Name: 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 학습하세요 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans에서 칼슘 이미징을 위한 비국소적 진동 자극 시스템을 개발하는 방법을. 이 기술은 신경 회로의 활성을 비침습적으로 정량화하여 행동 신경과학 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는이 연구에 사용 된 균주를 제공 한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), 혁신적인 분야 "소프트 로봇의 과학"프로젝트 (그랜트 번호. JP18H05474), 일본 의학 연구 개발청 (보조금 번호 19gm6110022h001)의 PRIME 및 Shimadzu 재단.

1. 칼슘 이미징까지 웜 재배
<ol><li>칼슘 이미징 실험 4일 전, 두 개의 성인 ST12 웜을 새로운 선충류 성장 배지(NGM) 플레이트(Table of Materials)로 옮기고, 이 위에 에스케리치아 콜리 OP50이 세포 스프레더를 사용하여 정사각형 패턴(약 4mm x 4mm)으로 줄무늬가 생겨 웜이 칼슘 이미징12 동안 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 합니다.</li>
	<li>이 NGM 플레이트를 인큐베이터에서 20°C에서 4일 동안 인큐베이션한다(표 재료).</li>
</ol>2. 하드웨어 설정
<ol><li>자극용 압전 장치(13), 2x 대물렌즈, 고속 sCMOS 카메라, 이미지 분할 광학, xy 전동 스테이지, 여기를 위한 LED 광원 및 컴퓨터가 장착된 현미경을 준비합니다(그림 1). sCMOS 카메라의 필수 사양에는 인터페이스 옵션으로 10 탭 카메라 링크가 포함 된 2560 x 2160 활성 픽셀, 6.5 μm 크기. X-Y 전동 스테이지의 주요 사양에는 110mm x 75mm 이동 범위, 250mm/s 최대 속도, 2,000mm/s2 최대 가속도 및 0.25μm 단방향 반복성이 포함됩니다.</li>
	<li>컴퓨터와 xy 전동 스테이지 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>앰프를 켜고 볼륨 조절기를 10으로 , 베이스 및 고음 조절기를 8로 설정합니다.</li>
	<li>GCaMP 및 TagRFP를 자극하려면 LED 광원의 488nm 및 560nm 조명을 켭니다. 광원에서 제어 포드의 470nm 및 550nm의 게이지를 5%로 설정하여 LED 조명의 강도가 이미징에 적합하도록 합니다. 참고: 이 LED 강도에서 GCaMP 및 TagRFP 형광의 광표백은 기록 중에 발생하지 않습니다.</li>
</ol>3. 칼슘 이미징을 위한 소프트웨어 설정
<ol><li>Windows에서 마우스 매크로 소프트웨어, 진동 특성을 제어하는 소프트웨어, 추적 소프트웨어 실행을 위한 소프트웨어 및 데이터 분석용 소프트웨어(자료 표)의 세 가지 소프트웨어 패키지를 다운로드하여 설치합니다.</li>
	<li>추적 소프트웨어 파일을 두 번 클릭하십시오.</li>
	<li>실행 단추를 누르고 5분 동안 기다렸다가 소프트웨어를 안정화합니다(그림 2A).</li>
	<li>노출 시간 및 비닝에 대한 정보를 제공합니다. 0.033s 노출 시간과 2 x 2 비닝으로 원활한 이미지 수집이 보장됩니다(그림 2B). 참고: 메모리 로드를 줄이기 위해 획득한 10번째 이미지만 표시됩니다.</li>
	<li>이미지 수집을 위한 정보를 제공합니다(그림 2C). 예를 들어 10초 간격으로 500개의 이미지가 두 번 기록되는 경우 [이미지] 합계 상자에 1,000개, [이미지] 상자에 500개, 간격 상자에 10 개를 입력합니다.</li>
	<li>획득 단추를 켭니다(그림 2D).</li>
	<li>이미지 분할 광학을 사용하여 형광 이미지를 분할하고, 두 개의 이미지 (GCaMP 채널, 500-525 nm (도 2E); TagRFP 채널, 584-676 nm (그림 2F))는 sCMOS 카메라의 두 반쪽에 투영됩니다. GCaMP 및 TagRFP 채널의 좌표를 보정합니다(그림 2G). 소프트웨어 설정을 저장합니다.</li>
	<li>데이터 파일을 출력하도록 디렉토리를 설정합니다(그림 2H).</li>
	<li>획득 단추를 끕니다(그림 2D).</li>
	<li>마우스 매크로 시스템 소프트웨어(그림 3A)를 두 번 클릭하고 진동 속성을 설정합니다(그림 3B). 마우스 매크로 시스템에서 Assay.txt 파일을 읽어 마우스 커서가 해당 파일의 좌표와 일정에 따라 제어되도록 합니다(그림 3A). 마우스 커서의 좌표(그림 3A의 자홍색 사각형)를 설정하고 기록을 시작한 후 자극이 시작될 때까지 대기 시간(그림 3A의 마젠타)을 설정합니다. 진동 제어를 위해 소프트웨어에서 주파수와 진폭 값을 설정합니다(그림 3B).</li>
</ol>4. 칼슘 이미징을위한 웜의 제조
<ol><li>GCaMP 및 TagRFP를 모두 발현하는 단일 웜을 인큐베이션 플레이트에서 대장균 OP50이 줄무늬가 있는 새로운 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다.</li>
	<li>투명 접착 테이프를 사용하여 NGM 플레이트를 압전 음향 트랜스듀서에 부착합니다(그림 4). 액추에이터 위로 플레이트를 누르지 마십시오. 이 경우 진동 주파수가 변경됩니다.</li>
</ol>5. 특정 진동 특성의 제어하에 칼슘 이미징
<ol><li>획득 단추를 켭니다(그림 2D).</li>
	<li>밝은 빛과 여기 빛 (488nm 및 560nm)에서 웜을 찾으십시오.</li>
	<li>현미경의 확대/축소 값을 2.5배로 설정합니다. 시야각은 1.1mm x 1.1mm이며 해상도는 2.6μm/픽셀입니다.</li>
	<li>밝은 빛을 끄고 호밍 버튼(그림 2I)을 켜서 웜의 형광 지점을 추적합니다. 이 호밍 버튼은 X-Y 스테이지의 이동을 시작하여 TagRFP 이미지의 시야각 중간에 웜의 최대 강도 영역을 유지합니다. 참고 : flp-18 프로모터의 관점에서 AVA 뉴런의 형광 강도는 가장 강하고 다른 뉴런의 형광 강도는 희미하거나 감지되지 않습니다. 따라서 저배율 시스템은 추적에 필요하지 않으며 스테이지는 녹음 전체에서 움직입니다.</li>
	<li>그림 2E 및 2F의 강도 막대 값이 약 1,000인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 광원에서 제어 포드의 470nm 및 550nm 게이지를 미세 조정합니다.</li>
	<li>마우스 매크로 시스템에서 실행 단추를 눌러 그림 3A에 설명된 일정에 따라 마우스 커서를 제어할 수 있도록 합니다. 이것은 추적 소프트웨어를 사용하여 기록하기 시작하고 웜을 추적하는 동안 파동 유전자 소프트웨어에 의해 자극됩니다.</li>
	<li>출력 BMP 파일이 적절하게 작성되었는지 확인하십시오.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>바탕 화면에 폴더를 만들고 이름을 CalciumImaging으로 지정합니다.</li>
	<li>CalciumImaging 폴더 안에 폴더를 만들고 출력 결과 파일에 대해 이름을 CIResult로 지정합니다.</li>
	<li>Windows 용 데이터 분석 소프트웨어로 작성된 DualViewImaging.nb 파일을 두 번 클릭하십시오.</li>
	<li>파일 경로를 CIResult 폴더에 삽입합니다(예: DirectoryName[/Users/Sugi0911/Desktop/CalciumImaging/CIResult/test.rtf]).</li>
	<li>BMP 파일(예: SetDirectory[/Users/Sugi0911/Desktop/XXX/])(그림 5)을 포함하는 폴더에 파일 경로를 삽입합니다. 여기서 XXX 는 BMP 파일을 포함하는 폴더 이름을 나타냅니다.</li>
	<li>Shift 키와 Return 키를 동시에 눌러 자동 분석을 시작합니다. 이 분석은 TagRFP 이미지에서 시야각의 최대 강도 영역의 값을 사용합니다 (프로그램의 자세한 계산 절차는 그림 6의 범례 참조).</li>
	<li>다음 출력 파일이 CIResult 폴더에 적절하게 생성되었는지 확인하십시오. XXX-GCaMP.tif(모든 이미지에 대한 GCaMP 강도의 흔적을 보여주는 이미지 파일) XXX-GCaMP.xls (모든 이미지에서 GCaMP 강도를 나열하는 스프레드 시트 파일) XXX-TagRFP.tif(모든 이미지에 대한 TagRFP의 강도 추적을 보여주는 이미지 파일) XXX-TagRFP.xls(모든 이미지에서 TagRFP 강도를 나열하는 스프레드시트 파일) XXX-비율.tif(모든 이미지에 대한 비율 값의 흔적을 보여주는 이미지 파일) XXX 비율.xls(모든 이미지의 비율 값을 나열하는 스프레드시트 파일)</li>
</ol>

<ol><li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotremology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li>
<li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li>
<li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li>
<li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+force%3A+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li>
<li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+circuit+for+touch+sensitivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).</li>
<li>Wicks, S. R., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integration+of+antagonistic+reflexes+revealed+by+laser+ablation+of+identified+neurons+determines+habituation+kinetics+of+the+Caenorhabditis+elegans+tap+withdrawal+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response.</a> Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).</li>
<li>Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+model+system+for+the+study+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory.</a> Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).</li>
<li>Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88(2013).</li>
<li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%3A+The+International+Journal+of+the+Japan+Society+for+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li>
<li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compressional+and+surface+waves+in+sand%3A+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li>
<li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li>
<li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li>
<li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li>
<li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li>
<li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li>
<li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li>
<li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li>
<li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

일반적으로, 신경 활동의 정량화는 동물 신체 움직임에 대한 프로브 및/또는 구속의 도입을 필요로 한다. 그러나 mechanosensory 행동에 대한 연구를 위해, 프로브와 구속의 침습적 도입 자체는 기계적 자극을 구성합니다. C. elegans는 그 특징이 투명하고 302 뉴런 만 포함하는 간단하고 컴팩트 한 신경 회로를 가지고 있기 때문에 이러한 문제를 회피하는 시스템을 제공합니다. 이러한 장점들을 나노스케일 변위(13)의 국부적 진동을 불러일으키는 이전에 개발된 방법과 결합하여, 여기에 예시된 것은 제어된 진동에 반응하는 억제되지 않은 C. elegans 의 비침습적 칼슘 이미징을 위한 방법이다.
기계적 자극의 특성은 주파수, 변위 및 지속 시간과 같은 몇 가지 매개 변수에 의해 정의됩니다. 최근에, 생물 tremology는 새로운 연구 분야로 부상하고있다1...

동물들은 종종 진동 또는 음향파(1,2)와 같은 비국부적인 기계적 자극에 노출된다. 이러한 자극이 항상성, 발달 및 번식에 영향을 미치 기 때문에 동물은 3,4,5에 대처하기 위해 행동을 수정해야합니다. 그러나 이러한 행동 수정의 기초가되는 신경 회로와 메커니즘은 잘 이해되지 않습니다.
선충류의 Mechanosensory 행동 인 Caenorhabditis elegans는 단순한 행동 패러다임으로, 웜은 일반적으로 비 국소 진동을 만날 때 전진 운동에서 후진 탈출 반응으로 행동을 변경합니다6. 이 행동의 기초가되는 신경 회로는 주로 다섯 개의 감각 뉴런, 네 쌍의 인터뉴런 및 여러 유형의 운동 뉴런 7,8로 구성됩니다. 추가적으로, 웜은 반복적인 자극을 수반하는 이격 훈련 후에 그러한 기계적 자극에 습관화된다 9,10,11. 따라서이 간단한 행동 반응은 비 국소 진동 유발 행동과 기억의 기초가되는 신경 메커니즘을 조사하는 이상적인 시스템을 구성합니다. 비국소 진동의 영향으로 자유롭게 행동하는 웜에서 칼슘 이미징을위한 프로토콜이 설명됩니다. 이전에 보고된 시스템과 비교할 때, 이 시스템은 추적을 위해 추가 카메라가 필요하지 않다는 점에서 간단합니다. 그러나 이를 통해 비국부적 진동의 주파수, 변위 및 지속 시간을 변경할 수 있습니다. AVA 인터뉴런의 활성화는 후진 탈출 반응을 유도하기 때문에, GCaMP, 칼슘 지시약, 및 칼슘-민감하지 않은 형광 단백질인 TagRFP를 공동발현하는 웜을 AVA 특이적 프로모터의 제어 하에 예로 사용하였다(자세한 내용은 표 참조). 이 프로토콜은 웜이 전진에서 후진 운동으로 전환됨에 따라 AVA 뉴런의 활성화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 mechanosensory 행동의 기초가되는 신경 회로 메커니즘을 이해하는 것을 용이하게합니다.

<table><tbody><tr><td>Data anaylsis software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DualViewImaging.nb</td><td>author</td><td></td><td>수집된 데이터 분석</td></tr><tr><td>Mathematica12</td><td>Wolfram</td><td></td><td>데이터 분석 소프트웨어 DualViewImaging</td></tr><tr><td>Escherichia coli and C. elegans strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. 대장균 OP50</td><td>Caenorhabditis 유전학 센터</td><td>OP50</td><td>C. elegans. 식품 Uracil auxotroph.E. 대장균 B.</td></tr><tr><td>lite-1(ce314) 균주</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>KG1180</td><td>빛에 민감하지 않은 돌연변이</td></tr><tr><td>lite-1(ce314) 균주 AVA-speciric promoter</td><td>저자</td><td>ST12</td><td>lite-1(ce314) NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; 핵 국소화 신호) 및 TagRFP를 발현하는 유전자를 운반하는 돌연변이 FLP -18 프로모터는 extrachoromosomal 어레이</td></tr> <tr><td>< 강> 레이저 도플러 진동계< / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>라제 도플러 진동계</td><td>Polytec Japan</td><td>IVS-500</td><td>음향 변환기에 의해 생성 된 주파수 및 변위를 정량화하기 위해</td></tr><tr><td>Mouse macro system </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay.txt</td><td>저자</td><td></td><td>Windows</td></tr><tr><td>HiMacroEx</td><td>Vector</td><td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td> 스크립트Nematode growth media plate<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar purified, powder</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td>를 기반으로 마우스 커서를 제어하기 위한 무료 다운로드 소프트웨어 NGM 플레이트의 제조</td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td>NGM 플레이트의 제조</td></tr> 염화<tr><td>칼슘</td><td>Wako</td><td>036-00485</td><td>NGM 플레이트의 제조</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>Wako</td><td>034-03002</td><td>NGM 플레이트의 제조</td></tr><tr><td>di-Photassium hydrogenphosphate</td><td>Nakarai tesque</td><td>28727-95</td><td>NGM 플레이트의 제조</td></tr><tr><td>LB 육수, Lennox</td><td>Nakarai tesque</td><td>20066-95</td><td>E. coli OP50</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 무수</td><td>TGI</td><td>M1890</td><td>NGM 플레이트 제조</td></tr><tr><td>용 Dihydrogenphosphate 칼</td>륨 <td>Nakarai tesque</td><td>28720-65</td><td>NGM 플레이트 제조</td></tr> 용 <tr><td>염화나트륨</td><td>Nakarai tesque</td><td>31320-05</td><td>NGM 플레이트 제조</td></tr><tr><td>페트리 접시(60mm)</td><td>Nunc</td><td>150270</td><td>NGM 플레이트 준비</td></tr><tr><td>용<강한>비국소화 진동 장치</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>LEPY</td><td>LP-A7USB</td><td>제어 가능한 진동으로 자극하기 위해</td></tr><tr><td>음향 변환기</td><td>MinebeaMitsumi</td><td>LVC25</td><td>제어 가능한 진동으로 자극하기 위해</td></tr><tr><td>WaveGene Ver. 1.5</td><td>Thrive</td><td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td><td>진동 속성 제어를 위한 무료 다운로드 소프트웨어</td></tr><tr><td><강한>비침습적 칼슘 이미징</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2채널 벤치탑 3상 브러시리스 DC 서보 컨트롤러</td><td>Thorlabs</td><td>BBD202</td><td>MLS203-1 스테이지용 호환 컨트롤러</td></tr><tr><td>479/585 nm BrightLine 이중 대역 통과 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-479/585-25</td><td>2채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용</td></tr><tr><td>505/606 nm BrightLine 이중 가장자리 표준 에피 형광 이색성 빔스플리터</td><td>Semrock</td><td>FF505/606-Di01-25x36</td><td>2채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용</td></tr><tr><td>512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-512/25-25</td><td>2채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP)</td></tr> <tr><td>획득용630/92 nm BrightLine 단일 대역 통과 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-630/92-25</td><td>2채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용Intel</td></tr> <tr><td>Xeon CPU ES-2630 및 8GB RAM이 탑재된</td> <td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>Precision T7600</td> Windows7</tr><tr><td>고속 x-y 전동 스테이지</td><td>Thorlabs</td><td>MLS203-1</td><td>고속 XY 스캔 스테이지</td></tr><tr><td>이미지 분할 광학</td><td>Hamamatsu photonics</td><td>A12801-01</td><td>W-VIEW GEMINI에 의해 생성된 2채널 이미지(GCaMP 및 TagRFP) 획득용 이미지 분할 광학</td></tr><tr><td>LED 광원</td><td>CoolLED</td><td>pE-4000</td><td>470nm 및 560nm 여기광 생성용</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>sCMOS 카메라</td><td>Andor</td><td>Zyla</td><td></td></tr><tr><td>x 2 대물 렌즈</td><td>Olympus</td><td>MVPLAPO2XC</td><td>작동 거리 20mm 및 수치 조리개 0.5</td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pKDK66 플라스미드</td><td>저자</td><td>pKDK66</td><td>Co-injection marker</td></tr><tr><td>pTAK83 plasmid</td><td>author</td><td>pTAK83</td><td>Plasmid for expression of TagRFP under the control&nbsp; the flp-18 promoter</td></tr><tr><td>pTAK144 plasmid</td><td>author</td><td>pTAK144</td><td>&nbsp의 통제하에 NLS-GCaMP5G-NLS의 발현을 위한 플라스미드; flp-18 promoter</td></tr><tr><td>Tracking software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>homingback.vi</td><td>author</td><td></td><td>sCMOS 카메라 및 x-y 전동 스테이지의 피드백 제어를 통해 웜의 형광 반점을 추적하기 위한 SubVi 파일</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National instruments</td><td></td><td>추적 소프트웨어 실행을 위한</td></tr><tr><td>LabVIEW Zyla Control ver.2.6CI.vi</td><td>저자</td><td></td><td>sCMOS 카메라 및 x-y 전동 스테이지의 피드백 제어를 통해 웜의 형광 스폿을 추적하기 위해</td></tr></tbody></table>

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

진동 및 음향파와 같은 비국부적 인 기계적 힘은 개발에서 항상성에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칩니다. 동물은 행동을 수정함으로써 이러한 자극에 대처합니다. 이러한 행동 수정의 기초가되는 메커니즘을 이해하려면 관심있는 행동 중 신경 활동의 정량화가 필요합니다. 여기에서, 우리는 특정 주파수, 변위 및 지속 시간의 비 국소 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans 에서 칼슘 이미징 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하면 음향 변환기를 사용하여 잘 제어되고 국부적이지 않은 진동을 생산하고 단일 세포 분해능에서 유발 된 칼슘 반응을 정량화 할 수 있습니다. 원리의 증거로서, 진동에 대한 C. elegans 의 탈출 반응 동안 단일 인터뉴런 인 AVA의 칼슘 반응이 입증됩니다. 이 시스템은 기계적 자극에 대한 행동 반응의 기초가되는 신경 메커니즘에 대한 이해를 촉진 할 것입니다.

여기서, AVA 인터뉴런 특이적 프로모터의 제어 하에 GCaMP 및 TagRFP 둘 다를 발현하는 웜은 자유롭게 행동하는 C. elegans에서 칼슘 이미징의 예로서 사용된다. GCaMP 및 TagRFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 획득되었으며, 이들 중 일부는 도 6 및 영화(보충 무비 1)로서 도시되어 있다. 우리의 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 플레이트의 변위(그림 7)도 정량화되었다. 변위는 진동 제어를 위한 소프트웨어(그림 3B)와 증폭기의 볼륨 조절기(그림 4)의 진폭 값을 설정하여 제어할 수 있는 반면, 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조절됩니다(그림 4).</st...

여기에 보고된 것은 잘 제어되고 국소화되지 않은 진동을 가진 자유롭게 행동하는 예쁜꼬 마선충에서 칼슘 이미징을 위한 시스템이다. 이 시스템을 통해 연구원은 나노 규모의 변위에서 잘 제어 된 특성을 가진 비 국부적 인 진동을 불러 일으키고 진동에 대한 C. elegans 의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화 할 수 있습니다.

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

우리의 시스템은 연구원들이 비스케일 변위에서 잘 제어되는 특성을 가진 비국부적 진동을 불러일으키고 진동에 대한 자극제의 반응 중에 칼슘 전류를 정량화할 수 있게 해줍니다. 이 기술의 주요 장점으로, 우리는 비침습적으로 행동의 기본 메커니즘 인 신경 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. Escherichia coli OP50이 칼슘 이미징 중에 박테리아에서 대부분의 시간을 소비하도록 세포 스프레더를 사용하여 사각형 패턴으로 줄무늬가있는 새로운 선충류 성장 배지 또는 NGM 플레이트를 준비하십시오.칼슘 이미징 실험 나흘 전에 성인 ST12 웜 두 개를 플레이트에 옮기고 플레이트를 섭씨 20도 인큐베이터에 나흘 동안 놓습니다. 자극을 위한 음향 트랜스듀서 장치, 2x 대물 렌즈, 고속 CMOS 카메라, 이미지 분할 광학이 장착된 현미경을 사용하여 칼슘 이미징을 수행합니다. X Y 전동 스테이지 컨트롤러에서 정밀 컴퓨터를 켭니다.그런 다음 앰프를 켜고 볼륨 조절기를 베이스에서 10으로 설정하고 고음 조절기를 여덟 개로 설정합니다. GCaMP를 자극하고 RFP에 태그를 지정하려면 LED 광원의 488 및 560 나노 미터 조명을 켭니다. 광원에 있는 제어 포드의 470 및 550 나노미터 게이지를 5%로 설정하여 LED 조명의 강도가 이미징에 적합하도록 합니다.다음 소프트웨어 패키지 및 창을 다운로드하여 설치합니다. 마우스 매크로 소프트웨어, 진동 제어 소프트웨어, 추적 실행 소프트웨어 및 데이터 분석용 소프트웨어. 추적 소프트웨어 파일을 두 번 클릭 한 다음 노출 시간을 0.033 초로 설정하고 두 개씩 비닝하여 원활한 이미지 수집을 보장합니다.실행 버튼을 클릭하고 소프트웨어를 안정화하기 위해 다섯 분 동안 기다립니다. 이미지 수집을 위한 정보를 입력합니다. 예를 들어 간격 없이 500개의 이미지를 기록하려면 이미지 합계 상자에 500을, 이미지 상자에 500을, 간격 상자에 0을 입력합니다.획득 버튼을 켠 후 이미지 분할 광학을 사용하여 형광 이미지를 분할하고 GCaMP 채널을 투사하고 RFP 채널을 CMOS 카메라의 두 반쪽에 태그합니다. GCaMP의 좌표를 보정하고 RFP 채널에 태그를 지정하고 설정을 저장합니다. 그런 다음 데이터 파일을 출력하고 수집을 끄도록 디렉토리를 설정하십시오.분석을 읽으십시오. 마우스 매크로 시스템이있는 텍스트 파일을 사용하여 마우스 커서가 해당 파일의 좌표와 일정에 따라 제어되고 진동 제어를 위해 소프트웨어 파일을 두 번 클릭하십시오. 기록을 시작한 후 자극까지 대기 시간에 마우스 커서의 좌표를 설정 한 다음 진동 제어를 위해 소프트웨어에서 주파수와 진폭 값을 설정하십시오.GCaMP 및 태그 RFP를 모두 발현하는 단일 웜을 인큐베이션 플레이트에서 E coli OP50이 줄무늬가 있는 신선한 NGM 플레이트로 옮깁니다. 투명 접착 테이프를 사용하여 NGM 플레이트를 음향 트랜스듀서에 부착합니다. 칼슘 이미징의 경우 수집 버튼을 켜고 2.5x 배율로 웜을 찾으십시오.시야각을 픽셀당 2.6미크론의 해상도로 1.1 x 1.1밀리미터로 설정합니다. 밝은 빛을 끄고 호밍 버튼을 클릭하여 웜의 형광 스폿을 추적하면 X Y 단계의 이동이 시작되어 태그 RFP 이미지의 시야각 중간에 웜의 최대 강도 영역을 유지합니다. 강도 값이 약 1000인지 확인하십시오.그렇지 않은 경우 광원에서 제어 포드의 470 및 550 나노 미터 게이지를 미세 조정하십시오. 마우스 매크로 시스템에서 실행 단추를 눌러 마우스 커서 제어를 허용하고 출력 BMP 파일이 적절하게 생성되었는지 확인합니다. 데이터 분석을 위해 바탕 화면에 폴더를 만들고 이름을 Calcium Imaging"으로 지정한 다음 Calcium Imaging 폴더 안에 폴더를 만들고 출력 결과 파일의 이름을 CI result로 지정합니다.듀얼 뷰 이미징을 두 번 클릭합니다. MB 파일은 데이터 분석 소프트웨어에 기록되고, BMP 파일이 있는 폴더에 CI 결과 폴더에 파일 경로를 삽입한다. 시프트와 리턴 키를 동시에 눌러 태그 RFP 이미지에서 최대 강도 영역의 값을 사용하는 자동 분석을 시작합니다.마지막으로 출력 파일이 CI 결과 폴더에 적절하게 생성되었는지 확인하십시오. 대표적인 분석에서, GCaMP 및 태그 RFP 채널 데이터는 일련의 이미지로서 얻어졌다. 비국부적 진동 시스템에 의해 유도된 페트리 접시의 변위도 또한 정량화되었다.변위는 진동 제어를위한 소프트웨어에서 진폭 값을 설정하고 볼륨 조절기 및 증폭기를 설정하여 제어 할 수 있습니다. 반면 주파수는 소프트웨어에서 주파수 값을 설정하여 조정할 수 있습니다. AVA 뉴런의 일시적인 칼슘 반응은 630 헤르츠의 주파수와 초당 약 4.5 마이크로미터의 변위를 갖는 진동으로 자극시 관찰되었으며, 이는 아바 뉴런이 비국소 자극에 대한 웜의 후진 반응 중에 활성화되었음을 나타낸다.우리의 절차에서, 우리는 단지 하나의 뉴런을 정량화 할 수 있습니다. 그러나이 시스템은 생체 인식 이미징 방법과 결합하여 비침습적으로 여러 뉴런 또는 심지어 전체 뇌를 정량화 할 수도 있습니다.

calcium-imaging-freely-behaving-caenorhabditis-elegans-with-well

Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

이 동영상은 칼슘 이미징의 개념을 소개하고 성형된 아가로스 웰에 포함된 벌레의 타임 랩스 이미징을 위한 예제 프로토콜을 포함합니다.

칼슘 이미징: 살아있는 예쁜꼬마선충의 신경 활동을 시각화하는 방법

이 비디오는 유전적으로 암호화된 형광 리포터 단백질을 사용하여 행동하는 Caenorhabditis elegans의 개별 뉴런에서 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. 이 연구는 기생충의 움직임을 이미징하고 뉴런에서 리포터 형광 비율을 측정하여 세포 내 칼슘 수치를 알을 낳는 동안 뉴런 활동 및 행동 변화와 상관시키는 단계를 간략하게 설명합니다.

Calcium Imaging in individual neurons Regulating Egg-Laying Behavior in Caenorhabditis elegans(예쁜꼬마선충의 알을 낳는 행동을 조절하는 개별 뉴런의 칼슘 이미징)

출처: Doser, R., et al. 생체 내 신경 칼슘 처리의 세포 내 이미징. J. Vis. 경험. (2023년)이 비디오는 형질전환 Caenorhabditis elegans 균주의 복부 신경 코드 뉴런에서 세포내 칼슘 플럭스의 생체 내 이미징을 보여줍니다. 두 가지 별개의 칼슘 지표가 사용됩니다: 한 균주의 세포질 지표와 다른 균주의 미토콘드리아 지표. 뉴런은 자발적인 뉴런 활동 중 칼슘 플럭스를 반영하여 뉴런 세포질 및 미토콘드리아 내 형광 강도의 실시간 변화를 모니터링하기 위해 형광 현미경으로 관찰됩니다.

Caenorhabditis elegans의 뉴런에서 세포내 칼슘 역학 이미징

작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의...

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

동물을 움직이지 않게 하지 않고 장시간 척도에 걸쳐 행동과 신경 활동을 영상화하는 것이 행동을 이해하기 위한 전제 조건입니다. 아가로스 미세유체 챔버 이미징(AMI)은 예쁜꼬마선충의 모든 생애 단계에 대한 신경 활동과 행동을 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.

의 장기 칼슘 이미징을위한 아가로 오스 Microchambers<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 프로토콜 꼬마 선 충 벌레 행동에 신경 활동에 기록 변화 유전자 인코딩된 캘리포니아2 + 기자의 사용을 설명 합니다.

꼬마 선 충 을 행동에 개별 뉴런의 비율 칼슘 이미징

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

수지상 등뼈는 신경계의 중요한 세포 특징입니다. 여기에서는 C. elegans에서 수지상 가시의 구조와 기능을 평가하기위한 라이브 이미징 방법이 설명됩니다. 이러한 접근법은 수지상 척추 모양 또는 기능을 정의하는 유전자에 대한 돌연변이 스크린의 개발을 지원합니다.

Caenorhabditis elegans의 수지상 가시 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

여기에서는 모델 선충 C. elegans의 생식계에서 발현되는 유전적으로 암호화된 칼슘 리포터를 사용하여 수정 및 초기 배발생 중 칼슘을 시각화하기 위한 프로토콜과 도구를 제시합니다.

In vivo Visualization of calcium Transients during fertilization and Early Development in C. elegans(예쁜꼬마선충의 수정 및 초기 발달 중 칼슘 과도 현상의 생체 내 시각화)

학습하세요 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans에서 칼슘 이미징을 위한 비국소적 진동 자극 시스템을 개발하는 방법을. 이 기술은 신경 회로의 활성을 비침습적으로 정량화하여 행동 신경과학 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

잘 제어되고 국소화되지 않은 진동으로 자유롭게 행동하는 Caenorhabditis elegans의 칼슘 이미징

더 많은 동영상 탐색