눌 수있다(도 7B). 참고: 시험관 내 결과 및 화상과 같은 부작용에 따라 30-150 J/cm2에서 복용량을 조정합니다.</li>
	<li>NIR 조사가 완료되고 마우스가 깨어있을 때 케이지로 돌아갑니다.</li>
	<li>BLI를 관찰하고 시간이 지남에 따라 ROI를 측정합니다(매일) (3.2-3.12 참조).</li>
	<li>전 생체 내 이미징의 경우, NiR 조사 직전에 APC 주입 후 24시간 이산화탄소로 마우스를 안락사시킵니다.<ol>
<li>마우스 가슴 안쪽을 관찰하려면 흉부를 제거하고 갈비뼈와 흉골을 자른다. APC 투여 없이 제어와 함께 형광 영상(700nm)을 캡처합니다. 이어서, 노출된 흉부 위에 D-루시퍼린(150 μg/mL)을 적용하고, BLI를 촬영하였다(참조 3.2-3.7 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

본 연구에서는, MPM의 흉막 보급 모델에 대한 NIR-PIT의 치료 효과를 측정하는 방법을 시연하였다. 매우 선택적 세포 살인은 NIR-PIT로 수행되었다; 따라서, 정상 조직은 거의손상되지 않았다 23,24,25. 이러한 유형의 선택적 세포 살인으로 NIR-PIT은 보급 된 모델9,26에서안전하다는 것이 입증되었습니다. 그러나 일부 단계에서는 대체 방법이 가능합니다. 흉막보급모델(27,28,29,30)...

암은 수십 년간의 연구에도 불구하고 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 한 가지 이유는 방사선 요법과 화학 요법이 매우 침습적 인 기술이며 치료 혜택을 제한 할 수 있기 때문입니다. 덜 침습적인 기술인 세포 또는 분자 표적 치료는 증가된 주의를 받고 있습니다. 광면역요법은 면역요법과 광선요법을 결합하여 치료 효과를 시너지효과를 향상시키는 치료 방법입니다. 면역 요법은 종양 미세 환경의 면역원성을 증가시키고 면역 조절 억제를 감소시켜 종양 면역력을 향상시켜 신체에서 종양이 파괴됩니다. 광요법은 광광원과 광선의 조합으로 1차 종양을 파괴하고, 종양 세포에서 방출되는 종양 특이적 항원들은 종양 면역력을 향상시킵니다. 종양은 표적 세포에 대해 구체적이고 선택적이기 때문에 광광합성제를 사용하여 선택적으로 치료될 수 있다. 광요법의 양면에는 광역학 치료(PDT), 광열 요법(PTT), 광화학 계 치료1이포함된다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 광화학계 치료와 면역요법1,2를결합한 최근 개발된 항종양 광요법 방법입니다. NIR-PIT은 근적외선 실리콘 프탈로시아닌 염료, IRdye 700DX(IR700)의 컨쥬레이션을 통해 특정 세포 표면 분자를 단일 클론 항체(mAb)로 표적화하는 분자 표적 요법이다. 표적 셀의 세포막은 NIR 광(690 nm)3로조사시 파괴된다.
기존의 광석제와 항체 또는 표적 PDT를 결합하여 표적 광요법을 사용하는 개념은3년이상4,5이다. 이전 연구는 항체에 그들을 연상시켜 기존의 PDT 에이전트를 대상으로 시도했다. 그러나, 이러한 컨쥬게이트가광세제6,7의소수성 때문에 간속에 갇혀 있었기 때문에 제한된 성공이 있었다. 더욱이, NIR-PIT의 메커니즘은 기존의 PDT와 완전히 다릅니다. 기존의 광세제는 광에너지를 흡수하고, 흥분된 상태로 탈구하고, 지면 상태로 전환하며, 아멸을 유발하는 에너지 변환으로 인한 산화 스트레스를 생성합니다. 그러나, NIR-PIT는 광화학 반응을 통해 막에 광합성제를 집합하여 세포막을 직접 파괴함으로써 급속한 괴사를 일으킨다8. NIR-PIT은 여러 가지 면에서 기존의 표적 PDT보다 우수합니다. 기존의 광세제는 낮은 소멸 계수를 가지고 있으며, 단일 항체 분자에 많은 수의 광세제부착이 필요하여 잠재적으로 결합 선호도를 감소시킵니다. 대부분의 종래의 광감제는 소수성으로, 광광전제를 면역 반응성 또는 생체 내 표적 축적을 손상시키지 않으면서 항체에 결합하는 것을 어렵게 만듭니다. 기존의 광세제는 일반적으로 가시 범위에서 빛을 흡수하여 조직 침투를 감소시킵니다.
폐암 과 악성 흉막 중피종 (MPM) 세포와 같은 내트라토라시종양을 대상으로 하는 NIR-PIT에 대한 여러 연구는9,10,11,12,13,14, 15,16,17로보고되었다. 그러나, 단지 몇몇 보고는 흉막 분비MPM 또는 폐암 모형9,10,11,12에서NIR-PIT의효험을기술했습니다. 피하 종양 이종이이식 모델은 표준 종양 모델로 생각되며 현재 새로운치료법(18)의항종양 효과를 평가하기 위해 널리 사용되고 있다. 그러나, 피하 종양 미세환경은 적절한 조직 구조또는 실제 악성표현형(19,20,21,22)을적절히 회수하는 조건의발달을허용하지 않는다. 이상적으로, 치열 교정 질병 모형은 항종양 효력의 보다 정밀한 평가를 위해 설치되어야 합니다.
여기서, 우리는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파 폐암의 마우스 모델에서 효능 평가 방법을 시연한다. 흉막 보급 마우스 모델은 흉부 구멍에 종양 세포를 주입하여 생성되고 루시파제 발광을 사용하여 확인된다. 마우스는 IR700과 NIR 조사와 결합된 mAb의 정맥 주사로 가슴에 치료되었다. 치료 효과는 루시파아제 발광을 사용하여 평가하였다.

<table><tbody><tr><td>0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA 4Na 페놀 함유 용액 세포</td><td>배양을 위한</td>Red <td>Wako</td><td>209-016941</td></tr><tr><td>1mL 주사기</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td>마우스 실험용</td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>Nipro</td><td>1907613</td><td>마우스 실험용</td></tr><tr><td>BALB/cSlc-nu/nu</td><td>일본 SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collidal Blue Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td>사용 겔 단백질 염색용</td></tr><tr><td>Coomassie(Bradford) Plus 단백질 분석</td>용 <td>Thermo Fisher Scientific Inc(미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>APC 농도 측정용</td> <td>PI-23200</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide(DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td>IR700</td></tr><tr><td>D-Luciferin(칼륨염</td>) 접합용 <td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td>생물 발광 이미징 및 DLIT</td></tr><tr><td>GraphPad Prism7</td><td></td><td>통계 분석을 위한</td>GraphPad 소프트웨어 <td></td></tr><tr><td>700nm 형광 이미지 분석을 위한</td>Image<td>Studio</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 700DX 에스테르 적외선 염료</td><td>LI-COR Bioscience(Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>Wako</td><td>095-06573</td><td>마우스 마취용</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum CT</td><td>캡처용 PerkinElmer</td><td></td><td> 생물 발광 이미지 및 DLIT</td></tr><tr><td>Living Image</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>분석을 위한 DLIT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td>IR700</td></tr><tr><td>NIR 레이저</td><td>장춘 신산업 광전자 기술</td><td>MRL-III-690R</td><td>NIR 방사선 조사용</td></tr><tr><td>Novex WedgeWell 4-20%, Tris-Glycine, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12 well</td><td>Invitrogen</td><td>XP04202BOX</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 샘플 버퍼 (x4)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>광학 파워 미터</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td>NIR 레이저의 출력 측정&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy 이미징 시스템</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>700nm 형광 이미지 캡처용</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액(x100)</td>세포 <td>배양을 위한</td> <td>Wako</td><td>168-23191</td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로라이드</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>루시페라제 형질주입</td></tr>용 <tr><td>RediFect Red-Fluc-Puromycin 렌티바이러스 Prticles</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS960002</td> L-글루타민 및 페놀<td>을 사용한 루시페라제 트랜스펙션</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Red</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>세포 배양을 위한</td></tr><tr><td>Sephadex G25 컬럼 (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td>APC 농도 측정을 위한 IR700</td></tr><tr><td>UV-1900i</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr>의 활용에 사용</tbody></table>

흉막 보급의 마우스 모형을 위한 근적외선 광면역요법

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

광면역요법의 효능은 피하요법보다 치열식 마우스 모델로 보다 더 정확하게 평가될 수 있다. 흉막 보급 모델은 폐암 또는 악성 흉막 중피종과 같은 내트라토라시질환에 대한 치료 방법의 평가를 위해 사용될 수 있다.
근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 NIR 광에 노출된 후 광흡수제(IR700Dye)에 의한 독성과 종양 표적화 항체의 특이성을 결합한 최근 개발된 암 치료 전략이다. NIR-PIT의 효능은 다양한 항체를 사용하여 보고되고 있다; 그러나, 단지 몇몇 보고는 치열 교정 모형에 있는 이 전략의 치료 효력을 보여주었습니다. 본 연구에서는 NIR-PIT를 사용하여 치료된 흉막 전파폐암 모델의 효능 평가의 예를 시연한다.

안티 포도플라닌 항체 NZ-1은 NZ-1-IR700을 생성하기 위해 IR700과 결합되었다. 우리는 SDS-PAGE(도 8)에NZ-1 및 IR700의 바인딩을 확인했다. 루시파아제 발현 H2373(H2373-luc)은 악성 중피종 세포(H2373)를 루시파아제유전자(10)로이식하여 제조하였다.
우리는 8-12 주 된 여성 homozygote athymic 누드 마우스를 마취하고 흉부 구멍에 105 H2373 luc 세포를 × 주입했습니다. 마우스내 종양 세포를 주입하는 날은 1일로 표시되었다.
4일째에 BLI 및 DLIT는 D-루시페린(15 mg/mL, 200 μL)을 주사한 후, 흉부 캐비티에서 충분한 루시파아제 활성을 가진 마우스를 추가 연구를 위해 선택하였다(그림9).</s...

근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 항체-광흡수제(IR700Dye) 컨쥬게이트와 NIR 라이트를 활용하여 암세포를 파괴하는 신흥 암 치료 전략이다. 여기서, 우리는 생물발광 이미징을 사용하여 흉막 전파폐암 및 악성 흉막 중피종의 마우스 모델에서 NIR-PIT의 항종양 효과를 평가하는 방법을 제시한다.

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

이 방법은 임상적으로 관련된 종양 모델에서 흉부 종양에 대한 NIR-PIT의 치료 효과를 평가하는 데 사용할 수 있다. 흉막 전파암 모델을 이용한 NIR-PIT 절차는 이해하기 쉽고 수행이 용이합니다. 마우스 보급 모델을 설정하려면 폴리스티렌 폼을 사용하여 스토퍼를 만들고 70% 에탄올로 소독합니다.스토퍼에서 5밀리미터 를 연장하는 팁으로 바늘을 스토퍼에 부착합니다. 깨끗한 집게로 30 게이지 바늘의 끝을 구부리거나 70%에탄올로 세척된 단단한 물체에 대해 구부리고, PBS의 100마이크로리터에서 6개의 표적 종양 세포에 1회 10번 주사기를 채웁니다. 마취, 19 ~ 21 그램, 8 ~ 12 주 된, 여성, homozygote, 아티믹 누드 마우스에서 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인합니다.간 비용을 통해 가슴에 바늘을 삽입하여 바늘을 위아래로 움직이면서 갈비뼈에 닿지 않도록 하십시오. 팁이 늑간 공간을 통과하면 주사기를 배치하여 마우스에 대고 누를 수 있도록 하고 대상 셀의 전체 부피를 주입합니다. 주입 후 마우스를 2~3회 굴려 흉부 구멍 전체에 세포를 퍼뜨리고 마우스를 전체 복구할 때까지 모니터링하여 케이지로 되돌린다.세포 주입 후 24 시간 및 그 후 매일, 마취 종양 세포 주입 마우스를 주입 200 마이크로 리터 의 15 D-luciferin의 밀리 리터 당 밀리 그램. 10분 후 생발광 이미저에 마우스를 넣고 이미저 소프트웨어에 획득 제어판을 엽니다. 발광, 사진 및 오버레이를 선택합니다.오토에 노출 시간, 작은 비닝, F/스톱을 발광용으로, 사진에 대한 8개, C.Click에서 의 시야를 사용하여 생물 발광을 이미지화합니다. 디스플레이 형식을 Radians로 설정하고 도구 팔레트 패널의 관심 영역 도구에서 원을 선택합니다. 관심 영역 측정을 클릭하여 표면 생물 발광 강도를 측정하고 측정 구성을 사용하여 실험과 관련된 값을 선택합니다.이 데이터 테이블을 csv 파일로 내보냅니다. 그런 다음 파일내의 생물 발광 강도 정량화에 대한 총 플럭스 값을 사용합니다. 종양 주입 마우스의 근적외선 광요법을 수행하기 전에 파워 미터를 사용하여 690 나노미터 파장 레이저의 광 용량을 측정하고 출력을 평방 센티미터당 100 밀리와트로 조정합니다.치료 24시간 전, 종양 주입 동물의 꼬리 정맥을 통해 PBS의 50~200 마이크로리터에 항체 광석 원두 100 마이크로그램을 정맥 주사했다. 광치료 치료 당일, 마취된 공주포를 주입하고 종양이 함유된 마우스를 척추 위치에 배치하고, 알루미늄 호일로 비표적 부위를 보호한다. 모든 방패가 배치되면 평방 센티미터당 100 줄-줄-100-jules-100-jules-10meter 레이저를 사용하여 약 30초 동안 근적외선으로 흉부 구멍을 조사합니다.조사가 완료되고 마우스가 깨어났을 때 동물을 케이지로 돌려보내서 입증된 대로 매일 생체 발광을 측정합니다. 본 대표적인 분석에서, IR700을 가진 항포도플라닌 항체의 결합은 SDS-PAGE 분석에 의해 확인되었다. 종양 세포 주입 후, 생체 발광 이미징 및 확산 발광 화상 진찰 단층 촬영은 추가 연구를 위해 흉부 에서 충분한 루시파라기 활성을 발현하는 마우스를 결정하기 위해 수행되어야한다.주사 후 5일째에, 항포도플라닌 항체 IR700-주입마우스는 흉부 종양에서 높은 IR700 형광 및 루시파제 활성을 입증하여 정맥 주사IR700-컨쥬게이트 항체가 보급된 흉막 종양 부위에 도달함을 나타낸다. 특히, 근적외선 광면역요법으로 치료된 흉막 전파 마우스는 감소된 루시파아제 활성을 나타내며, 대조군내 상대광단위는 강도의 점진적 증가를 나타낸다. 필요한 NIR 조사 에너지는 세포주 및 항체에 달려 있기 때문에 시험관 내에서 사전에 상태를 확인하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 비침습적 비수술적 방법입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다. 이 비디오는 종양이 있는 마우스에서 나노입자를 함유한 광감작제를 사용하여 광감작제의 광독성 가능성을 측정하기 위한 생체 내 항종양 효능 분석에 대해 설명합니다.

PDT의 생체 내 항종양 효능 분석: 종양 보유 마우스에서 광감작제의 광독성 가능성을 측정하는 기술

이 비디오는 면역 결핍 마우스의 흉강에 폐암 세포 현탁액을 주입하여 흉막 파종의 마우스 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다.

흉막 파종성 폐암의 마우스 모델 확립

이 비디오는 루시페라아제를 발현하는 종양 세포를 나타내는 공학적 마우스 모델에서 폐암을 치료하기 위한 근적외선 광면역요법 기술을 보여줍니다. 종양 세포의 특정 항원에 결합하는 항체-광감작 접합체(APC)를 주입하면 마우스는 근적외선에 노출되어 APC에 광화학적 변화를 유도하고 결합된 종양 세포의 괴사를 유발합니다. 치료의 효과는 루시페라제 기질인 루시페린을 주입하고 종양 성장과 상관관계가 있는 시간 경과에 따른 생물 발광을 측정하여 모니터링됩니다.

쥐 모델에서 폐암을 치료하기 위한 근적외선 광면역요법 기법

이 동영상은 근적외선 광면역요법을 통해 혼합 3D 세포 배양에서 특정 세포를 선택적으로 제거하는 기술을 보여줍니다. 이 방법에서는 NIR 광흡수제와 접합된 항체를 사용하여 표적 세포를 정확하게 식별합니다. 이후 적외선을 조사하면 세포 사멸을 유도하여 3D 배양에서 표적 세포를 효과적으로 제거할 수 있습니다.

혼합 3D 배양에서 표적 세포 제거를 위한 근적외선 광면역요법

다른 세포를 손상시키지 않고 특정 세포를 제거하는 것은 특히 기존 조직에서 매우 어렵지만 조직 공학 분야에서 세포 제거 방법이 시급히 필요합니다. 여기에서는 근적외선 광면역요법(NIR-PIT)을 이용한 혼합 3D 세포 배양에서 특이적 세포 제거 방법을 제시합니다.

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

만능 줄기 세포 유래 teratomas 위한 치료 전략에 대 한 연구는 줄기 세포 치료의 임상 번역 중요 합니다. 여기, 우리 첫째, 쥐에서 그리고, 선택적으로 대상 줄기 세포 유래 teratomas를 생성 하 고 생체 조건 작은 동물 irradiator를 사용 하 여 이러한 종양을 치료 하는 프로토콜을 설명 합니다.

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이 기사에서는 H2052/484 중피종 세포를 면역 손상된 심질 마우스의 흉막 강내로 이식함으로써 인간 흉막 중피종의 정형외 마우스 모델의 생성을 설명합니다. 내림두근 종양의 발달에 대한 종방향 모니터링은 비침습적 다중모달[18F]-2-플루오로-2-디옥시-D-포도당 양면 방출 단층 촬영 및 컴퓨터 단층 촬영 영상에 의해 평가되었다.

심질 마우스에 있는 인간 흉막 중피종의 정형외 모형의 PET/CT에 의한 이식 및 모니터링

이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.

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Intravital microscopy 결과의 번역은 조직에 대한 얕은 깊이 침투로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 여기에서는 직접적인 공간 상관 관계를 위해 생체 내 현미경 검사와 임상적으로 적용 가능한 이미징 양식(예: CT, MRI)을 함께 정합할 수 있는 등쪽 창 챔버 마우스 모델에 대해 설명하며, 이를 통해 생체 내 현미경 검사 결과의 임상 번역을 간소화할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 고형 종양 모델에서 표적 온열 요법에 필요한 기술과 방법론을 제시합니다. 이 접근법은 종양 내 주입된 금 나노로드에 의한 근적외선의 광열 변환을 활용하여 종양 미세 환경 내에서 국부적인 가열을 유도합니다.

종양내 금 나노로드에 의한 근적외선의 광열 변환을 통한 쥐 종양 모델에서 표적 경미한 온열요법 유도

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흉막 보급의 마우스 모형을 위한 근적외선 광면역요법

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