대규모 후생유전학 연구를 위한 반자동 ChIP-Seq 절차

이 프로토콜은 1차 시료에 대한 고처리량 ChIP-Seq 분석을 통해 시스 조절 메커니즘과 질병에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있다는 점에서 중요합니다. 이 방법의 주요 장점은 데이터의 재현성과 실습 시간의 급격한 단축입니다. 염색질 전단의 경우, 70마이크로리터의 신선한 실온 완전 용해 완충액을 글리신 고정, 스냅 냉동 및 해동 관심 세포 펠릿에 첨가하여 실온에서 1분 동안 배양한 후 기포 없이 1분 동안 재현탁합니다.

세포를 얼음 위에 놓기 전에 실온에서 샘플을 1분 더 배양합니다. 초음파 처리기의 튜브 홀더에 튜브를 로드하기 전에 부유액을 얼음 위의 0.65ml 저결합 튜브로 옮깁니다. 70 마이크로 리터의 물이 들어있는 밸런스 튜브로 틈을 채우고 초음파 처리를 시작하기 전에 약 1 분 동안 수조에서 세포를 안정화시킵니다.

3 사이클 후, 부드러운 와류를 위해 초음파 발생기에서 샘플을 제거하고 튜브를 펄스 스핀하여 홀더에 다시 넣으십시오. 히스톤 변형을 위해 2 개의 칩 8 튜브 스트립의 각 튜브에 100 마이크로 리터의 완전한 tC1 버퍼를 추가하고 16 개의 염색질 공유 샘플 각각의 20 마이크로 리터를 칩 8 튜브 스트립의 개별 튜브로 옮깁니다. 80마이크로리터의 완전한 tC1 완충액으로 염색질 튜브를 세척하고 세척액을 튜브 당 200마이크로리터의 용액의 최종 부피에 대해 칩 8개 튜브 스트립의 적절한 튜브에 풀링합니다.

500 마이크로리터의 TBW1 버퍼에 적절한 양의 항체를 첨가하고 빠르게 와류와 펄스 스핀을 발생시킵니다. 그런 다음 70마이크로리터의 tBW1과 30마이크로리터의 항체 용액을 새 칩 8튜브 스트립의 각 튜브에 추가합니다. 다음으로, 단백질 A 비드 용액 용기를 완전히 와류로 만들고 항체 0.5마이크로그램당 5마이크로리터의 비드를 새 튜브 스트립에 추가합니다.

펄스를 사용하여 비드 스트립을 회전시키고 칩 리퀴드 핸들러의 마지막 줄을 레이블이 지정된 빈 칩 8 튜브 스트립으로 채웁니다. 그런 다음 나머지 스트립의 배치에 대한 칩 16-I pure 200 D 프로그램 사양에 따라 버퍼를 올바른 위치에 로드합니다. 염기서열분석 후, 8개의 튜브로 구성된 스트립 자석에 비드를 포집하고 25마이크로리터의 태그 부착 버퍼를 각 튜브로 옮깁니다.

자석에서 튜브를 제거한 상태에서 비드 용액이 균질해질 때까지 부드럽게 혼합한 후 다시 뚜껑을 씌운 튜브를 예열된 ThermoMixer에 3분 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 칩 리퀴드 핸들러의 마지막 줄에 있는 칩 8튜브 스트립을 제거하고 각 샘플에 2마이크로리터 Rnase A를 추가합니다. 그런 다음 다시 캡을 씌운 튜브를 펄스 스핀하고 비드 용액이 균질해질 때까지 부드럽게 혼합합니다.

태그가 지정된 DNA 단편의 정제를 위해 100마이크로리터의 D 가교 결합 DNA 샘플을 개별 1.5ml 튜브로 옮기고 튜브당 100마이크로리터의 DNA 결합 버퍼로 튜브를 세척합니다.적절한 튜브에서 세척을 펄스하고 샘플을 컬럼에 로드합니다. 컬럼을 새로운 1.5ml 수집 튜브에 넣고 섭씨 55도의 Tris-EDTA 버퍼 9마이크로리터를 컬럼 매트릭스에 직접 추가합니다.

1분 후 컬럼을 원심분리하고 각 컬럼에서 9마이크로리터의 용리액을 얼음 위의 새로운 8개 튜브 스트립으로 옮깁니다. 시연된 바와 같이 DNA 단편을 다시 용리하되 8마이크로리터의 Tris-EDTA 완충액으로 용리액을 추출하고 이전에 수확한 DNA 단편 용액으로 용출액을 풀링합니다. 정제된 DNA 단편 샘플을 증폭하려면 샘플을 다중 채널 피펫과 혼합하고 적절한 사이클 수로 증폭 프로그램을 수행합니다.

증폭 후 플레이트 자석을 사용하여 비드를 캡처하고 상층액을 버립니다. 비드 펠릿을 방해하지 않고 세척당 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올로 비드를 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 20마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 과도한 에탄올을 제거하고 비드를 10분 동안 또는 비드 펠릿에 균열이 나타날 때까지 건조시킵니다.

건조된 각 샘플에 예열된 물 40마이크로리터를 추가하고 완전히 와류화하기 전에 플레이트를 밀봉하고 잠시 펄스 회전합니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 형광 정량 분석 방법을 사용하여 DNA를 정량화합니다. 전단된 염색질 단편 크기 측정은 14주기 동안 100개에서 500개의 염기쌍 사이에서 관찰되는 샘플의 70% 이상에서 뛰어난 재현성을 보여줍니다.

예시된 바와 같이, 태그가 지정된 샘플의 intensity가 평균 최대값의 절반인 cycle이 cycle 결정에 최적입니다. 최상의 염기서열분석 데이터는 DNA 단편의 85% 이상이 200에서 1000개의 염기쌍 사이일 때 얻어집니다. 4개의 유전자 자리에 대한 이러한 대표적인 농축 트랙에서 각 샘플에 대한 개별 트랙은 높은 매핑 품질과 신호 대 잡음비를 보여줍니다.

처음 두 유전자 자리는 이러한 세포 유형에서 잘 발현된 유전자를 가지고 있는 반면, 마지막 두 유전자 자리의 유전자는 발현되지 않고 배경 대조군 역할을 합니다. 대부분의 쌍별 비교에서 Pearson 상관 관계 지수는 90% 이상의 상관 관계를 보여 생물학적 복제 간의 높은 수준의 일관성을 시사합니다. 세포 유형 특이적 유전자좌는 적절한 세포에서 높은 농축을 나타내는 반면, 하우스키핑 유전자는 매우 일관된 히스톤 변형을 보여줍니다.

100, 000 미만의 세포를 가진 샘플에서 수행된 ChIP-Seq 데이터 세트 간의 상관 관계 분석은 여전히 10, 000 세포까지 높은 재현성과 상관성을 보여줍니다. 그러나 세포 수가 감소함에 따라 배경이 증가하고 상관 계수가 감소합니다. 세포의 적절한 용해는 고품질 데이터를 생성하는 데 필수적이며, 불완전한 세포 용해가 프로토콜의 나머지 부분에 영향을 미친다는 것을 발견했습니다.

이 방법을 사용하여 다양한 히스톤 변형 및 전사 인자를 다양한 관심 세포 유형에서 테스트하여 시스 조절 요소에 대한 이해를 높일 수 있습니다.