자유 부유 조직 절편을 사용한 조직학적 기반 염색
2020년 8월 25일
자유 부동 기술을 통해 연구원들은 고정된 조직 절편에서 면역조직화학을 포함한 조직학적 기반 염색을 수행하여 생물학적 구조, 세포 유형, 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있습니다. 이것은 뇌, 심장 및 간과 같은 여러 조직을 조사하는 데 유용할 수 있는 효율적이고 신뢰할 수 있는 조직화학 기술입니다.
이 자유 부유 기법은 마우스 뇌 조직 샘플에 대한 면역조직화학을 감소시키는 데 사용할 수 있습니다. 자유 부동 기술은 몇 가지 이점을 제공합니다. 더 두꺼운 조직 절편을 획득하고, 분취액당 30-40개의 슬라이스를 사용하는 대규모 연구 수행 및 샘플의 장기 보관.
이 기술을 처음 시도하는 경우 실험에 중요하지 않은 섹션을 장착하여 이 방법에 대한 경험을 얻는 것이 좋습니다. 절편 최소 1-2시간 전에 적절한 조직 절단 온도에서 저온 유지 장치에서 관심 샘플을 순응시킵니다. 티슈가 준비되면.
크라이오스탯을 사용하여 20-50미크론 두께의 절편을 확보하고 절편을 6개 또는 12개의 웰 플레이트의 PBS로 채워진 웰의 개별 삽입물에 배치합니다. 모든 절편을 확보한 후, 각 절편을 튜브당 1-1.5ml의 저장 용액을 포함하는 2개의 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 옮기기 전에 5분 동안 3회 세척하기 위해 세척당 약 6ml로 샘플을 덮습니다. 그런 다음 염색할 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
조직 절편 염색의 경우, 샘플을 10-20분 동안 실온에서 평형화한 후 절편을 새로운 6웰 플레이트의 삽입물로 디캔팅합니다. 모든 저장 용액이 배출되면 인서트를 새 웰로 옮기고, 웰당 약 6ml의 TBS를 5분 동안 3회 세척하고 실온에서 저속으로 오비탈 셰이커에서 세척당 새 TBS를 포함합니다. 마지막 세척 후, 갓 준비한 7ml의 차단 투과화 용액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 셰이커에서 30분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 인서트당 1개의 2ml 마이크로 원심분리 튜브에 관심 있는 1차 항체 용액 1ml를 추가하고 각 인서트의 모든 섹션을 적절한 2ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 회전 믹서에 놓습니다. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양을 위해 분당 약 7회전을 추가합니다.
다음 날 아침, 각 튜브의 절편을 새로운 6개의 웰 플레이트에 삽입된 개별 웰 인서트로 디캔팅하고 세척당 30초 동안 섹션을 두 번, 세척당 새 TBS에서 10분 동안 한 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 튜브 당 1ml의 적절한 2차 항체 용액을 포함하는 개별 2밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 절편 그룹을 옮기고 빛을 차단한 저속으로 오비탈 쉐이커에서 실온에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 배양이 끝나면 새로운 6웰 플레이트의 삽입물로 절편을 디캔팅하고 빛을 차단한 상태에서 세척당 새 TBS에서 30초 동안 두 번, 15분 동안 한 번 샘플을 세척합니다.
마지막 세척 후, TBS로 채워진 유리 직사각형 조직학 챔버에 절편을 넣고 TBS에 유리 슬라이드를 담그십시오.원하는 경우 미세한 붓과 돋보기를 사용하여 섹션을 슬라이드 쪽으로 조심스럽게 달아올리고 슬라이드에 섹션을 부드럽게 두드려 주름이나 주름이 없는지 확인합니다. 모든 섹션이 슬라이드에 캡처되면 섹션이 불투명해질 때까지 빛을 차단하고 실온에서 슬라이드를 약 10-15분 동안 건조시키고 섹션에 적절한 수성 장착 매체를 적용합니다.
핀셋을 사용하여 커버 슬립을 매체에 놓고 여과지를 사용하여 커버 슬립을 단단히 눌러 여분의 매체를 제거합니다. 그런 다음 적절한 현미경을 사용하여 단면을 이미지화하거나 섭씨 4도로 설정된 어두운 슬라이드 상자에 보관할 수 있습니다. 이러한 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이, 자유 부유 방법을 사용한 형광 면역조직화학 분석을 마우스 뇌 조직 절편에서 수행하여 신경교 섬유소 산성 단백질 발현을 검사할 수 있습니다.
이 접근법은 또한 저발현 형질전환 마우스 뇌 샘플 또는 크레실 바이올렛과 같은 비형광 조직화학적 염색 프로토콜에서 GFP와 같은 저발현 단백질을 밝히는 데에도 적합합니다. 다른 말초 조직도 간 조직 샘플을 발현하는 이러한 저수준 GFP에 대해 관찰된 바와 같이 필요한 수정 없이 이 기술을 사용할 수 있습니다. 자유 부동 기법에서 기억해야 할 가장 중요한 점은 특히 전사 중과 샘플이 셰이커 또는 로테이터에 있을 때 섹션을 부드럽게 다루는 것입니다.
면역형광 염색 외에도 이 방법은 헤마톡실린, 에오신 및 크레실 바이올렛과 같은 다른 조직화학적 염색 또는 발색성 면역조직화학에 대해 쉽게 수정할 수 있습니다.
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개요
부유법(free-floating technique)은 고정된 조직 절편의 면역조직화학 염색을 수행하는 데 활용되며, 이를 통해 생물학적 구조, 세포 유형 및 단백질 발현을 시각화할 수 있습니다. 이 방법은 뇌, 심장, 간과 같은 다양한 조직을 연구하는 데 특히 효과적이며, 조직 절편을 더 두껍게 제작할 수 있고 대규모 연구에 적합하다는 장점이 있습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 조직학
- 면역조직화학
- 조직 분석
배경
- 자유 부유(free-floating) 기법의 장점으로는 취급이 용이하고 시료를 장기간 보관할 수 있다는 점이 있습니다.
- 이 방법은 별도의 수정 없이 다양한 생물학적 조직에 적용 가능합니다.
- 또한, 다양한 시료 유형에서 발현량이 낮은 단백질의 검출 능력을 향상시킵니다.
사용된 방법
- 면역조직화학 염색
- 마우스 뇌 조직 샘플
- 형광 현미경 검사
주요 결과
- 이 기술을 통해 glial fibrillar acidic protein 발현을 확인할 수 있습니다.
- GFP 형질전환 마우스 샘플과 같이 단백질 발현 수준이 낮은 환경에서도 효능이 입증되었습니다.
- 이 기술을 사용하여 hematoxylin and eosin과 같은 다른 염색법 또한 적용할 수 있습니다.
결론
- 본 연구는 조직 염색 및 분석에 있어 자유 부유 기법(free-floating technique)의 다재다능함을 강조합니다.
- 실험 과정 중 샘플의 무결성을 유지하기 위해서는 연구자가 샘플을 조심스럽게 다루는 것이 매우 중요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
유리 부유 면역조직화학(free-floating immunohistochemistry) 기법은 두꺼운 조직 절편의 효율적인 처리를 가능하게 하여 대규모 연구를 지원하며, 신경과학 및 말초 조직 연구에서 타겟 검증과 기전적 리스크 감소(mechanistic de-risking)를 돕습니다. 이 방법은 항체 침투력을 향상시키고 한 번의 처리(aliquot)당 30-40개의 절편을 일괄 처리할 수 있게 함으로써, 발굴 워크플로우의 재현성과 처리량을 높여줍니다. 특히 뇌와 같은 복잡한 조직에서 단백질 발현 패턴을 연구하는 데 매우 유용하며, 신경 투사(neural projections)의 3D 재구성을 통해 타겟 신뢰도를 높이고 포트폴리오 우선순위를 설정하는 데 기여합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 두꺼운 조직 절편에서 단백질 발현 및 국소화를 시각화할 수 있게 하여, 기능적 표적 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 운영적 가치: 분주당 다수의 절편 처리를 용이하게 하여, 대규모 바이오마커 스크리닝 캠페인의 노동력을 절감합니다.
- 예측적 가치: 슬라이드 부착 방식에 비해 항체 침투력을 향상시켜, 형질전환 모델의 GFP와 같은 저발현 표적 검출의 신뢰도를 높입니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: hematoxylin and eosin, cresyl violet 및 발색 면역조직화학 염색을 포함한 다양한 조직화학 염색과 호환되어 유연한 분석법 개발이 가능합니다.
- 운영적 가치: 염색 과정 동안 절편이 용액 속에 부유 상태로 유지되어 시약에 균일하게 노출되며, 반복 실험 간의 변동성을 최소화합니다.
- 확장성: -80°C에서의 장기 보관을 지원하여 배치 처리 및 발견 파이프라인에서의 회고적 분석이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 프로토콜 수정 없이 중추신경계와 말초 조직(예: 간, 심장) 모두에 적용 가능하여, 교차 표적 검증을 지원합니다.
- 기전적 리스크 감소: 축삭 및 수지상 돌기 투사체의 3D 재구성을 가능하게 하여, 표적 결합 및 경로 분석을 위한 구조적 맥락을 제공합니다.
- 리스크 조정 기반의 발전: 전임상 표적 선정 단계에서 go/no-go 결정을 내리는 데 기초가 되는 정량적이고 공간적으로 분해된 단백질 발현 데이터를 생성합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
자유 부유법(free-floating method)은 초기 표적 가설 검증부터 리드 물질 발굴 및 전임상 검증에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 특히 신경과학 및 전신 독성 평가 분야에서 유용합니다.
- 발견 생물학: 고정 조직 내 단백질 발현 패턴에 대한 가설 기반 조사를 지원하여, 표적 생물학에 대한 기전적 통찰력을 제공합니다.
- 스크리닝: 자동화된 이미징 및 이미지 기반 스크리닝 플랫폼에 적합하며, 재현 가능하고 정량적인 형광 또는 발색 리드아웃을 생성합니다.
- 분석: 실험 조건 전반에 걸쳐 정량화 및 비교가 가능한 공간 분해능 발현 데이터를 생성하여 표적 조절 상태를 평가합니다.
- 중개 연구: 종 및 조직 유형 전반에 동일한 염색 프로토콜을 적용함으로써, 발견 단계와 전임상 모델 간의 일관성을 확보합니다.
- 기업적 재사용: 여러 프로젝트와 치료 영역에 걸쳐 배포할 수 있는 표준화되고 적응 가능한 조직학적 분석 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 면역조직화학의 검출 민감도와 특이도를 높여 타겟 검증 연구에서 위음성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 조직 처리 및 염색 절차를 표준화하여 실험실 간 재현성을 높이고 기술적 변동성을 줄입니다.
- 전략적 가치: 조직학 기반 스크리닝의 처리량을 높여 샘플당 비용을 낮추고 타겟 리스크 제거 주기(de-risking cycles)를 단축합니다.
- 포트폴리오 영향: 생물학적 타당성과 안전 역치에 대한 정보를 제공하는 신뢰할 수 있는 다중 매개변수 조직 리드아웃을 통해 데이터 기반의 타겟 우선순위 결정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 조직학, 조직 절편 제작 및 면역형광 또는 발색 검출 방법에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 크라이오스탯(cryostat), 마이크로톰(microtome), 오비탈 쉐이커(orbital shaker), 회전식 믹서(rotating mixer) 및 형광 또는 명시야 현미경의 사용이 가능해야 합니다.
- 비특이적 결합을 최소화하고 염색 일관성을 확보하기 위해 표준화된 블로킹, 투과화 및 세척 버퍼가 필요합니다.
- 각 표적 및 조직 유형, 특히 발현량이 낮은 단백질에 대해 항체 농도와 배양 시간을 최적화해야 합니다.
- 전이 및 배양 단계 동안 기계적 손상을 방지하기 위해 부유 절편(free-floating sections)을 세심하고 부드럽게 다루어야 합니다.
