Name: 제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 배아에서 점동 상피 오르가노이드를 생성하고 고해상도 라이브 이미징으로 세포 전이를 실시간 관찰하는 방법을. 이 프로토콜은 상피 발달 연구에 활용됩니다.

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김랩과 랜스 데이비슨 의 의견과 성원에 감사드립니다. 이 작품은 기초과학연구소(IBS-R0250Y1)의 HYK에 대한 젊은 과학자 펠로우십에 의해 지원되었습니다.

동물사용 및 실험 프로토콜은 기초과학연구소(IBS 18-01)와 한국과학기술원(KA2017-22)의 기관동물관리 및 사용위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 배아
<ol><li>표준 절차를 사용하여 X. laevis 배아를 얻습니다 : 자극된 여성 개구리에서 수동으로 계란을 수집하고 체외 수정18,19에서수행합니다.</li>
	<li>디젤리는 pH 819에서1/3x 변형 바스식염수(MBS; 아래 1X MBS용 레시피 참조)에서 시스테인2%에서 약 5분 동안 부드러운 동요를 가진 수정된 배아를 수정하였다.</li>
	<li>라이브 이미징을 위한 선택적 단계: 특정 단백질을 형광으로 표시하고 오르가노이드의 역학을 관찰하고 섹션 5로 진행합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 오르가노이드 내의 피상적 이포균 세포의 오염을 모니터링하려면 9 단계에서 NHS-로다민으로 배아의 정황 표면을 라벨을부착하십시오. 1 mg/mL NHS-로다민에서 1/3x MBS(pH 9.0)에서 30분 동안 부드러운 견과류를 가진 배아를 배양합니다. 1/3x MBS로 채워진 페트리 접시로 15분 동안 배아를 세 번 씻으셔도 됩니다.</li>
	<li>10단계의 첫 징후가 검출될 때까지 바람직한 온도(14-26°C)에서 1/3x MBS로 배아배(즉, 식물뷰에서 블라도포소 주위의 어두운 색소 세포의 출현).</li>
</ol>2. 미세 수술 도구, 솔루션 및 배양 용기 의 준비
<ol><li>수술급 편두와 헤어툴(헤어루프, 헤어나이프)을 포함한 필요한 도구를 준비하여20.</li>
	<li>1/3X MBS는 NaCl(88mM), KCl(1mM), 나흐코 3(2.4mM), MgSO 4(0.82mMM), Ca(NO 3)2(0.33mM), CaCl 2(0.41mM), HECl2(0.41mM) 및 HECl(10m)으로 제작된다. pH를 10M NaOH로 7.4로 조정합니다. 참고: 선택 사항: pH를 나타내기 위해 페놀 레드 방울을 추가합니다.</li>
	<li>배아 조직과 오르가노이드에 대한 다음 배양 매체를 준비하십시오: 다닐치크의 에이미(DFA)21은 신선한 1%의 항생제와 항진균용액으로 보충됩니다. NaCl(53mM), Na2CO3(5mM), 칼륨 글루코네이트(4.5mM), 나트륨 글루코네이트(32mM), CaCl 2(1mM), MgSO4(1mM)로 DFA를 준비한다. pH를 과립 비신으로 8.3으로 조정합니다. 필터 DFA (0.2 μm 병 상단 필터), 알리 쿼트 및 -20 ° C에 저장합니다.</li>
	<li>위의 레시피를 사용하고 CaCl2 및 MgSO4를생략하여 심층 세포를 텍토더름으로부터 분리하기 위한 칼슘 및 마그네슘 이없는 DFA를 준비한다. 알리쿼트 및 저장 -20 °C.</li>
	<li>배아 세포 응집을 위한 비 접착제 PCR 튜브를 준비합니다.<ol>
<li>격리된 배아 세포의 자발적인 응집을 유도하기 위해, 1%BSA의 200 μL(증류수 100mL에서 BSA 1g)로 둥근 바닥 PCR 튜브를 코팅하여 비접착제 PCR 튜브를 4°C 또는 실온에서 2시간 동안 준비한다. 각 튜브는 하나의 오르가노이드를 조립하는 데 사용됩니다.</li>
		<li>DFA와 함께 BSA 코팅 PCR 튜브를 세 번 헹구어 잔류 BSA를 제거합니다.</li>
		<li>DFA의 200 μL로 PCR 튜브를 채웁니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 깊은 외장 세포의 격리
<ol><li>입체로 모발 도구를 사용하여 10단계 초반에 도달할 때 배아를 선택하고 수집합니다.</li>
	<li>일회용 이송 파이펫을 사용하여 선택한 배아를 DFA로 채워진 페트리 접시로 옮킨다.</li>
	<li>배아의 동물 측면을 방해하지 않고 식물 측에서 날카로운 집게를 사용하여 배아의 진동 막을 제거하십시오. 참고: 배아가 공중에 노출되는 것을 피하십시오. 용액에 기포를 도입하거나 배아를 표면에 가져 오는 것은 배아가 파열될 것입니다.</li>
	<li>동물 뚜껑을 분리하려면 배아의 동물 측면을 위로 배치합니다.</li>
	<li>동물 모자의 정도를 시각적으로 추정하고 헤어 칼로 동물 모자의 가장자리를 따라 첫 번째 절개를합니다. 헤어 나이프를 바깥쪽으로 당겨 잘라냅니다.</li>
	<li>3.5 단계를 반복하여 작은 상처 체인을 만들어 동물 모자를 소비합니다.</li>
	<li>메소더름 전구체가 포함되는 것을 방지하기 위해 헤어 나이프를 사용하여 동물 모자의 두꺼운 층 가장자리를 다듬습니다. 참고: 격리된 동물 뚜껑의 치유와 응집을 방지하려면 10분 이내에 다음 단계로 진행하십시오. 일반적으로, 우리는 여러 오르가노이드를 조립하기 위해 한 번에 5-10 동물 뚜껑을 분리합니다.</li>
	<li>깊은 외생물 세포를 동물 뚜껑에서 분리하려면 절제된 동물 뚜껑을 칼슘과 마그네슘이 없는 DFA로 채워진 페트리 접시에 일회용 이송 파이펫으로 옮겨보도록 한다. 전송 하는 동안 어떤 기포를 소개 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>다음 단계에 충분한 공간을 유지하려면 헤어 도구를 사용하여 동물 뚜껑을 배치하여 동물 측을 위로 향하게 하고 다른 각기에서 넓은 거리를 유지합니다.</li>
	<li>5-10 분 기다린 다음 스테레오 스코프에서 이출을 모니터링합니다. 일단 풀어진 깊은 세포는 어두운 색소피층의 가장자리에서 발견되면, 입체범위 아래의 머리 칼을 사용하여 밝은 색의 깊은 자궁 세포에서 피상적 인 층을 들어 올리기 시작합니다.</li>
	<li>조심스럽게 가장자리에서 시작하여 헤어 칼로 피상층을 분리 (벗겨냅니다).</li>
	<li>다음 단계에서 응집 매체로 전송되는 칼슘 및 마그네슘 이없는 DFA의 양을 제한하기 위해 최소 포부(10\u201215 μL)로 깊은 외장 세포를 수집합니다. 참고: 분리된 피상 세포는 나머지 심층 자궁 세포를 오염시키는 것을 방지하기 위해 매체에서 제거될 수 있다.</li>
</ol>4. 점액 상피 오르가노이드의 생성
<ol><li>DFA의 200 μL을 포함하는 비 접착제 PCR 튜브에 깊은 외음세포를 수집전송. 부드럽게 PCR 튜브에 전송 된 세포를 분산하는 미디어 (2\u20123 시간)를 피펫. 참고: 시간 사후 집계(hpa)로 지정된 타이밍은 이 단계에서 시작됩니다. 결과 오르가노이드의 크기는 PCR 튜브에 추가된 깊은 자궁 세포의 수에 의해 제어됩니다. 하나 이상의 동물 대문자로부터의 깊은 자궁 세포를 사용하일 수 있으며, 원하는 크기인 오르가노이드의 크기에 따라 사용할 수 있다.</li>
	<li>PCR 튜브를 닫습니다. PCR 튜브를 똑바로 세워 서 바닥에 자발적인 응집을 유도합니다.</li>
	<li>입체 범위에서 집계 프로세스를 모니터링합니다. 세포는 일반적으로 1시간 이내에 PCR 튜브의 바닥에 모여 크기에 따라 2-3h 이내에 구형 골재로 조립합니다.</li>
	<li>점액 상피 오르가노이드의 개발 중 라이브 이미징 또는 약물 검사를 수행하기 위해, 수집 중에 골재에 손상을 주지 않도록 확대 팁(멸균 가위로 절단)이 장착된 200 μL 파이펫을 사용하여 2hpa에서 골재를 수집합니다.</li>
	<li>골재가 배양시 점액 상피 오르가노이드로 발전할 수 있도록 5마에서 PCR 튜브에서 구형 골재를 수집하고 DFA가 채워진 페트리 접시로 옮깁니다.</li>
	<li>응집체가 다른 집계와 멀리 떨어져 배치하여 융합을 방지합니다. 추가된 요인 없이 실온에서 배양24시간 이내, 성숙한 점액 상피 오르가노이드는 분화된 상피의 표면을 덮는 섬모를 치는 동작으로 회전되는 것을 관찰할 수 있다.</li>
</ol>5. (선택 사항) 고해상도 라이브 이미징 개발 오르가노이드
<ol><li>미세 주입을 위해 mRNA를 준비하십시오.<ol>
<li>오르가노이드 형성의 초기 단계에서 발생하는 상피화를 시각화하려면 상피 특이 적 조눌라 클로덴스 단백질-1 (ZO-1)에 대한 mRNA를 준비하고 pCS2-ZO1-RFP 및 pCS2-mem-GFP 플라스미드 (랜슨 데이비슨의 선물)을 증폭하여 세포 막을 요약하십시오.</li>
		<li>플라스미드 DNA를 추출하고 선형화한 다음 시험관 내 전사 키트에서 SP6/T7을 사용하여 캡된 mRNA를 전사한다.</li>
		<li>전사된 mRNA를 알리쿼트와 -80°C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>mRNA를 수정된 배아에 마이크로 주입<ol>
<li>1x MBS에 3% 피콜에 기름지게 한 배아를 놓습니다.</li>
		<li>마이크로 로더 팁을 사용하여 mRNA의 3-4 μL을 당겨진 유리 바늘에 적재하십시오 (10\u201230 μm의 내지름이있는 길고 미세한 테이퍼 바늘 끝).</li>
		<li>마이크로 인젝터에 바늘을 부착하고 미세 주입을위한 mRNA의 일정한 볼륨을 제공하기 위해 시간과 압력을 조정합니다.</li>
		<li>동물 극의 정표면 바로 아래에 mRNA를 주입한다. 피질의 팽창에 기인하는 뚜렷한 창백한 백색 원형 패치는 미세 주입의 시간에 보입니다.</li>
		<li>주입된 배아를 1/3X MBS로 옮기고 이를 9.5단계로 배양한다.</li>
		<li>형광 계체(GFP(488/510)와 RFP(532/588)의 형광 성소 로 분류된 배아를 수집합니다.</li>
		<li>1.3 단계를 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 개발 단계까지 오르가노이드(섹션 3 및 4)를 조립하고 배양합니다.</li>
	<li>라이브 이미징을 수행합니다.<ol>
<li>실리콘 그리스를 사용하여 커스터마이즈드 아크릴 챔버에 커버 글래스를 접목하여 유리 바닥 이미징 챔버를 준비합니다. 참고: 배양 매체의 유출을 방지하기 위해 챔버를 단단히 밀봉하십시오.</li>
		<li>DFA로 이미징 챔버를 채웁니다.</li>
		<li>집게를 사용하여 용기에서 육각형 투과 전자 현미경(75 메쉬) 그리드(75 메쉬)를 선택하고 그리드 가장자리에 소량의 그리스를 적용합니다. 참고: 집계가 그리드에 표시되도록 메시의 크기는 집계지의 지름보다 작아야 합니다.</li>
		<li>가볍게 눌러 이미징 챔버의 바닥에 TEM 그리드를 고정합니다.</li>
		<li>응집체를 이미징 챔버로 옮기고 그리드 내에 배치합니다. 참고: 그리스 옆에 있는 골재를 배치하지 마십시오. 실험 전반에 걸쳐, 골재는 물리적 압축을 방지하기 위해 챔버의 바닥에 접촉하지 않고 TEM 그리드에 앉아야 한다.</li>
		<li>이미징 챔버를 DFA로 채우고 커버 유리와 그리스로 밀봉합니다. 참고: 챔버는 이미징 중에 난류 나 움직임을 방지하기 위해 기포가없는 밀폐되어 있어야합니다.</li>
		<li>점액 상피 오르가노이드 형성의 진행을 따르기 위해, 공초점 현미경을 사용하여 골재(2 hpa에서)의 시간 경과 z-스택 이미지를 수집합니다. 참고: 우리는 일반적으로 동적 셀 거동을 따르기 위해 20X 목표를 사용하여 15 분마다 ~ 120 μm 두께의 z 스택을 수집하지만 이러한 사양은 실험의 목표에 최적화되어야합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. (선택 사항) 고정 및 면역 염색에 의해 오르가노이드를 개발하는 이미징
<ol><li>고정 용액으로 채워진 유리 유리 유리 바이알로 전송하여 원하는 개발 단계에서 오르가노이드를 수정합니다. 참고: 완벽한 고정을 보장하기 위해 샘플의 20배의 고정 솔루션을 추가합니다. 달리 언급하지 않는 한 영양사에서 다음 프로세스를 수행합니다. 일반적으로 오르가노이드는 PBS에서 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정됩니다. 그러나, 다른 고정제는 특정 단백질을 검출하기 위하여 요구될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 F-액틴과 아세틸레이션 튜룰린을 검출하기 위해 PBS에서 0.25 %의 글루타랄데히드와 4 % PFA를 사용했습니다. intelectin (ITLN) 및 ZO-1을 검출하기 위해 오르가노이드는 -20 °C에서 하룻밤 동안 얼음 차가운 덴트의 용액 (4:1 메탄올 : 디메틸 설프리산화물)으로 고정됩니다. 덴트의 고정 된 오르가노이드는 세척 (6.3 단계)전에 연속적으로 탈수해야합니다. 항체 인큐베이션 및 세척 에 대한 기간은 특정 요구에 최적화 될 수있다.</li>
	<li>실온(RT)에서 15분 또는 4°C에서 하룻밤 동안 오르가노이드를 수정합니다.</li>
	<li>PBST(PBS 0.1% 트리톤 X-100)로 3회 세척하여 RT에서 15분 간 세척합니다.</li>
	<li>RT에서 1h에 대한 PBST (PBSGT)에서 10 %의 염소 혈청으로 특이하지 않은 바인딩을 차단합니다.</li>
	<li>PBSGT에서 하룻밤 사이에 4°C에서 1차 항체(1:200)를 배양한다.</li>
	<li>RT에서 15 분 동안 PBST로 3 번 씻으시면됩니다.</li>
	<li>PBSGT에서 하룻밤 사이에 4°C에서 이차 항체(1:200)를 배양한다.</li>
	<li>RT에서 15 분 동안 PBST로 3 번 씻으시면됩니다.</li>
	<li>고정 및 면역스테인드 오르가노이드를 이미징 챔버로 옮기고 공초점 이미징을 진행합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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X. laevis 배아의 깊은 외래 세포에서 생성된 점막 상피 오르가노이드는 체외에서 다능성 선조의 상피화 및 분화를 연구하는 강력한 도구입니다. 시험관내유기발생(13)에 널리 사용되는 널리 채택된 동물모자분석16및 그대로 외발성 외래를 활용하는 점막상피(15,17,22)의 발달과는대조적으로, 이 프로토콜에 제시된 깊은 텍토더름 유래 오르가노이드는 표면 의약의 조직 역학 중심의 재생 단계를 모니터링할 수 있는 뚜렷한 기회를 제공한다. 약 2마마에서, 새로 생성된 ZO-1 양성 상피세포(그림2)는오르가노이드의 정표면에 나타나기 시작하고 조직이 고화되거나 규정준수(14)를감소시키는 동안 전체 오르가노이드를 커버하기 위해 인구를 증가시킨다. 점액 생성 잔 세포에 대한 상피 및 후속 계보 사양의 재생은 하루 이내에 화학적으로 정의된 배양 배지에서 자발적으로 진행된다. 이러한 급속하게 발달하는 점액 상피 오르가노이드는 상피 재생의 점진적 단계 동안 실시간으로, 고해상도로 동적 세포 행동을 검사할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 또한 점막 상피 발달, 항상성 및 관련 질환2,9,23동안 발생하는 근본적인 질문에 대한 조사를 가능하게 한다. 특히,오르가노이드(14)에서 확인된 상피 잔류세포 전구체로 전환하는 동안 깊은 전구세포의 기계적 감도는 점액분분이 있는 고블세포가 과도하게 또는23일이상 생산되는 비정상적인 기저분과 관련된 호흡기 질환을 연결하는 역할을 할 수 있다.
이 프로토콜은 이러한 오르가노이드를 생성하는 간단한 접근 방식을 제공하지만 실험에서 성공을 위한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 동물 모자에서 깊은 외피 세포의 격리 동안 피상상성 세포의 오염을 방지하기 위해, 하나는 입체 범위에서 칼슘과 마그네슘이없는 DFA에 배치 된 동물 모자를 모니터링하고 동물 모자의 어두운 색소 표면 층의 분리를 시작하는 적절한 시기를 감지해야합니다. 조직이 너무 오랫동안 칼슘과 마그네슘이 없는 DFA에 보관되면 전체 조직이 해리되고 깊은 세포와 피상 세포를 구별하는 것은 깊은 자궁 내체 골재에 불가능할 것입니다. 깊은 이포더름 골재에 피상적 세포의 부재를 확인하기 위해, 우리는 형광으로 미세 수술 전에 NHS-로다민 (단계 1.414)와태아의 표면을 표시하는 것이 좋습니다; 이것은 그(것)들이 결과 유기체에 존재하는 경우에 표면 세포의 쉽게 식별을 허용할 것입니다. 상피 재생은 조직 역학(14)에의해 조절되기 때문에, 자가 조직 오르가노이드에 대한 의도하지 않은 힘 생성을 피하는 것이 필수적이다. 특히, 라이브 골재의 이미징 창(Step 5.1.2)과 의 자유로운 접촉을 허용하므로 TEM 그리드의 가장자리에 골재를 배치하여 라이브 이미징 중 이미징 챔버의 유리 바닥과의 접촉을 피하는 것이 좋습니다. 이 시험관 내-점막 상피에 대한 배양, 자체 조직 3D 모델은 상피의 재생 과 잔 세포의 혈통 사양의 재생 중에 발생하는 근본적인 질문에 대답하는 견인 도구로 작용할 것입니다.

점막 상피의 상해, 감염 및 질병은 만성 폐쇄성 폐질환, 천식, 낭포성 섬유증, 기관지증 및 1차 실모성 운동장애1,2,3,4와같은 폐 질환에서 흔히 발견되는 점액의 생산 및 통관과 관련이있다. 최근 오르가노이드 기술의 발전은, 예를 들어, 점액상의 재생을 재구성하는 기관권이라고 불리는 기저세포 유래 폐 오르간로이드는 치료 전위1,5,6을가진 유망한 모델로 서 발생한다. 그러나, 그것의 사용은 현재 제한, 부분적으로 인해 정의 된 문화 조건의 부족 과 오르가노이드 생산에 낮은 효율. 인간 기도 및 개구리 표피에서 점동 상피는 조직 형태, 세포 조성 및 그 기능7,8,9,10,11,12에서현저하게 유사하다. 두 유기체 에서 점액 상피는 점액 과 항균 물질을 분비하여 일선 방어를 제공하고 섬모의 동기화 된 작용을 통해 유해한 입자와 병원균을 지웁니다.
여기서, 우리는 제노푸스 라예비증 배아의 다성능성 선조를 사용하여 점액 상피 오르가노이드를 생성하는 간단한 프로토콜을 설명한다13,14. 이전에는 외인성 성장 인자와 세포외 매트릭스가 없는 경우 초기 가스trula 단계에서 미세 수술로 분리된 깊은세포가 자발적으로 응집체로 조립되고 표면의 상피를 재생하며 24h 내에서 다분하게 결합하여 점액 상피로 성숙했다고 14. 급속한 발전 이외에, 이 프로토콜은 다성성 심층 외형 세포의 전이에 직접 접근할 수 있는 뚜렷한 기회를 제공하며,이는 그대로 배아와 텍토더름(동물 캡으로도 알려진)15,16, 16에서사용할 수 없는 중단된 상피 세포 전조자로 의재생 단계를 재구성하는 뚜렷한 기회를 제공한다. 생산된 오르가노이드의 수와 크기는 제노푸스 배아의 시작 물질을 제어하여 고효율로 확장가능합니다. 부동 배양에서 의 오르가노이드는 고해상도 이미징, 기계적 테스트, 약물 치료 및 유전 적특성화(14)를포함하여 추가 분석을 위해 원하는 단계에서 쉽게 분류및 전달될 수 있다. 배아 세포 응집물의 표면에 상피의 이 자발적인 조직 역학 중심의 재생은 점액 상피 오르가노이드를 초래하고 점액 상피의 생물학을 연구하기 위하여 새로운 3차원 (3D) 모형을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual-stage Glass Micropipette Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Picoliter microinjector</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>입체경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>Dumont Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>헤어 나이프</td><td></td><td>참고 (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td><td></td></tr><tr><td>Hair loop</td><td></td><td>Reference (Kay, B.K.; Peng, H.B., 1991)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG 주입</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>human chorionic gonadotropin</td><td>Sigma</td><td>cg10-10vl</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10M 수산화나트륨</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>질산칼슘</td><td>시그마</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>페놀-레드</td><td>시그마</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 시약 등급, 97%, 분말-25g</td><td>시그마</td><td>655104</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강>젤리 제거 용액</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인 염산염 일수화물</td><td>시그마</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 수산화물 10M</td><td>시그마</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DFA 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>0.22mm 필터</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액</td><td>시그마</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>시그마</td><td>B3876</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘</td><td>시그마</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>글루콘산 칼</td>륨 <td>시그마</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>222321</td><td></td></tr><tr><td>글루콘산나트륨</td><td>시그마</td><td>G9005</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRNA in vitro transcription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP6/T7 in</td><td>vitrogen 전사 키트 Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRNA microinjection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>borosilicate 유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microloader 피펫 팁</td><td>ThermoFisher</td><td>A25547</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 코팅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Thermofisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브</td><td>SSI</td><td>SSI-3245-00</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력>이미징</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 밀링 아크릴 챔버</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>커버 글라스 24mmX50mm</td><td>Duran</td><td>B01_001650</td><td></td></tr><tr><td>SPI 육각형 TEM 그리드, 도금 니켈(50mesh)</td><td>SPI</td><td>275HGN-XA</td><td></td></tr><tr><td>SPI 육각 TEM 그리드, 도금 니켈(75mesh)</td><td>SPI</td><td>2775GN-XA</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 그리스</td><td>Shinetsu</td><td>HIVAC-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fixation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20ml 나사 상단 캡 바이알</td><td>Wheaton</td><td>WH.986580</td><td></td></tr><tr><td>2ml 스크류 탑캡 바이알</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>시그마</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>벤질 벤조에이</td>트 <td>시그마</td><td>B6630</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>Sgima</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 10% EM GRADE</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>잭슨</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>파라포람데히드</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>LPS 솔루션</td><td>CBP007B</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary 항체 (1:200)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세틸화 튜불린</td><td>시그마</td><td>클론 6-11B-1</td><td></td></tr><tr><td>Itln1</td><td>Proteintech</td><td>11770-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>케라틴</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank</td><td>1h5</td><td></td></tr><tr><td>ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS2-mem-GFP</td><td></td><td>랜스 데이비슨</td><td></td>박사의 선물</tr><tr><td>pCS2-ZO1-RFP</td><td></td><td>랜스 데이비슨</td><td></td> 박사의 선물</tr></tbody></table>

제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

점액 상피는 점액 생산 및 섬모 매개 클리어런스의 작용을 통해 이물질 입자를 제거하여 첫 번째 방어선을 제공합니다. 점액 상피의 많은 임상 관련 결함은 신체 내에서 깊은 곳에서 발생할 때 유추됩니다. 여기서, 우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 미세하게 분리된 다능성 선조에서 생성된 점액 상피에 대한 관성 3D 모델을 소개합니다. 점막 상피 오르가노이드는 깊은 자궁 세포에서 새로 생성된 상피로 덮여 있으며 나중에 24 시간 이내에 토착 표피와 구별 할 수없는 뚜렷한 패턴다분면 세포, 분비 세포 및 점액 생성 잔 세포로 장식됩니다. 구가노이드의 정면에서 나타나는 상피로 백월성에서 역학 세포 전환의 전체 순서는 고해상도 라이브 이미징에 의해 추적 될 수있다. 이러한 체외 배양, 자가 조직 점막 상피 오르가노이드는 세대의 고효율, 정의된 문화 조건, 수와 크기에 대한 제어 및 차별화된 상피의 재생 중에 라이브 이미징에 대한 직접적인 접근을 통해 점막 상피의 생물학을 연구하는 데 뚜렷한 이점을 제공합니다.

이러한 표준화된 프로토콜은 초기 가스룰라 단계 X. laevis 배아로부터 분리된 다전능한 선조로부터 점액 상피 오르간노이드를 생성한다. 깊은 이식 세포를 수집하여 비 접착제 PCR 튜브에서 골재를 형성하고 표면 상피화 및 잔류 세포 분화를 겪습니다. 골재의 새로 상피화된 표면은 내부 세포(예를 들어, 다촉진 및 기타 액세서리 세포)를 상호 재연하기 위해 생체내에서 발견되는 네이티브 상피와 유사한 기판을 제공하고 점도 상피 오르가노이드(도1A,B)를형성하기 위해 개발한다. 집계 후 24 시간 이내에 자체 조직 된 점액 상피 오르가노이드는 올챙이의 표피와 구별 할 수없는 성숙한 표피를 재생합니다. 오르가노이드는 완전히 분화된 상피(각질), 점액 분비 잔 세포(ITLN), 다촉진 세포(아세틸레이션 튜룰린), 및 작은 분비 세포(땅콩 agglutinin, PNA)(도 1C)를포함한다.
면역염색을 통해 상이한 세포 유형의 발달을 확인하는 것 외에도, 오르가노이드 발달의 역학은 라이브이미징(도 2A)에선행될 수 있다. 오르가노이드형성(그림 1B)의초기 단계에서 나타나는 상피화를 검사하기 위해, 형광태그가 부착된 단단한 접합 단백질(ZO-1-RFP) 및 멤-GFP(mem-GFP)를 발현함으로써 배아를 표지하였다. 이중 라벨링을 통해 ZO-1 양성 단단한 접합 형성의 순차적 단계는 상피화(도2)에서표시및 정량적으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 상피화의 상피(그림2B,녹색색)의 경우, 세포-세포 접착의 일부 영역은 ZO-1(도2B,녹색 화살표)의 말장난을 산란하였다. 대조적으로, 다른 영역은 완전히 조립, 인접한 ZO-1 표현식(그림 2B,노란색 화살표). 시간이 지남에 따라, 말장난은 결합하고 인접한 단단한 접합(도 2B,녹색 화살표)을 형성하기 위해 연결하고, 인접한 단단한 접합은 세포 분열(도 2B,노란색 화살표)에도 자신의 형태를 유지합니다. 단단한 접합이 성숙함에 따라 세포는 오르가노이드의 정표 평면을 따라 표면안팎으로 동적으로 움직입니다(도2C, D). 더욱이, 분화 유기성(도2B,색코딩된 세포)의 표면에 세포를 추적함으로써, 개별 말크타에서 부터 인접한 단단한 접합, 세포-세포 경계 및 오르가노이드 내의 세포 집단의 하위 집합에 이르기까지 다스케일 분석이 가능하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig01.jpg"> 그림 1: 점액 상피 오르가노이드의 생성. (A) X. laevis 배아로부터 깊은 자궁 내골 응집체를 조립하는 프로토콜을 보여주는 회로도. (B)다능성 심층 외형 세포로부터 유래되는 점막 상피 오르가노이드 형성의 모델을 위한 회로도(단면 보기). 표면 위치 세포는 상피 세포로 이동하고 잔 세포로 분화. 모분 세포를 분화, 분비 세포 및 이오노사이클은 표면에 복사하여 성숙한 표피를 재생합니다. (C)점액 상피의 최대 z 프로젝션ITLN (점액 생성 잔 세포), 아세틸레이션 튜불린 (섬광 세포), PNA (작은 분비 세포), 및 케라틴 (상피 세포)에 대한 면역 염료24 마카 (상부 패널) 및 올폴 에피더피 (하부 패널). 스케일 바 = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61604/61604fig02.jpg"> 그림 2: 오르가노이드 개발의 라이브 이미징. (A)살아있는 오르가노이드에 대한 이미징 챔버의 회로도 (규모는 아님). (B)2.5hpa로부터 ZO-1-RFP 및 mem-GFP를 발현하는 깊은 이포성 세포 응집체로부터 수집된 공초점 스택의 시간 경과 시퀀스. 스케일 바 = 20 μm. 세포는 시간이 지남에 따라 추적을위한 의사 색상입니다. 녹색 색 세포는 서로 다른 세포 접착 상태를 가지고 있으며, 하나는 점진적으로 ZO-1 양성 접착력 (녹색 화살표)을 개발하고 시간이 지남에 따라 인접한 ZO-1 양성 접착 (노란색 화살표)을 유지합니다. (C, D) ZO-1-RFP-발현 심층 외형 세포 응재의 시간 경과 공초점 이미지는 표면으로 이동하는 방사성 상호 연관 세포(C, 노란색 별)를 나타내고 골재(D, blue star)를 내부로 이동시키는 것을 보여준다. 스케일 바 = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61604/61604fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

점액 상피는 우리 몸의 내부 장기를 선적하고 이물질 입자를 제거하여 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 이 프로토콜은 24시간 안에 배아 세포 유래 점액 상피 오르간로이드를 생성할 수 있게 한다. 우리의 방법의 주요 장점은 우리가 오르가노이드의 표면에 세포 전환의 살아있는 진행을 모니터링 할 수 있다는 것입니다.개발 오르가노이드에 대한 이 재현 가능하고 확장 가능하며 신속한 프로토콜은 연구원이 점막 상피의 생물학에 대한 근본적인 질문을 해결할 수 있게 합니다. 시작하려면 자극된 여성 개구리로부터 계란을 수동으로 수집하고 체외 수정을 수행하여 X.Laevis 배아를 얻습니다. 2%시스테인에서 부드러운 동요를 가진 수정된 배아를 약 5분 동안 X 변형 바스의 식염수로 분해합니다.10단계의 첫 징후가 검출될 때까지 바람직한 온도에서 1/3 XMBS에서 배아를 배양하는 것은 식물의 전광도 주위의 어두운 색소 세포의 출현과 같은 이다. 입체로 모발 도구를 사용하여 10단계 초반에 도달할 때 배아를 선택하고 수집합니다. 선택한 배아를 일회용 이송 파이펫으로 DFA로 채워진 페트리 접시에 옮기다.그런 다음 배아의 동물 측면을 방해하지 않고 식물 측에서 날카로운 집게를 사용하여 배아의 진동 막을 제거하십시오. 동물 뚜껑을 분리하려면 배아의 동물 측면을 위로 배치합니다. 동물 뚜껑의 정도를 시각적으로 추정하고 헤어 나이프로 가장자리를 따라 첫 번째 절개를하고 칼을 바깥쪽으로 당겨 잘라냅니다.이 과정을 반복하여 작은 상처 체인을 만들어 동물 모자를 소비합니다. 메소더름 전구체가 포함되는 것을 방지하기 위해 헤어 나이프를 사용하여 동물 모자의 두꺼운 층 가장자리를 다듬습니다. 깊은 자궁 내세포세포를 동물 뚜껑에서 분리하려면 칼슘과 마그네슘이 없는 DFA로 채워진 페트리 접시에 일회용 이송 파이펫을 전달합니다.동물 모자를 동물의 측면을 위로 향하게 배치하여 다른 각기와 는 넉넉한 거리를 유지합니다. 5~10분 정도 기다린 다음 스테레오스코프 아래에서 이절을 모니터링합니다. 느슨한 깊은 세포가 어두운 색소 피상층의 가장자리에서 방출되면 밝은 색의 깊은 자궁 세포에서 피상적 층을 들어 올리기 시작합니다.가장자리에서 시작하여 피상적 층과 헤어 나이프를 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음 가능한 한 적은 칼슘과 마그네슘이없는 DFA로 깊은 자궁 세포를 수집하십시오. DFA의 200 마이크로리터를 포함하는 비 접착 PCR 튜브에 깊은 ectoderm 세포를 수집하고 부드럽게 전송 된 세포를 분산하기 위해 미디어를 2 ~ 3 번 피펫.튜브를 닫고 바닥에 자발적인 응집을 유도하기 위해 똑바로 유지하십시오. 스테레오 현미경에서 집계 프로세스를 모니터링합니다. 세포는 일반적으로 1시간 이내에 PCR 튜브의 바닥에 모여 크기에 따라 2~3시간 이내에 구형 골재로 조립합니다.점액 상피 오르가노이드의 발달 중에 라이브 이미징 또는 약물 검사를 수행하기 위해 확대 된 팁이 장착 된 200 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 집계 후 2 시간에서 집계를 수집합니다. 골재가 문화에서 점도 상피 오르가노이드로 발전할 수 있도록, PCR 튜브에서 5시간 후 집계하여 DFA가 채워진 페트리 요리로 옮깁니다. 응집체를 서로 멀리 떨어져 배치하여 융합을 방지합니다.상온에서 배양후 24시간 이내에, 추가된 요인 없이, 성숙한 점액 상피 오르가노이드는 분화된 상피의 표면을 덮는 구타 섬모로 인해 회전하는 것을 관찰할 수 있다. 커버 글래스를 실리콘 그리스로 사용자 지정 밀링 아크릴 챔버에 접착하여 배양 매체의 누출을 방지하기 위해 챔버를 단단히 밀봉한 다음 이미징 챔버를 DFA로 채우는 유리 바닥 이미징 챔버를 준비합니다. 집게를 사용하여 육각형 투과 전자 현미경 또는 TEM 그리드를 선택하고 그리드의 가장자리에 소량의 그리스를 적용합니다.가볍게 눌러 이미징 챔버의 바닥에 TEM 그리드를 고정합니다. 응집체를 이미징 챔버로 옮기고 그리드 내에 배치합니다. 챔버를 DFA로 채우고 커버 유리와 그리스로 밀봉하십시오.점액 상피 오르가노이드 형성의 진행을 따르기 위해, 공초점 현미경을 사용하여 골재의 시간 경과 z 스택 이미지를 수집합니다. 점동 상피 오르가노이드는 초기 가스trula 단계 X.Laevis 배아의 다능한 선조에서 생성되었다. 오르가노이드는 완전히 분화 된 상피, 잔세포를 분비하는 점액, 다분면 세포 및 작은 분비 세포를 포함하여 올챙이의 표피와 구별 할 수없는 성숙한 표피를 가지고 있습니다.오르가노이드 발달의 역학은 살아있는 화상 진찰에 선행되었습니다. 오르가노이드 형성의 초기 단계에서 나타나는 상피화를 검사하기 위해 배아는 형광표가 단단한 접합 단백질과 막을 현지화하는 단백질로 표지되었습니다. ZO-1 양성 단단한 접합 형성의 순차적 단계를 이중 라벨을 사용하면 상피화 중에 정량적으로 표시및 정량적으로 분석할 수 있다.세포 세포 접착의 몇몇 지구는 상피화의 다른 단계에서 ZO-1의 말벌을 흩어. 반면, 다른 영역은 인접한 ZO-1 표현을 완전히 조립했습니다. 시간이 지남에 따라 말장난은 결합하고 세포 분열 중에도 자신의 형태를 유지하는 연속 꽉 접합을 형성하기 위해 연결합니다.단단한 접합이 성숙함에 따라 세포는 오르가노이드의 정표 평면을 따라 표면안팎으로 동적으로 움직입니다. 다중 스케일 분석은 분화 유기체의 표면에 세포를 현시적으로 추적하여 가능하다. 이 프로토콜을 시도할 때, 분리된 동물 모자의 어두운 색소가 있는 면을 올려놓고 입체 범위 하에서 모니터링해야 합니다.칼슘/마그네슘 무료 DFA 미디어에서 적절한 타이밍에 동물 모자의 피상층을 분리하는 것이 중요합니다. 이 간단한 프로토콜은 점액 상피조절분자 및 물리적 메커니즘뿐만 아니라 동적 세포 행동을 연구하는 편리한 방법을 제공합니다.

mucociliary-epithelial-organoids-from-xenopus-embryonic-cells

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

장기의 전체 3D 구조 및 세포 함량뿐만 아니라 원래 조직과 의학적 유사성은 여기에 설명된 단세포 분해능 3D 이미징 프로토콜을 사용하여 포획될 수 있다. 이 프로토콜은 원기, 크기 및 모양이 다양한 광범위한 오르가노이드에 적용할 수 있습니다.

단세포 분해능 3차원 알래기 알코노이드

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

인간 유도 만능 줄기 세포 분화 프로토콜의 최근 발전은 기관 특이적 세포 유형의 단계적 유도를 허용한다. 여기에서, 우리는 iPSC 유래 기도 기저 세포의 유지 및 확장과 공기-액체 계면 배양물에서 점막 상피로의 분화를 위한 상세한 단계를 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포로부터의 기도 상피 세포 공기-액체 계면 배양물의 생성

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

우리는 두 가지 리포터 전략에 적용된 공초점 영상 및 추적 파이프라인을 설명합니다: 개별 세포 행동을 해석하는 모자이크 오가노이드와 인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 세포 유형 전이를 모니터링하는 FATE 리포터 오가노이드입니다.

인간 및 쥐 장내 오가노이드에서 클론 역학과 운명 전이를 모니터링하기 위한 생세포 영상 및 단세포 추적

Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

이 프로토콜은 건강, undifferentiated 인간의 배아 줄기 (ES) 세포를 유지하는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포의 문화 및 유지 관리

배우세요 Xenopus laevis 배아에서 점동 상피 오르가노이드를 생성하고 고해상도 라이브 이미징으로 세포 전이를 실시간 관찰하는 방법을. 이 프로토콜은 상피 발달 연구에 활용됩니다.

제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징

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