자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색
August 25th, 2020
자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.
이 자유 부유 기법은 마우스 뇌 조직 샘플에 대한 면역조직화학을 감소시키는 데 사용할 수 있습니다. 자유 부동 기술은 몇 가지 이점을 제공합니다. 더 두꺼운 조직 절편을 획득하고, 분취액당 30-40개의 슬라이스를 사용하는 대규모 연구 수행 및 샘플의 장기 보관.
이 기술을 처음 시도하는 경우 실험에 중요하지 않은 섹션을 장착하여 이 방법에 대한 경험을 얻는 것이 좋습니다. 절편 최소 1-2시간 전에 적절한 조직 절단 온도에서 저온 유지 장치에서 관심 샘플을 순응시킵니다. 티슈가 준비되면.
크라이오스탯을 사용하여 20-50미크론 두께의 절편을 확보하고 절편을 6개 또는 12개의 웰 플레이트의 PBS로 채워진 웰의 개별 삽입물에 배치합니다. 모든 절편을 확보한 후, 각 절편을 튜브당 1-1.5ml의 저장 용액을 포함하는 2개의 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮기기 전에 5분 동안 3회 세척하기 위해 세척당 약 6ml로 샘플을 덮습니다. 그런 다음 염색할 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
조직 절편 염색의 경우, 샘플을 10-20분 동안 실온에서 평형화한 후 절편을 새로운 6웰 플레이트의 삽입물로 디캔팅합니다. 모든 저장 용액이 배출되면 인서트를 새 웰로 옮기고, 웰당 약 6ml의 TBS를 5분 동안 3회 세척하고 실온에서 저속으로 오비탈 셰이커에서 세척당 새 TBS를 포함합니다. 마지막 세척 후, 갓 준비한 7ml의 차단 투과화 용액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 셰이커에서 30분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 인서트당 1개의 2ml 마이크로 원심분리 튜브에 관심 있는 1차 항체 용액 1ml를 추가하고 각 인서트의 모든 섹션을 적절한 2ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 회전 믹서에 놓습니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양을 위해 분당 약 7회전을 추가합니다.
다음 날 아침, 각 튜브의 절편을 새로운 6개의 웰 플레이트에 삽입된 개별 웰 인서트로 디캔팅하고 세척당 30초 동안 섹션을 두 번, 세척당 새 TBS에서 10분 동안 한 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 튜브 당 1ml의 적절한 2차 항체 용액을 포함하는 개별 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 절편 그룹을 옮기고 빛을 차단한 저속으로 오비탈 쉐이커에서 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 끝나면 새로운 6웰 플레이트의 삽입물로 절편을 디캔팅하고 빛을 차단한 상태에서 세척당 새 TBS에서 30초 동안 두 번, 15분 동안 한 번 샘플을 세척합니다.
마지막 세척 후, TBS로 채워진 유리 직사각형 조직학 챔버에 절편을 넣고 TBS에 유리 슬라이드를 담그십시오.원하는 경우 미세한 붓과 돋보기를 사용하여 섹션을 슬라이드 쪽으로 조심스럽게 달아올리고 슬라이드에 섹션을 부드럽게 두드려 주름이나 주름이 없는지 확인합니다. 모든 섹션이 슬라이드에 캡처되면 섹션이 불투명해질 때까지 빛을 차단하고 실온에서 슬라이드를 약 10-15분 동안 건조시키고 섹션에 적절한 수성 장착 매체를 적용합니다.
핀셋을 사용하여 커버 슬립을 매체에 놓고 여과지를 사용하여 커버 슬립을 단단히 눌러 여분의 매체를 제거합니다. 그런 다음 적절한 현미경을 사용하여 단면을 이미지화하거나 섭씨 4도로 설정된 어두운 슬라이드 상자에 보관할 수 있습니다. 이러한 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이, 자유 부유 방법을 사용한 형광 면역조직화학 분석을 마우스 뇌 조직 절편에서 수행하여 신경교 섬유소 산성 단백질 발현을 검사할 수 있습니다.
이 접근법은 또한 저발현 형질전환 마우스 뇌 샘플 또는 크레실 바이올렛과 같은 비형광 조직화학적 염색 프로토콜에서 GFP와 같은 저발현 단백질을 밝히는 데에도 적합합니다. 다른 말초 조직도 간 조직 샘플을 발현하는 이러한 저수준 GFP에 대해 관찰된 바와 같이 필요한 수정 없이 이 기술을 사용할 수 있습니다. 자유 부동 기법에서 기억해야 할 가장 중요한 점은 특히 전사 중과 샘플이 셰이커 또는 로테이터에 있을 때 섹션을 부드럽게 다루는 것입니다.
면역형광 염색 외에도 이 방법은 헤마톡실린, 에오신 및 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학적 염색 또는 발색성 면역조직화학에 대해 쉽게 수정할 수 있습니다.
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개요
자유부유 기법은 고정된 조직 단면에 면역조직화학 염색을 수행하는 데 사용되어 생물학적 구조, 세포 유형 및 단백질 발현의 시각화를 가능하게 합니다. 이 방법은 특히 뇌, 심장, 간과 같은 다양한 조직을 조사하는 데 효과적이며, 두꺼운 조직 단면과 대규모 연구에 적합하다는 장점이 있습니다.
주요 연구 요소
연구 분야
- 조직학
- 면역조직화학
- 조직 분석
배경
- 자유부유 기법의 장점으로는 샘플 취급의 용이성과 장기간 샘플 보관 가능성이 있습니다.
- 이 방법은 수정 없이 여러 생물학적 조직에 적용 가능합니다.
- 다양한 샘플 유형에서 저발현 단백질의 검출을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 면역조직화학 염색
- 마우스 뇌 조직 샘플
- 형광 현미경
주요 결과
- 이 기법을 사용하면 교세포 섬유 산성 단백질 발현을 식별할 수 있습니다.
- GFP 형질주입 마우스 샘플과 같은 저 단백질 발현 상황에서의 효과를 입증합니다.
- 헤마톡실린 및 에오신과 같은 다른 염색 방법도 이 기법을 사용하여 적용할 수 있습니다.
결론
- 이 연구는 조직 염색 및 분석에 대한 자유부유 기법의 다양성을 강조합니다.
- 실험 중 샘플의 무결성을 유지하기 위해 연구자가 샘플을 부드럽게 취급하는 것이 중요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
The free-floating immunohistochemistry technique enables efficient processing of thick tissue sections for large-scale studies, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and peripheral tissue research. By improving antibody penetration and allowing batch handling of 30-40 sections per aliquot, it enhances reproducibility and throughput in discovery workflows. This approach is particularly valuable for studying protein expression patterns in complex tissues such as brain, where 3D reconstruction of neural projections informs target confidence and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables visualization of protein expression and localization in thick tissue sections, supporting functional target validation and pathway clarification.
- Operational Value: Facilitates handling of large numbers of sections per aliquot, reducing labor in large-scale biomarker screening campaigns.
- Predictive Value: Improves antibody penetration compared to slide-mounted methods, increasing confidence in detection of low-abundance targets such as GFP in transgenic models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with multiple histochemical stains including hematoxylin and eosin, cresyl violet, and chromogen immunohistochemistry, enabling flexible assay development.
- Operational Value: Sections remain suspended in solution during staining, ensuring uniform reagent exposure and minimizing variability across replicates.
- Scalability: Supports long-term storage at -80°C, allowing batch processing and retrospective analysis in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Applicable to both central nervous system and peripheral tissues (e.g., liver, heart) without protocol modifications, supporting cross-target validation.
- Mechanistic De-risking: Enables 3D reconstruction of axonal and dendritic projections, providing structural context for target engagement and pathway analysis.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates quantitative, spatially resolved protein expression data that inform go/no-go decisions in preclinical target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The free-floating method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in neuroscience and systemic toxicity assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein expression patterns in fixed tissues, enabling mechanistic insight into target biology.
- Screening: Generates reproducible, quantitative fluorescence or chromogenic readouts suitable for automated imaging and image-based screening platforms.
- Analytics: Produces spatially resolved expression data that can be quantified and compared across experimental conditions to assess target modulation.
- Translational Research: Enables consistency between discovery and preclinical models by applying identical staining protocols across species and tissue types.
- Enterprise Reuse: Represents a standardized, adaptable platform for histological analysis that can be deployed across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances detection sensitivity and specificity in immunohistochemistry, reducing false negatives in target validation studies.
- Operational Value: Standardizes tissue handling and staining procedures, improving inter-lab reproducibility and reducing technical variability.
- Strategic Value: Increases throughput in histology-based screening, lowering cost per sample and accelerating target de-risking cycles.
- Portfolio Impact: Supports data-driven target prioritization by providing reliable, multi-parameter tissue readouts that inform biological plausibility and safety margins.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue sectioning, and immunofluorescence or chromogenic detection methods.
- Dependent on access to cryostat, microtome, orbital shakers, rotating mixers, and fluorescence or brightfield microscopes.
- Necessitates standardized blocking, permeabilizing, and washing buffers to minimize non-specific binding and ensure staining consistency.
- Requires optimization of antibody concentrations and incubation times for each target and tissue type, particularly for low-abundance proteins.
- Demands careful, gentle handling of free-floating sections to prevent mechanical damage during transfers and incubation steps.
