Name: Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 배우세요 생쥐 복부 내 지방 조직에서 지방형성 및 섬유염증성 기질 세포 하위집단을 FACS 또는 면역자기 비드 분리법으로 분리하는 방법을. 이 기술은 대사 질환 연구에 활용됩니다.

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저자들은 탁월한 기술적 도움을 준 Lisa Hansen과 Kirsten Vestergaard, 그리고 원고를 비판적으로 읽어준 P. Scherer, N. Joffin, C. Crewe에게 감사를 표한다. 저자들은 여기에 설명된 프로토콜 개발에 탁월한 지침과 도움을 준 UTSW 유세포분석 코어에 감사를 표합니다. R.K.G.는 NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 및 NIDDK R01 DK119163에 의해 지원됩니다. JP는 Innovation Fund Denmark의 박사 전 상을 후원합니다.

모든 동물 프로토콜 및 절차는 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터 기관 동물 사용 및 관리 위원회(University of Texas Southwestern Medical Center Institutional Animal Use and Care Committee)의 승인을 받았습니다.
1. 생식선 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획 (SVF)의 분리
<ol><li>6-8주 된 쥐의 생식선 백색 지방 조직을 절개하고 지방 패드를 1x PBS 용액에 넣습니다.</li>
	<li>최대 4개의 지방 저장소(1-2마리의 마우스에서 2-4개 저장소 권장)를 결합하고 200μL의 분해 완충액(1x HBSS, 1.5% BSA 및 1mg/mL 콜라겐분해효소 D)이 들어 있는 10mL 비커에 조직을 다집니다.</li>
	<li>다진 조직을 10mL 분해 완충액이 들어 있는 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>혼합물을 37°C의 수조에서 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>100μm 세포 여과기를 통해 소화된 조직을 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다.</li>
	<li>여과된 샘플을 2% FBS가 포함된 PBS를 사용하여 30mL로 희석하고 4°C에서 5분 동안 600 x g 으로 원심분리합니다. 성숙한 지방 세포를 포함하는 상층액을 흡인합니다.</li>
	<li>선호하는 세포 분리 방법으로 즉시 진행합니다.</li>
</ol>2. FACS를 사용한 APC 및 FIP 격리
<ol><li>튜브를 부드럽게 흔들어 펠릿을 1x RBC 용해 완충액 1mL에 녹입니다.</li>
	<li>실온에서 1-2분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2% FBS/PBS 10mL를 넣고 40μm 세포 여과기를 통해 깨끗한 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>매체를 흡입하고 Fc 블록을 포함하는 2% FBS/PBS 400-800 μL에 펠릿을 재현탁시킵니다(1:200).</li>
	<li>4 °C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>mL당 ≤10-6개의 세포를 포함하는 400 μL-800 μL의 세포 현탁액을 1.5 mL 튜브에 옮기고 항체를 추가합니다. 항체 농도는 Table of Materials(재료 표 ) 섹션에 나열되어 있습니다.<ol><li>1) 염색되지 않은 세포, 2) 단색 대조군 및 3) FMO(형광 마이너스 1) 대조군을 위한 별도의 대조 튜브를 준비합니다.</li>
		<li>PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C 항체로 샘플을 염색합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4 °C에서 15분 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>400μL의 2% FBS/PBS에서 배지를 흡인하고 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>배지를 흡인하고 400-800 μL의 2% FBS/PBS에서 세포를 재현탁시킵니다. 그런 다음 40μm 필터 캡을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 통과시켜 FACS를 만듭니다.</li>
	<li>게이팅을 위해 다음 단계를 따르십시오.<ol><li>보정을 위해 염색되지 않은 단색 컨트롤을 사용하십시오.</li>
		<li>FMO 컨트롤을 사용하여 실험 게이트를 설정합니다.</li>
		<li>그림 1에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 APC 및 FIP를 얻을 수 있습니다. 게이트 APC는 CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- 및 FIP는 CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ 세포로 게이트합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>500μL의 100% 혈청이 들어 있는 튜브에서 분류된 세포를 수집하고 세포를 얼음 위에 유지합니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 셀을 원심 분리합니다. 2% FBS/PBS를 추가하여 4°C에서 5분 동안 600 x g 에서 다시 원심분리하여 세포를 세척합니다. 상층액을 버리고 펠릿 세포를 사용하십시오.</li>
	<li>펠릿화된 세포를 적절한 부피의 생식선 APC 배양 배지(세포 배양용) 또는 후속 분석을 위한 적절한 완충액에 재현탁시킵니다.</li>
</ol>3. adipogenic 및 non-adipogenic fractions의 면역자기 분리
<ol><li>1.1-1.7 단계에 따라 생식선 백색 지방 조직에서 SVF를 분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡입하고 SVF 펠릿을 10mL의 시판되는 1x MS 버퍼에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>40μm 셀 스트레이너를 통해 셀 현탁액을 여과합니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 펠릿 세포를 100μL의 1x MS 완충액에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>아래 설명된 대로 CD31+ 및 CD45+ 세포 고갈을 수행합니다(그림 2A, 1단계). 이것은 내피 및 조혈 계통 세포를 제거하기 위해 수행됩니다.<ol><li>세포 카운터를 사용하여 세포 수를 세고 농도를 ≤ 1 x 108 cells/mL로 조정합니다.</li>
		<li>비오틴 접합 CD31 및 CD45 항체를 106 세포 당 ≤ 0.25 μg의 농도로 세포 현탁액에 추가하고 15분 동안 얼음에서 배양합니다.</li>
		<li>4mL의 1x MS 버퍼를 첨가하여 세포를 세척합니다.</li>
		<li>600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 흡입하고 100μL의 1x MS 완충액으로 펠릿을 재현탁시킵니다.</li>
		<li>10μL의 스트렙타비딘 나노비드를 넣고 15분 동안 얼음 위에서 세포를 배양합니다.</li>
		<li>4mL의 1x MS 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다.</li>
		<li>600 x g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리 한 다음 상층액을 흡입합니다.</li>
		<li>2.5mL의 1x MS 완충액에 세포를 재현탁하고 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.</li>
		<li>튜브를 자석 랙에 5분 동안 놓습니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 깨끗한 15mL 원심분리 튜브에 주입하여 라벨이 없는 세포를 수집합니다. 알림: 원치 않는 세포 분획으로 인한 오염으로 이어질 수 있으므로 매달려 있는 방울을 흔들거나 잘라내지 마십시오.</li>
		<li>자석에서 튜브를 제거하고 3.6.9단계를 반복합니다. 을 3.6.11로 변경합니다. 두 번 더 세탁하면 총 3회 세탁할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>adipogenic 및 non-adipogenic fraction의 분리(그림 2A, 2단계)<ol><li>라벨링되지 않은 분획(즉, CD45-CD31-분획)으로 작업을 계속합니다.</li>
		<li>라벨링되지 않은 세포가 들어 있는 15mL 튜브를 600 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
		<li>상층액을 흡인하고 펠릿을 100μL의 1x MS 완충액에 재현탁시킵니다.</li>
		<li>비오틴 접합 LY6C 및 CD9 항체를 각각 106 세포 당 ≤ 0.25 μg의 농도로 첨가하고 얼음에서 15 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>3.6.3단계를 수행합니다. 을 3.6.12로 변경합니다. 두 번째 분리를 완료합니다.</li>
		<li>결합되지 않은 분수를 수집합니다. 표지되지 않은 세포(LY6C- CD9-)는 APC를 포함하는 지방 분획을 나타냅니다(그림 2A, 단계 3).</li>
		<li>자석에서 튜브를 제거하고 1x MS 버퍼에서 결합된 셀을 재현탁 및 용리합니다. 용리액 또는 표지된 분획(LY6C+ CD9+)은 FIP를 포함하는 비지방성 분획을 나타냅니다(그림 2A, 3단계).</li>
		<li>600 x g 에서 5분 동안 라벨링 및 라벨링되지 않은 분획을 원심분리하여 4°C에서 펠릿 셀로 이동합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>즉시 세포 배양을 진행하거나(6단계) 선호하는 분석을 위해 미분화 전구체를 사용합니다(4단계 및/또는 5단계).</li>
</ol>4. 유세포 분석을 통한 지방형성 및 비지방성 분획의 순도 평가
<ol><li>Fc 블록을 포함하는 2% FBS/PBS의 200-400 μL에 비드 분리 세포 분획을 재현탁시킵니다(1:200).</li>
	<li>4 °C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮기고 항체를 추가합니다. 항체 농도는 재료 표에 나와 있습니다.<ol><li>1) 염색되지 않은 세포, 2) 단색 대조군 및 3) FMO 대조군을 위한 별도의 대조 튜브를 준비합니다.</li>
		<li>샘플에 CD45, CD31, CD9 및 LY6C 항체를 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>4 °C에서 15분 동안 빛으로부터 보호하여 배양합니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 400μL의 2% FBS/PBS에서 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>600 x g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 현탁액을 원심 분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 400-800 μL의 2% FBS/PBS에서 세포를 재현탁시킵니다. 유세포 분석을 위해 40μm 필터 캡을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 여과합니다.</li>
	<li>순도를 평가하기 위한 유세포 분석<ol><li>보정을 위해 염색되지 않은 단색 컨트롤을 사용하십시오.</li>
		<li>FMO 컨트롤을 사용하여 실험 게이트를 설정합니다.</li>
		<li>그림 2B와 같이 라이브 셀과 단일 셀에 대해 gating 전략을 사용합니다.</li>
		<li>CD45, CD31, LY6C 및 CD9에 대해 그림 2B 와 같이 게이팅을 수행합니다.</li>
		<li>유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분리 분획 내에서 CD45-CD31-LY6C-CD9- 세포(APC) 및 CD45-CD31-LY6C+ 세포(FIP)의 빈도를 평가할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. FIP 및 APC의 순도를 평가하기 위해 정량적 PCR을 사용한 유전자 발현 분석
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 추출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 자기 또는 FACS 분리 세포에서 mRNA를 추출합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 cDNA 역전사 효소 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 1μg의 RNA를 사용하여 cDNA를 합성합니다.</li>
	<li>SYBR green PCR master mix를 사용하여 정량적 PCR로 APC 및 FIPs 선택적 유전자(표 1)의 상대적 mRNA 수준을 측정합니다.<ol><li>2x SYBR 녹색 염료 5μL, cDNA 1μL(~50ng/μL), 각 정방향 및 역방향 프라이머 0.5μL(10μM) 및 물 3μL와 같이 PCR에 대한 샘플 반응을 설정합니다.</li>
		<li>정량적 PCR 실행을 위해 다음 표준 PCR 조건을 사용하십시오: 홀드 스테이지: 2분 동안 50°C, 10분 동안 95°C; PCR 스테이지(40 사이클): 95°C에서 15초, 60°C에서 1분</li>
	</ol></li>
	<li>ΔΔ-Ct를 계산하여 가사 유전자(Rps18) 수준으로 값을 정규화합니다.</li>
	<li>통계적 유의성을 평가하려면 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 수행합니다.</li>
</ol>6. 세포 배양 및 분화
<ol><li>4 °C에서 5분 동안 600 x g 에서 자기 또는 FACS 절연 셀을 원심분리합니다.</li>
	<li>500 μL의 생식선 APC 배양 배지에 펠릿을 재현탁시키고 48웰 배양 플레이트의 각 분획에서 40K 세포/웰을 플레이트합니다.</li>
	<li>1-2일마다 미디어를 교체하십시오. APC는 합류점에 접근함에 따라 지방세포로 분화하기 시작합니다. 동일한 매체에서 유지되는 FIP는 지방 형성을 겪지 않습니다.</li>
</ol>

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</ol>

T.A.P.는 Novo Nordisk A/S의 직원이자 주주입니다.

마우스의 C57BL/6 균주는 다이어트로 인한 비만 연구에서 가장 많이 사용되는 마우스 균주입니다. C57BL/6 마우스는 고지방 식단(HFD)을 섭취할 때 체중이 급격히 증가하고 비만과 관련된 대사 증후군의 두드러진 특징(예: 인슐린 저항성 및 고지혈증)이 발생합니다. 특히, 고지방 식단(HFD) 급여와 관련하여 발생하는 WAT 확장은 창고 특이적 방식으로 발생한다 19,20,21,22,23. 피하 서혜부 WAT 저장소(iWAT)의 확장은 거의 전적으로 지방 세포 비대를 통해 발생하는 반면, 생식선 WAT(gWAT)의 확장은 지방 세포 비대와 증식을 통해 발생합니다. 비만 쥐의 gWAT 저장소는 대사 염증의 주요 부위이기도 합니다. 따라서...

백색 지방 조직(WAT)은 포유류의 에너지 저장을 위한 주요 위치를 나타냅니다. 이 조직 내에서 지방 세포 또는 "지방 세포"는 트리글리세라이드 형태로 과도한 칼로리를 저장하며, 이는 큰 단안 지질 방울로 포장됩니다. 또한, 지방세포는 에너지 항상성의 다양한 측면을 조절하는 다양한 인자를 분비합니다 1,2,3. 지방세포는 WAT 부피의 대부분을 구성합니다. 그러나 지방세포는 WAT 4,5에서 발견되는 전체 세포의 50% 미만만 차지합니다. WAT의 비지방세포 구획 또는 기질-혈관 분획(SVF)은 매우 이질적이며 혈관 내피 세포, 조직 거주 면역 세포, 섬유아세포 및 지방세포 전구세포(APC) 집단을 포함합니다.
WAT는 에너지 저장에 대한 수요가 증가함에 따라 규모를 확장할 수 있는 놀라운 능력이 탁월합니다. WAT에 지질을 적절하게 저장하면 비지방 조직으로의 유해한 이소성 지질 침착을 방지할 수 있으므로 이러한 조직 가소성을 유지하는 것이 필수적이다6. 개별 WAT 저장소가 과잉 칼로리에 대응하여 이러한 팽창을 겪는 방식은 비만 환경에서 인슐린 감수성을 결정하는 중요한 요인이다7. 대사 증후군이 있는 비만 개체에서 관찰되는 병리학적 WAT 확장은 대사적으로 유리한 피하 지방 조직을 희생하면서 내장 WAT 저장소의 우선적인 확장을 특징으로 합니다. 또한, 비만에서 인슐린 저항성은 WAT의 병리학적 리모델링과 관련이 있습니다. 이것은 기존 지방 세포의 비대 성장(크기 증가), 부적절한 혈관 신생, 만성 대사 염증, 세포 외 기질 구성 요소의 축적(섬유증) 및 조직 저산소증을 특징으로 합니다 8,9. 이러한 비만의 WAT 표현형은 지방이영양증(기능적 WAT의 부재) 상태에서 관찰되는 것과 유사하게 간 지방증 및 인슐린 저항성과 관련이 있습니다. 대조적으로, 건강한 WAT 확장은 대사적으로 건강한 비만 인구에서 관찰되며, 지방세포 증식을 통한 보호적인 피하 WAT의 우선적 확장 및 저장소 확장이 특징이다10. 새로운 지방세포의 모집은 지방세포 전구세포(APC)에서 새로운 지방세포 분화(de novo adipocyte differentiation)에 의해 매개됩니다("지방형성"이라고 함). 지방세포 증식은 WAT 섬유증 및 대사 염증의 정도가 상대적으로 낮은 것과 일치합니다 6,11. WAT 미세환경 내의 다양한 세포 유형은 비만에서 WAT의 건강과 확장성에 직접적인 영향을 미친다12. 따라서 WAT에 존재하는 다양한 세포 유형의 기능을 정의하는 것은 이 분야의 높은 우선 순위로 남아 있습니다.
지난 10년 동안 인간 및 마우스 WAT SVF13에서 네이티브 APC를 정의하고 격리하기 위해 몇 가지 전략이 채택되었습니다. 이러한 전략은 항체 기반 세포 분리 기술을 사용하여 일반적인 중간엽 줄기/전구 세포 마커의 세포 표면 발현을 기반으로 APC를 분리합니다. 이러한 접근법에는 형광 활성화 세포 분류(FACS), 형광단 표지 항체 사용 또는 면역자기 비드 분리(즉, 화학적으로 변형된 항체)가 포함됩니다. APC의 분리를 대상으로 하는 세포 표면 단백질에는 PDGFRα, PDGFRβ, CD34 및 SCA-1이 포함됩니다. 이러한 접근 방식은 APC를 강화하는 데 도움이 되었습니다. 그러나 이러한 마커를 기반으로 분리된 세포 집단은 매우 이질적입니다. 매우 최근의 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 연구는 murine WAT 14,15,16,17의 분리된 기질-혈관 분획(SVF) 내에서 기질 세포의 분자 및 기능적 이질성을 강조했습니다. 자체 scRNA-seq 및 기능 분석을 통해 성체 마우스의 복강 내 WAT의 기질 구획에서 기능적으로 구별되는 면역 조절 및 지방형성 PDGFRβ+ 혈관 주위 세포 하위 집단을 식별하고 특성화했습니다15. 섬유-염증 전구체(Fibro-inflammatory precursors, FIPs)는 PDGFRβ+ 세포의 두드러진 부분집단을 나타내며 LY6C 발현(LY6C+ PDGFRβ+ 세포)을 기반으로 분리할 수 있습니다15. FIP는 지방형성 능력이 부족하고, 다양한 자극에 대해 강력한 전염증 반응을 일으키며, 콜라겐을 생성하고, 항지방형성 인자를 분비한다15. 이러한 세포의 전염증성 및 섬유화 활성은 생쥐의 비만과 관련하여 증가하며, 이는 이러한 세포가 WAT 리모델링의 조절자로 연루됩니다. LY6C- CD9- PDGFRβ+ 부분집단은 지방세포 전구세포(APC)를 나타냅니다. 이러한 APC는 Pparg 및 기타 지방유발 유전자의 발현이 풍부하며, in vitro 및 in vivo15에서 성숙한 지방세포로 쉽게 분화할 수 있다. 여기에서는 FACS를 사용하여 성체 마우스의 복강 내 WAT 저장소에서 이러한 별개의 세포 집단을 분리하고 비오틴화 항체를 사용한 면역자성 비드 분리를 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 성체 남성 및 여성 마우스의 여러 복강 내 WAT 저장소에서 기능적으로 구별되는 지방 전구 세포 하위 집단을 분리하는 데 사용할 수 있습니다15. 이러한 기능적으로 구별되는 세포 집단을 고립된 상태에서 연구하는 것은 건강과 질병에서 지방 형성 및 복강 내 지방 조직 리모델링을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 현재의 이해에 크게 기여할 수 있습니다.
아래 프로토콜은 쥐 부고환 WAT에서 지방 전구 세포의 분리에 대해 자세히 설명합니다. 그러나, 동일한 절차를 사용하여 수컷 및 암컷 마우스 모두의 장간막 및 후복막 WAT 저장소로부터 해당 세포를 분리할 수 있다15. 마우스에서 이러한 저장소를 식별하고 격리하는 방법에 대한 자세한 프로토콜은 Bagchi et al.18에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 생후 6-8주 된 마우스의 사용에 최적화되었습니다. APC의 빈도 및 분화 능력은 노화와 관련하여 감소할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Mechanical Tissue Preparation 및 SVF Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 및 100 &micro; m 세포 스트레이너</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340/352360</td><td></td></tr><tr><td>1X 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>5ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352053</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digestion Buffer(10mL용)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>10 mg 콜라겐 분해 효소 D (1 mg/ml 최종 참조)</td><td>로슈</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>0.15g BSA (1.5 % 최종 cc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><강력한>APC와 비APC의 면역자기 분리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td><td>BioLegend</td><td>480017</td><td></td></tr><tr><td>5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)</td><td>BioLegend</td><td>480019</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L MojoSort 스트렙타비딘 나노비즈</td><td>BioLegend</td><td>480015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>순도 검사 및 FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 적혈구 용해 버퍼</td><td>eBioscience</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Fc block (Mouse CD16/CD32)</td><td>eBioscience</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>비오틴 CD45</td><td>BioLegend</td><td>103103</td><td>농도: &le; 0.25 & 마이크로; g 당 10 ^ 6 세포 종 : 마우스 < / > 클론 : 30-F11</td></tr><tr><td>비오틴 CD31</td><td>BioLegend</td><td>102503</td><td>농도 : &le; 0.25 &마이크로; g 10 ^ 6 세포 당 종 : 마우스 < / > 클론 : MEC13.3</td></tr><tr><td>비오틴 CD9</td><td>BioLegend</td><td>124803</td><td>농도 : &le; 0.25 &micro; g 10 ^ 6 세포 당 종 : 마우스 < / > 클론 : MZ3</td></tr><tr><td>비오틴 LY6C</td><td>BioLegend</td><td></td><td>128003 농도 : &le; 0.25 &micro; g per 10^6 cells 종(種): Mouse 클론: HK1.4</td></tr><tr><td>CD31-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>102419</td><td>농도: 희석 1:400 종(種): Mouse 클론: 390</td></tr><tr><td>CD45-PerCP/Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>103131</td><td>농도: 희석 1:400 종(種): Mouse 클론: 30-F11</td></tr><tr><td>CD140b PDGFR&beta;-PE</td><td>BioLegend</td><td>136006</td><td>농도 : 희석 1 : 50 종 : mouse 클론 : APB5</td></tr><tr><td>LY6C-APC</td><td>BioLegend</td><td>128016</td><td>농도 : 희석 1 : 400 종 : Mouse 클론 : HK1.4</td></tr><tr><td>CD9-FITC</td><td>BioLegend</td><td>124808</td><td>농도 : 희석 1 : 400 종 : Mouse 클론 : MZ3</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture and 분화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gonadal APC 배양 배지(500mL용)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>288 mL DMEM with 1 g/L glucose</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>192 mL MCDB201</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 소 태아 혈청(FBS)** lot#14E024</td><td>Sigma</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 100% ITS 프리믹스</td><td>BD Bioscience</td><td>354352</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 10 mM L-아스코르브산-2-2인산염</td><td>시그마</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>50 &마이크로; L 100 g/ml FGF 기본적인</td><td>R& D 시스템</td><td>3139-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 펜/스트렙</td><td>코닝</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>500 &마이크로; L Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>**참고: 1차 APC의 지방 생성 용량은 상업용 FBS의 로트마다 다를 수 있습니다. FBS의 여러 로트/소스를 테스트해야 합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

백색 지방 조직(WAT)의 기질-혈관 분획(SVF)은 매우 이질적이며 성인기에 WAT의 확장 및 리모델링에 기능적으로 기여하는 수많은 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 세포 이질성의 의미를 연구하는 데 있어 엄청난 장벽은 in vitro 및 in vivo 분석을 위해 기능적으로 구별되는 cell subpopulation을 WAT SVF에서 즉시 분리할 수 없다는 것입니다. 단세포 염기서열 분석 기술은 최근 성체 마우스의 복강 내 WAT 저장소에서 기능적으로 뚜렷한 섬유-염증성 및 지방형성 PDGFRβ+ 혈관 주위 세포 하위 집단을 식별했습니다. 섬유-염증성 전구세포('FIP'라고 함)는 전염증성 표현형을 발휘할 수 있는 비지방성 콜라겐 생성 세포입니다. PDGFRβ+ 지방세포 전구세포(APC)는 세포 이식 시 in vitro 및 in vivo 모두에서 지방성이 높습니다. 여기에서는 쥐 복강 내 WAT 저장소에서 이러한 기질 세포 하위 집단을 분리하는 여러 방법을 설명합니다. FIP 및 APC는 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting) 또는 비오틴화 항체 기반 면역자기 비드 기술을 활용하여 분리할 수 있습니다. 분리된 세포는 분자 및 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 기질 세포 하위 집단의 기능적 특성을 개별적으로 연구하면 세포 수준의 생리학적 또는 병리학적 조건에서 지방 조직 리모델링에 대한 현재 지식이 확장될 것입니다.

이 프로토콜은 성체 마우스의 복강 내 WAT 저장소에서 뚜렷한 기질 세포 집단을 분리할 수 있는 두 가지 전략을 설명합니다. APC 및 FIP는 FACS(그림 1) 또는 비오틴화 항체를 사용한 면역자성 비드 분리(그림 2)로 분리할 수 있습니다. 두 접근법 모두 상업적으로 이용 가능한 시약과 항체를 사용합니다. 면역자성 비드 분리는 gWAT SVF에서 지방형성 세포와 비지방성 세포를 분리합니다. 유세포 분석 결과 지방 분획 내 세포의 75%가 LY6C-CD9-APC를 나타내는 것으로 나타났습니다. &gt;지방생성되지 않은 분획의 75%는 FIP(LY6C+ 세포)를 나타냈습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/fil...

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

이 프로토콜을 통해 연구자는 관심 있는 마우스 모델에서 성선 주위 백색 지방 조직 기질 세포의 기능적 및 분자적으로 구별되는 하위 집단을 분리할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 모든 도구와 시약을 널리 사용할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Rana Gupta 박사 실험실의 선임 실험실 연구 분석가인 Lavanya Vishvanath입니다.생식선 백색 지방 조직(WAT)에서 기질 혈관 세포를 분리한 후, 세포 펠릿을 1ml의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시켜 실온에서 1-2분 동안 배양합니다. 10mL의 2%FBS 및 PBS로 용해를 중지하고 40미크론 세포 여과기를 통해 세포를 새로운 50mL 원심분리 튜브로 여과합니다. 원심분리에 의하여 세포를 모으고 FC 구획으로 보충된 400에서 800 마이크로리터 FBS 및 PBS에 있는 펠릿을 refuse.섭씨 4도에서 10분 배양 후 400-800마이크로리터의 세포를 형광 접합 항체 염색을 위한 적절한 수의 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 15분 동안 관심 있는 대조군 및 실험 항체로 세포를 라벨링합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 펠렛화하고 튜브당 400마이크로리터의 신선한 FBS 및 PBS로 세포를 세척합니다. 세척 후 튜브당 400-800마이크로리터의 신선한 FBS 및 PBS에 펠릿을 재현탁시키고 40미크론 필터 캡을 통해 세포를 FACS용 5밀리리터 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 여과합니다.항원제시세포(antigen-presenting cell)와 섬유염증성 전구세포(fibroinflammatory progenitor)를 얻기 위해 보상(compensates) 및 실험 게이트(experimental gate)를 설정합니다. 세포 분류 후, 원심분리로 세포를 수집 및 세척하고, 분획당 500마이크로리터의 생식선 항원 제시 세포 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 지방형성 및 비지방형성 세포 분획의 면역자기 비드 분리를 위해 기질 혈관 펠릿을 10ml의 MS 완충액에 재현탁하고 40미크론 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다.계수 후, 원심분리로 세포를 수집하고 MS 완충액 농도 밀리리터당 8번째 세포에서 10배 이하로 세포를 재현탁합니다. 다음으로, 6개의 세포에 1 곱하기 10당 0.25g 이하의 항-CD31 및 항-CD45 비오틴 접합 항체를 얼음에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 4ml의 MS 완충액으로 세포를 세척하고 펠릿을 100마이크로리터의 새로운 MS 완충액에 재현탁합니다.10마이크로리터의 스트렙타비딘 나노비드를 세포에 첨가하여 얼음에서 15분 동안 배양한 다음 4ml의 MS 완충액에서 다시 세척합니다. 펠릿을 2.5ml의 새 MS 완충액에 재현탁시키고 세포를 5ml 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자석에 5분 동안 올려놓은 후 표지되지 않은 세포를 새로운 15ml 원심분리 튜브에 넣습니다.시연된 대로 세척을 두 번 더 반복하고, 세척할 때마다 표지되지 않은 세포를 당겨 원심분리를 통해 내피 및 조혈 계통이 고갈된 세포를 수집합니다. 펠릿을 100마이크로리터 MS 완충액에 재현탁시키고 얼음 위에서 15분 동안 6번째 세포 10개 1개당 0.25마이크로그램 이하의 Ly6C 및 CD-9 항체로 세포에 라벨을 붙입니다. 배양이 끝나면 Ly6C 양성 비지방형성 세포를 수집하기 전에 방금 설명한 대로 결합되지 않은 Ly6C 음성 CD-9 음성 지방형성 세포를 수집합니다.그런 다음 원심분리를 통해 두 세포 집단을 모두 수집하고 분획당 500마이크로리터의 생식선 항원 제시 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 분화를 위한 세포 배양을 설정하려면 48웰 배양 플레이트의 개별 웰에 농도가 있는 웰당 네 번째 세포의 4배에 각 분획을 플레이트화하고 7-10일 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 지방세포 전구세포는 합류점에 가까워짐에 따라 지방세포로 분화를 시작하고, 피브로인 염증성 전구세포는 지방형성에 저항합니다.이 프로토콜을 사용하면 입증된 바와 같이 FACS 또는 면역자기 비드 분리에 의해 성인 마우스의 복강 내 WAT 저장소에서 뚜렷한 기질 세포 집단을 분리할 수 있습니다. 면역자기 비드 분리를 통해 생식선 WAT 기질 혈관 분획에서 지방형성 및 비지방형성 세포를 분리할 수 있습니다. 유세포 분석으로 관찰된 바와 같이, 지방형성 분획 내 세포의 75%는 Ly6C 음성 CD-9 음성 지방세포 전구세포인 반면, 비지방형성 분획의 75% 이상은 Ly6C 양성 섬유염증전구세포입니다.두 방법 중 하나를 분리한 지방세포 전구세포는 도금 후 7일에서 10일 이내에 고순도의 지질 함유 지방세포로 분화됩니다. 대조적으로, non addipogenic precursor는 섬유아세포와 유사하게 유지되며 동일한 배양 조건에서 adipocyte가 되지 않습니다. 이 프로토콜은 성선 주위 백색 지방 조직에서 지방 형성 및 섬유염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 데 효과적입니다.유사한 세포 집단은 마우스의 다른 지방 저장소에서 발견될 수 있습니다. 그러나 그들의 선택은 다른 항체의 사용에 달려 있습니다. FACS 및 자기 분리를 통해 분리된 세포 집단은 세포 분화의 시험관 내 분석에 사용하거나 유전자 발현 분석을 통해 추가로 특성화할 수 있습니다.

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 유전자 발현 및 콜라겐 분해 활성을 평가하기 위해 쥐 서혜부(피하) 및 성선주위(내장) 지방 조직 저장소에서 기질 혈관 분획(SVF)을 분리하는 데 필요한 기술을 제시합니다. 이 방법에는 면역자기 세포 분리를 사용하여 Sca1고지방 유래 줄기세포(ASC)를 농축하는 것이 포함됩니다.

지방 창고 별 SCA1의 면역 자기 분리<sup&gt; 높은</sup&gt; 지방이 유래 줄기 세포 (의 ASC)

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 프로토콜은 유세포 분석을 위한 여러 막 결합 마커의 염색을 통해 지방 세포에서 고품질 RNA를 얻는 방법론과 SVF-대식세포의 표현형을 포함하여 단일 공정에서 인간 내장 지방에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획-SVF 세포를 분리하기 위한 효율적인 콜라겐분해효소 분해 방법을 제공합니다.

RNA 분석 및 대식세포 표현형에 적합한 인간 내장 지방 조직에서 생존 가능한 지방 세포 및 기질 혈관 분획 분리

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

여기서는 처리 시간이 &gt;90% 감소하고, 세포 생존율이 높으며, 광범위한 호환성을 특징으로 지방유래 줄기세포와 지방세포를 효율적으로 분리하는 표준 방법을 제시합니다.

돼지 지방 조직에서 지방 유래 줄기세포와 지방세포의 효율적인 분리

배우세요 생쥐 복부 내 지방 조직에서 지방형성 및 섬유염증성 기질 세포 하위집단을 FACS 또는 면역자기 비드 분리법으로 분리하는 방법을. 이 기술은 대사 질환 연구에 활용됩니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

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