Name: 낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 배우세요 낭포성 섬유증 환자 객담에서 Pseudomonas aeruginosa와 Psl 다당류를 시각화하는 방법을. 이 기법은 세균의 공간적 구조와 항생제 내성을 연구하는 데 활용됩니다.

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저자들은 이 연구에 자금을 지원한 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)과 항-Psl0096 항체를 아낌없이 기증한 MedImmune에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구를 위해 이미징은 토론토 대학의 CAMiLoD 이미징 시설에서 수행되었습니다.

연구 윤리 위원회(REB)의 승인은 인간 피험자로부터 객담 샘플을 수집하고 보관하는 데 필요합니다. 본 연구에 제시된 연구는 Hospital for Sick Children REB#1000058579의 승인을 받았습니다.
1. 객담 채취
<ol><li>객담을 멸균 채취 컵에 보관하고 즉시 4°C에서 최대 24시간 동안 보관한 후 고정합니다. 알림: 가래를 고정하지 않고 4°C에서 너무 오래 방치하면 세포 분해, 특히 백혈구 분해가 발생할 수 있습니다. 가능한 한 빨리 고정하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>객담 검체를 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>객담 샘플에 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 예를 들어, 객담 샘플이 0.5mL인 경우 0.5mL의 4% PFA를 추가합니다. 부드러운 반전으로 섞는다.</li>
	<li>4 °C에서 밤새 가래를 배양합니다.</li>
	<li>고정 객담 2mL 각각에 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 샘플을 세척합니다. 알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 필요하지 않습니다.</li>
	<li>피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 알림: 팁을 가래에서 멀어지게 하여 피펫으로 가래를 빨아들이지 말고 표면 액체에서 매우 천천히 흡인하십시오. 세척 단계에는 가래 플러그의 구조적 무결성을 방해하지 않도록 원심 분리가 포함되지 않습니다.</li>
	<li>1.6-1.7단계를 두 번 더 반복합니다.</li>
	<li>펠릿을 PBS 부피의 2배에 0.01%(w/v) 아지드화나트륨으로 재현탁시킵니다.</li>
	<li>객담은 4 °C에서 보관한다.</li>
</ol>2. 객담의 MiPACT(조직 청소 기술) 처리
<ol><li>하이드로겔 성분(30% 29:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드, 경화제 및 PBS)을 혐기성 팩이 들어 있는 밀봉된 용기에서 72시간 전에 가스를 제거합니다. 알림: 산소가 아크릴아마이드 중합을 억제하기 때문에 혐기성 팩과 밀봉된 용기가 필요합니다. 대안적으로, 산소는 혐기성 후드 내에서 이 단계를 수행하거나, 밀봉된 용기에 진공을 적용하거나, 아크릴아마이드 혼합물을 통해N2 가스를 버블링함으로써 제거될 수 있다.<ol><li>밀봉된 혐기성 용기 내부의 뚜껑을 닫은 상태에서 30% 29:1 아크릴아마이드:비스-아크릴아미드 용액 2mL를 15mL 튜브에 추가합니다.</li>
		<li>15mL 튜브에 PBS 5mL에 경화제 0.5g을 첨가하여 10%(w/v) 경화제의 농축액을 만듭니다. 튜브의 뚜껑을 닫고 밀봉된 혐기성 용기에 보관하십시오.</li>
		<li>멸균 PBS 몇 mL를 혐기성 용기 내부의 뚜껑을 닫은 상태로 튜브에 그대로 둡니다.</li>
	</ol></li>
	<li>15mL 튜브에 PBS의 0.2% 경화제와 4% 29:1 아크릴아마이드:비스-아크릴아미드의 최종 농도로 하이드로겔 용액 5mL를 만듭니다. 반전으로 혼합하고 필터 살균합니다.</li>
	<li>냉장고에서 가래 샘플을 꺼낸 다음 메스로 멸균 상태에서 작은 부분(직경 약 5mm)으로 자릅니다. 알림: 가래가 매우 유동적인 경우에도 이 단계를 수행할 수 있지만 메스를 사용하여 원하는 분획을 분리하기 전에 핀셋으로 보관 용액에서 가래를 제거하려면 더 많은 인내심과 연습이 필요합니다.</li>
	<li>절단된 객담 샘플을 8개의 챔버가 있는 커버글라스 슬라이드의 우물 안에 넣습니다.</li>
	<li>300단계에서 필터 멸균 하이드로겔 용액 2.2μL를 객담이 포함된 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>혐기성 팩이 들어 있는 밀폐된 용기 안에 8개의 챔버 커버글라스를 37°C에서 3시간 동안 보관합니다. 알림: 일단 중합되면 가래가 내장된 하이드로겔은 단단한 겔의 농도여야 합니다.</li>
	<li>응고된 하이드로겔 객담 샘플을 pH 8의 8% 도데실 황산나트륨(SDS) 5mL가 들어 있는 15mL 배양 튜브로 옮기고 가래가 투명해질 때까지 37°C(흔들림 유무에 관계없이)에서 3-14일 동안 샘플을 투명하게 둡니다. 알림: 청소 시간은 객담 성분에 따라 다르며 일반적으로 흔들면 줄일 수 있습니다. 그러나 샘플 무결성을 방해할 정도로 진탕 속도를 높이지 않도록 주의하십시오. DNA가 풍부한 샘플은 점액이 풍부한 샘플에 비해 투명화하는 데 더 오래 걸립니다.</li>
	<li>8% SDS 용액을 폐기물 수거 용기에 디캔팅합니다. 멸균 핀셋을 사용하여 각 하이드로겔 포매 샘플을 멸균 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 50mL 코니컬 튜브 각각에 PBS 10mL를 추가하여 하이드로겔을 세척하고 용액을 30분에서 1시간 동안 그대로 두었다가 디캔팅합니다. 이것을 2배 더 반복하십시오. 알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 포함되지 않습니다. 과도한 체액과 상층액은 피펫으로 조심스럽게 제거합니다.</li>
	<li>세척된 시료를 0.01%(w/v)의 아지드화나트륨 및 1x RNase 억제제와 함께 4°C에서 PBS에 보관합니다.</li>
</ol>3. 하이드로겔 형광 in situ hybridization (FISH) 프로토콜
<ol><li>멸균 핀셋을 사용하여 보관 용액에서 하이드로겔 샘플을 제거하고 멸균 표면(예: 유리 슬라이드 또는 페트리 접시)에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>멸균 메스를 사용하여 하이드로겔을 ~ 1mm 두께로 자릅니다.</li>
	<li>하이드로겔 1mm 절편을 멸균 1.5mL 튜브 안에 넣습니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 1 mL 혼성 완충액 (25 % 포름 아미드, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.01 % SDS, 정제 및 탈 이온화 H2O)을 준비합니다.</li>
	<li>형광 표지된 PseaerA 프로브(150.7nM12)를 혼성화 버퍼에 추가하고 반전으로 혼합합니다. 알림: 포르말린 용액은 화염에서 멀리 떨어져 있어야 합니다. 혼성화 완충액은 고급으로 제조될 수 있고, -20°C에서 부분 표본으로 저장될 수있다 13.</li>
	<li>하이드로겔의 각 ~1mm 섹션에 200-500μL의 혼성화 완충액을 추가하고 하이드로겔 샘플 전체가 잠기도록 합니다.</li>
	<li>PseaerA 프로브가 흔들리지 않고 46°C에서 ~ 18-24시간 동안 어둠 속에 두어 하이드로겔 샘플과 하이브리드화되도록 합니다.</li>
	<li>혼성화 완충액을 폐기물 수거 용기에 디캔팅합니다.</li>
	<li>필터 멸균 세척 완충액 (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) [pH 7.2], 0.01 % SDS)로 샘플을 한 번 헹구고 1.5 mL 튜브 각각에 세척 완충액 1mL를 첨가하여 정제 및 탈 이온화 된 H2O)를 제거한 다음 제거합니다. 알림: 세척 버퍼는 미리 만들어 실온(RT)에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>1mL의 신선한 세척 완충액을 튜브에 넣은 다음 어두운 곳에서 48°C에서 6시간 동안 흔들지 않고 샘플을 배양합니다.</li>
</ol>4. 하이드로겔 및 Psl0096 항체 결합
<ol><li>1mL 피펫터를 사용하여 세척 버퍼를 멸균 상태로 제거합니다.</li>
	<li>2% BSA 용액 1mL를 추가 및 제거하여 PBS 용액에서 2% BSA(w/v)로 샘플을 헹굽니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플에 2% BSA/PBS 용액 500μL를 첨가하여 비특이적 단백질 결합을 차단합니다. 그런 다음 샘플을 밤새 어두운 곳에서, 흔들지 않고 RT에서 배양합니다.</li>
	<li>1mL 피펫을 사용하여 차단 용액을 멸균 제거합니다.</li>
	<li>항체를 500μL의 신선한 2% BSA/PBS에 최종 농도 0.112μg/mL로 희석하여 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 준비합니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플에 500μL 항체 용액을 추가하고 흔들리지 않고 빛으로부터 보호된 상태에서 실온에서 6시간 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. DAPI(4′,6′-diamidino-2-phenylindole) 염색
<ol><li>자기 교반 막대가 들어 있는 플라스크에 비이온 밀도 그래디언트 배지 40g, Tween20 30μL, 아지드화나트륨 3μg, PBS 30mL를 첨가하여 굴절률 매칭 용액(RIMS)을 준비합니다. 용액을 자석 교반기에서 15분 동안 또는 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.</li>
	<li>10mL 주사기와 멸균 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 50mL 원뿔형 튜브로 필터 멸균합니다. 참고: 용액은 4°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 1mL 피펫으로 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 제거합니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플을 헹구고 PBS 1mL를 추가한 다음 제거합니다.</li>
	<li>하이드로겔 샘플을 250μL의 RIMS 용액과 10μg/mL의 DAPI로 RT에서 어둠 속에서 밤새 부드럽게 흔들어 배양합니다.</li>
	<li>컨포칼 이미징 전에 샘플을 0.9mm 또는 1.7mm 관류 챔버에 장착하고 유리 커버슬립으로 밀봉합니다. 참고: FISH 및/또는 면역조직화학 검사 후 RIMS에 담그기 전, 객담 점액의 시각화가 필요한 경우 형광 렉틴 염색을 적용할 수 있다12.</li>
</ol>6. 이미징
<ol><li>표준 기술을 사용하여 25x, 40x, 63x 또는 100x 배율에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미징을 수행합니다.</li>
</ol>

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</ol>

이 프로토콜의 목적은 CF 환자의 객담에서 녹농균 세포의 현장 조직을 엿볼 수 있도록 하는 것입니다. 객담 샘플은 즉시 고정할 수 없는 경우 처리할 때까지 4°C에서 보관해야 합니다. 객담 내 녹농균(P. aeruginosa) 세포 수는 4°C에서 보관할 때 1시간, 24시간 또는 48시간에 처리하면 크게 변하지 않지만, 25°C에서 24시간 또는 48시간 동안 방치하면 박테리아 성장의 결과로 박테리아 세포 수가 크게 증가한다는 것이 입증되었다14. 이 연구를 위해 객담 샘플은 객담 후 최대 24시간까지 4°C에서 보관되었습니다. 염증 세포 수는 4 °C에 두었다가 9시간 이상 후에 처리하면 객담이 감소하는 것으로 나타났다는 점에 유의해야 한다15. 따라서 시료 처리를 위한 마감 시간을 결정할 때 객담에서 시각화하려는 특정 세포와 마커를 고려하는 것이 중요합니다.
<p class="jove_content"...

이 연구에서 실험은 소아 낭포성 섬유증(CF) 환자의 객담 내에서 녹농균의 생체 내 구조를 시각화하도록 설계되었습니다. 녹농균 감염은 소아 CF 인구의 30-40%에서 만성화됩니다. 만성 감염이 발생하면 제거가 거의 불가능합니다1. 녹농균은 일반적으로 항균제에 더 취약하기 때문에 만성 감염을 예방하기 위해 항슈도몬 항생제로 치료한다2. 안타깝게도, 모든 녹농균 분리가 항생제 치료 후 폐에서 효과적으로 제거되는 것은 아닙니다. 항생제 실패와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 생물막 세포 밀도, 응집 및 다당류 생산의 변화가 항생제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다3. 녹농균(P. aeruginosa)은 펠(Pel), 피슬(Psl), 알긴산(alginate)의 세 가지 세포외 다당류를 생산합니다4. 녹농균(P. aeruginosa)의 대부분의 균주는 각 외다당류를 발현할 수 있는 유전적 능력을 가지고 있지만, 종종 한 종류의 다당류가 주로 발현된다5. 엑소다당류 알긴산은 CF 폐의 만성 감염과 관련이 있으며, 점액성 표현형 6,7을 초래합니다. 다당류 Pel과 Psl은 초기 부착 및 생물막 구조 유지를 돕고 항생제 내성을 부여하는 등 여러 기능을 가지고 있습니다8.
조직의 생체 내 구조를 시각화하는 것을 목표로 하는 방법은 다양한 샘플 유형 9,10,11에 대해 개발되었습니다. 최근에는 CF 환자의 객담 내 생체 내 미생물 군집을 시각화하도록 맞춤화되었습니다12. 객담 내 미생물 군집 식별을 위한 조직 투명화 프로토콜의 최적화는 DePas et al., 201612에 의해 개발되었습니다. Pa ssive CLARITY technique 이후 microbial identification의 약자인 MiPACT라는 용어는 CF 가래11,12의 제거를 위해 만들어졌습니다. 조직 투명화 기법의 경우, 표본을 먼저 고정한 다음 투명하게 렌더링하면서 염색 및 현미경 시각화를 위해 고유한 구조를 그대로 유지합니다11. CF 객담 샘플을 고정하고 투명화하면 생물막 구조, 박테리아 세포 밀도, 다균 결합, 병원체와 숙주 세포 간의 연관성과 관련된 질문에 답할 수 있습니다. 객담 내에 보존된 박테리아를 직접 검사하는 것의 장점은 숙주별 맥락에서 분석하고 시각화할 수 있다는 것입니다. 실험을 위해 실험실에서 임상 분리체의 체외 성장은 매우 유익할 수 있지만, 이러한 방법은 CF 폐 환경을 완전히 재현할 수 없으므로 실험실 결과와 환자 결과 사이에 단절이 발생합니다.
여기에 제시된 방법은 CF 환자나 다른 호흡기 감염 환자의 박테리아를 시각화하기 위해 객담을 고정하고 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 본 명세서에 기술된 염색 및 현미경 분석의 특정 유형은 형광 in situ hybridization(FISH), 하이드로겔 내 항-PSL 항체 결합, 그리고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 통한 후속 분석이다. 조직 투명화 후 다른 면역조직화학 및 현미경 검사법도 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>29 : 1 아크릴 아미드 bisacrylamide, 30 % 용액</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8 챔버 커버 글라스 Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>커버웰 관류 챔버</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Rnase 억제제</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>주문 세부 정보: 제품: Modified DNA Oligo; 이름: PseaerA; 순서: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; 합성: 50 nmol; 정화 : HPLC; 선박 상태: 완전 수율(건조)</td></tr><tr><td>Psl0096-텍사스 레드</td><td>메드면역</td><td></td><td>Psl0096-텍사스 레드 항체는 메드이뮨에서 친절하게 제공한 선물로 주문 문의는 회사에 연락해야 합니다.</td></tr><tr><td>VA-044 경화제</td><td>와코</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

낭포성 섬유증 환자의 폐 내에서 녹농균을 조기에 발견하고 근절하면 만성 감염 발병 가능성을 줄일 수 있습니다. 만성 녹농균 감염의 발병은 폐 기능 저하 및 이환율 증가와 관련이 있습니다. 따라서 소아 환자의 약 10-40%에서 발생하는 항생제 요법으로 녹농균을 근절하지 못하는 이유를 밝히는 데 큰 관심이 있습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 숙주 청소율과 항생제 감수성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인 중 하나는 공간 조직(예: 응집 또는 생물막 형성) 및 다당류 생산의 변화입니다. 따라서 CF 환자의 객담 내에서 녹농균의 현장 특성을 시각화하는 데 관심이 있었습니다. 숙주 세포에 대한 3D 구조를 유지하기 위해 샘플을 하이드로겔 매트릭스에 삽입한 후 객담 샘플에 조직 투명화 기술을 적용했습니다. 조직 투명화 후 형광 라벨과 염료를 추가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 박테리아 세포의 시각화를 위해 형광 in situ 교잡화를 수행하고, 외다당류의 시각화를 위해 형광 표지된 항-PSL 항체의 결합을 수행하고, 구조적 통찰력을 얻기 위해 숙주 세포를 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행했습니다. 이러한 방법을 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 CF 환자의 객담 내 녹농균의 고해상도 이미징을 수행할 수 있었습니다.

실험의 전체 설계는 그림 1 과 그림 2에 요약되어 있습니다. 그림 1 은 객담 처리 및 객담 제거 프로토콜에 대한 요약을 제공합니다. 객담 처리 및 청소에는 최대 17일이 소요될 수 있습니다. 그러나 프로토콜은 중단될 수 있으며 샘플은 PFA 고정 후(2일) 또는 조직 투명화 후(투명 시간에 따라 5-17일) 보관할 수 있습니다. 그림 2에는 FISH와 항체 결합 프로토콜이 요약되어 있습니다. FISH 및 항체 염색 프로토콜은 완료하는 데 4일이 소요되지만 완료되면 완료하고 컨포칼 이미지를 촬영해야 합니다. 위의 프로토콜을 사용하면 녹농균 세포의 고해상도 3D 이미지를 객담 내 in-situ 구조로 시각화하여 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용된 ...

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

이 프로토콜은 낭포성 섬유증 가래 내에서 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 외다당류 Psl을 직접 시각화할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 응집 또는 생물막과 같은 녹농균의 공간적 조직이 숙주 제거율 및 항균 감수성에 어떤 영향을 미치는지에 대한 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 가래를 주입하기 전에 최대 24시간 동안 섭씨 4도의 멸균 수집 컵에 보관하십시오.샘플을 고정할 준비가 되면 멸균 15ml 튜브로 옮기고 동일한 부피의 4%PFA를 추가한 다음 섭씨 4도에서 밤새 가래를 배양합니다. 고정된 가래 2ml당 PBS 5ml를 추가하여 샘플을 세척합니다. 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거하고 세척을 두 번 더 반복합니다.0.01% 아지드화나트륨으로 PBS 부피의 두 배에 펠릿을 재현탁시키고 섭씨 4도에서 보관합니다. 밀봉된 혐기성 용기 내부의 캡을 벗긴 상태에서 3밀리리터 튜브에 30%29 대 1개의 아크릴아미드/비스아크릴아미드 용액 2ml를 추가한 다음 3밀리리터 튜브에 있는 PBS 2밀리리터에 경화제 0.5g을 추가합니다. 튜브에서 캡을 벗어두고 밀봉된 혐기성 용기에 보관하십시오.혐기성 용기 내부의 캡을 제거한 상태로 튜브에 몇 밀리리터의 멸균 PBS를 남겨 둡니다. 밀봉된 용기에 담긴 하이드로겔 성분을 혐기성 팩으로 72시간 동안 가스를 제거합니다. 15 밀리리터 튜브에 PBS에 0.2% 경화제와 4% 아크릴아미드/비스아크릴아미드의 최종 농도를 가진 2.5 밀리리터의 하이드로겔 용액을 만들고 하이드로겔을 반전으로 혼합한 다음 용액을 여과 살균합니다.메스로 가래 샘플을 두 개의 작은 부분으로 자른 다음 각 샘플을 8개의 챔버로 덮인 유리 슬라이드의 우물에 넣습니다. 가래가 들어 있는 각 웰에 필터 멸균 하이드로겔 용액 300마이크로리터를 넣고 혐기성 팩이 들어 있는 밀폐된 용기에 넣어 섭씨 37도에서 3시간 동안 보관합니다. 응고된 하이드로겔 객담 샘플을 pH 8에서 8% SDS 5밀리리터가 있는 15ml 배양 튜브로 옮기고 객담이 투명해질 때까지 섭씨 37도에서 3-14일 동안 샘플을 투명하게 합니다.멸균 핀셋을 사용하여 각 하이드로겔 내장 샘플을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 10ml의 PBS를 추가하여 하이드로겔을 세척합니다. 디캔팅하기 전에 용액을 30-60분 동안 그대로 두었다가 두 번 더 세척을 반복합니다. 세척된 샘플을 0.01% 아지드화나트륨 및 RNase 억제제가 포함된 PBS에 섭씨 4도에서 보관합니다.보관 용액에서 하이드로겔 샘플을 제거하고 샘플을 멸균 표면에 놓습니다. 멸균 메스를 사용하여 하이드로겔을 약 1mm 두께의 조각으로 자르고 단면을 1.5ml 튜브에 넣습니다. 1.5 밀리리터 튜브에 1 밀리리터의 혼성화 완충액을 준비한 다음 형광 표지된 Seer A-프로브를 추가하고 반전으로 혼합합니다.각 섹션에 200-500마이크로리터의 혼성화 완충액을 추가하여 하이드로겔 샘플 전체가 물에 잠기도록 합니다. Seer A-프로브가 하이드로겔 샘플과 혼성화되도록 합니다.amp흔들림 없이 섭씨 46도에서 약 18-24시간 동안 어둠 속에 두었습니다., 그런 다음 튜브에 1ml의 신선한 세척 버퍼를 추가하고 섭씨 48도에서 6시간 동안 어둠 속에서 배양합니다. 하이드로겔 샘플에 500마이크로리터의 2%BSA 및 PBS를 첨가하여 비특이적 단백질 결합을 차단한 다음 어둠 속에서 밤새 샘플을 배양합니다.다음 날, PBS에서 500 마이크로 리터의 신선한 2 % BSA에서 항체를 밀리리터 당 0.112 마이크로 그램의 최종 농도로 희석하여 Psl0096-Texas Red 항체 용액을 준비합니다. 하이드로겔 샘플에 항체 용액을 첨가하고 어두운 곳에서 6시간 동안 배양합니다. 다음으로, 하이드로겔 샘플을 250마이크로리터의 RIM 용액과 밀리리터당 10마이크로그램의 DAPI로 밤새 부드럽게 흔들어 배양하여 염색합니다.염색 후 샘플을 0.9 또는 1.7mm 관류 챔버에 장착하고 유리 커버슬립으로 밀봉합니다. 25배, 40배, 63배 또는 100배 배율로 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 수행합니다. 이 프로토콜은 녹농균 세포와 가래 내 NC2 구조의 고해상도 3D 이미지를 얻는 데 사용되었습니다.가래 샘플 내의 세포 응집체가 여기에 나와 있습니다. 개별 막대 모양은 Seer A-488 프로브가 P.aeruginosa 세포에 종 특이적으로 결합되어 녹색으로 보였습니다. Psl0096-Texas Red 항체는 객담 내 슈도모날 외다당류가 녹농균 세포와 대부분 겹친다는 것을 보여줍니다.이 방법은 또한 다른 박테리아 세포 및 숙주 구조와 관련하여 가래 내의 Pseudomonal 세포를 시각화하는 데 사용되었습니다. 녹농균(P.aeruginosa) 세포의 클러스터는 진핵 세포 내에서 식세포작용(phagocytose)하는 것으로 관찰되었으며, 다른 작은 구균 세포 클러스터는 인근에서 관찰되었습니다. 또한 PSL 0096 항체가 플랑크톤 P.Aeruginosa에서 생성된 PSL에 결합할 수 있음이 입증되었습니다.이 기술의 주요 장점은 형광 현장 혼성화, 항체 염색 및 컨포칼 현미경 검사에 이어 조직 정화 접근 방식을 구현한다는 것입니다. 이를 통해 연구원들은 이미지 처리 기술을 시각화하고 사용하여 환자의 건강 결과와 관련하여 CF 가래 내 녹농균 집락화 구조의 차이를 정량적으로 측정할 수 있습니다.

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현재 진단 항균 자화율 테스트는 영양소 풍부한 호기성 조건에서 분리의 planktonic 성장에 의존하고 있습니다. 여기서는 낭성 섬유증의 폐 더 많은 대표적인 두 에어로빅과 microaerophilic 조건에서 녹농균의 biofilms의 항균 자화율 공부를 대체 인공 가래 매체를 사용합니다.

위반 항생제 효능을 테스트하는 인공 가래 매체의 사용<em&gt; 녹농균</em&gt; 낭성 섬유증의 폐 관련성이 높은 조건에서

출처: Beaudoin, T. 외 챔버 커버글라스 모델을 이용한 가래가 바이오필름 형성에 미치는 영향을 시각화하기. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 환자 유래 낭포성 섬유증 가래가 박테리아 바이오필름 형성에 미치는 영향을 평가하는 시험관 내 방법을 시연합니다. 챔버 슬라이드, 형광 염색, 공초점 현미경을 사용하여 가래로 성장한 바이오필름에서 두께 증가, 구조 변화, 생존 가능한 바이오매스 증가를 밝혀내어 숙주 구성 요소가 바이오필름 발달에 미치는 역할을 강조합니다.

낭포성 섬유증 환자의 가래에 의해 유도된 박테리아 바이오필름의 공초점 영상

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

이 프로토콜은 슬라이드 챔버 모델을 사용하여 숙주 인자에 노출된 후 생물막 발달의 시각화를 설명합니다. 이 모델을 사용하면 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 생물막 매개변수를 분석할 뿐만 아니라 생물막 개발을 직접 시각화할 수 있습니다.

챔버의 coverglass 모델을 사용하여 바이오 필름 개발에 객담의 효과를 시각화

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

이 워크플로우는 낭포성 섬유증을 가진 개별의 폐에 있는 세균성 생물막의 확립된 ex vivo 모형을 사용하여 항생제 감수성 시험을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 모델의 사용은 MBEC의 임상 타당성을 향상시킬 수 (최소한의 생물 막 박멸 농도) 에세이.

낭포성 섬유증 폐에 있는 슈도모나스 아에루기노사 및 황색포도상구균 생물막의 Ex vivo 모형에 있는 항생제 효능 시험

합성 낭포성 섬유증 가래 배지(SCFM2)는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 및 형광 활성화 세포 분류와 함께 사용하여 고해상도에서 세균 응고체를 관찰할 수 있다. 이 논문은 향후 연구를 위한 플랫폼으로서 항균 치료 중 집계 인구를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

슈도모나스 아에루기노사 감염 모델의 실시간 평가를 위한 도구

이 프로토콜은 슬라이드 제작, 염색 및 해석의 3단계를 포함한 빠르고 표준화된 미생물학 신속 현장 평가(M-ROSE) 워크플로우를 보여줍니다. 이 프로토콜은 의사가 신속한 임상 결정을 내리는 데 도움이 됩니다.

폐 감염성 질환에 대한 미생물 신속 현장 평가

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

이 방법론을 통해 연구 및 임상 실험실에서 항균성 감수성 테스트를 위해 낭포성 섬유증에서 다미생물 생물막 모델을 구축할 수 있습니다. 이 모델은 다양한 출력에 걸쳐 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다.

낭포성 섬유증에서 항균제를 테스트하기 위한 다미생물 집락 생물막 모델 개발

배우세요 낭포성 섬유증 환자 객담에서 Pseudomonas aeruginosa와 Psl 다당류를 시각화하는 방법을. 이 기법은 세균의 공간적 구조와 항생제 내성을 연구하는 데 활용됩니다.

낭포성 섬유증 환자의 객담 내 녹농균의 시각화

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