Name: 혈액 유래 신경 세포의 GM 무료 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 유전자 변형 없이 말초 혈액 세포에서 신경 세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 재생 의학에서 안전한 임상 적용을 위한 비종양성 줄기세포를 제공합니다.

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라이너 사프리치 박사의 기억력에 전념합니다.
저자는 특히 호세 마누엘 가르시아 베르두고와 비센테 헤르란츠-페레즈가 비교 신경생물학 연구소, 생물 다양성 및 진화 생물학 연구소, 발렌시아 대학, CIBERNED, 발렌시아, 스페인에서 EM 실험 및 분석을 수행한 것에 대해 특히 감사하고 있으며, 이는 Prometeo Grant의 연구 자금 지원으로 지원되었다. 이 작품의 나머지 는 ACA 셀 생명 공학 GmbH 하이델베르크, 독일에 의해 지원되었다.

실험을 수행할 때 윤리 승인을 얻었다.
1. 인간 말초 혈액 단핵 세포의 분리 (PBMC)
<ol><li>모든 기부자가 기관 지침에 따라 혈액을 철회하기 전에 정보에 입각한 동의서에 서명하도록 하십시오.</li>
	<li>표준 프로토콜에 따라 숙련 된 의료 인력에 의해 건강한 기증자로부터 30 mL의 혈액을 가져 가라.</li>
	<li>밀도 그라데이션 미디어를 통해 PBMC를 분리합니다. 인산염 완충식염(PBS)으로 희석된 1:1 혈액의 25mL, 30분 동안 300 x g의 원심분리기를 사용하여 10mL의 미디어를 사용하십시오.</li>
	<li>파이펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 위상 간 층을 분리합니다. 멸균 PBS와 원심분리기의 5mL로 10분 간 300 x g로 세척합니다.</li>
	<li>카운팅 챔버를 사용하여 표준 방법으로 셀 수를 계산합니다.</li>
</ol>2. PBMC의 표면에 교차하는 항체에 의한 인간 GPI 고정 당단백질의 활성화
<ol><li>6 x 106 단핵세포(MNC)를 15mL 튜브에 배치하고 37°C에서 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 가진 PBS에서 30분 동안 인간 GPI 연결 막 단백질 특이적 항체(30 μg/mL)를 가진 세포를 배양하여 항체 교차 연결을 수행한다.</li>
	<li>10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 이스코브의 수정된 덜벡코의 배지로 인큐베이션 배지를 교체하십시오.</li>
	<li>15mL 폴리스티렌 튜브에서 세포를 성장시키고, 튜브를 37°C, 8-10일 동안 5%CO2로 인큐베이터에 넣습니다(흔들림 없이). D5에, 각 15 mL 튜브에 10 % FBS로 보충 이스코브의 매체의 추가 1-2 mL을 추가합니다.</li>
</ol>3. 새로 생성된 분화 세포의 정렬
<ol><li>자동 세포 카운터(18 μL 셀 서스펜션 + 2 μL 형광 염료) 또는 카운팅 챔버를 가진 셀수를 계산합니다.</li>
	<li>원심분리기 배양 셀 서스펜션(5-7 x 106)은300 x g에서 10분 동안 멸균 파스퇴르 파이펫으로 생성된 슈퍼네티트를 흡인시합니다.</li>
	<li>미리 냉각된 PBS pH 7.2, 0.5% BSA 및 2mM EDTA의 90 μL에서 셀 펠릿을 다시 중단한다.</li>
	<li>CD45 양성 나노 크기의 마그네틱 비즈(80 μL)를 세포 현탁액에 넣고 얼음에 15분 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS 버퍼 와 원심분리기의 2mL를 300 x g에서 10 분 동안 추가하여 세포를 씻으하십시오.</li>
	<li>PBS 버퍼의 500 μL에서 셀을 다시 일시 중단합니다.</li>
	<li>미리 냉각된 PBS 버퍼500μL로 컬럼을 세척하고 자기장에 놓습니다.</li>
	<li>셀 서스펜션을 기둥에 놓고 500 μL의 PBS 버퍼(2회)와 CD45 네거티브 셀을 함유한 원심분리기 흐름으로 세척한다. 1% BSA로 보충된 이스코브의 매체에서 수집합니다.</li>
	<li>카운팅 챔버의 셀을 계산합니다.</li>
</ol>4. 새로 생성된 줄기 세포의 신경 분화를 위한 세포 배양 접시 준비
<ol><li>성장 하는 신경 세포를 위한 폴리 L-ornithine 및 라미닌배양 혈관을 코팅.</li>
	<li>유리 커버립을 4웰 플레이트에 넣고 ddH2O.에서 1:5 희석 된 폴리 L-ornithine (0.1 mg / mL in ddH2O)로 코팅하여 커버립을 37 °C 인큐베이터에 1 시간 동안 배치합니다. 그런 다음 ddH2O로 씻으시다.</li>
	<li>천천히 라미닌 (0.5-2.0 mg /mL)을 해동하고 커버립의 상단에 추가합니다. 2 시간 동안 37 °C에서 배양하십시오.</li>
	<li>D-MEM/F12의 49mL, N2 보충제의 500 μL, 비필수 아미노산(NEAA)의 400μL, 기본 FGF 용액 20 ng/mL 최종 농도(100μg/mL 스톡 용액에서 제조), 그리고 2ng/mL 농도로 구성된 신경 유도 매체 N2를 준비한다.</li>
	<li>파이펫팅으로 과도한 라미닌을 제거하고 배양 요리에 뉴런 배지 N2를 추가하십시오.</li>
</ol>5. 신경 분화 혈액 세포의 배양
<ol><li>배양 BD 유래 CD45 네거티브 셀은 라미닌/오르니틴 코팅 유리 커버립을 2일 동안 인큐베이터에서 37°C, N2 배지에서 5%CO2로 분리하여 새로 BD 생성 된 세포의 뉴런 분화를 개시한다.</li>
	<li>배양 세포는 신경 물질 배지 48mL, L-글루타민 500 μL, B27 보충제 1mL, NEAA 500 μL, 재조합 인간 신경교에서 유래한 신경영양계수(GDNF) 5μg/250 μL로 구성된 뉴런 분화 배지에서 더 많은 BS%에서 1μg/250 μL, BS%에서 150 μL/250 μL로 구성된 세포 PBS/0.1% BSA및 아스코르브산 용액 의 50 μLPBS에서 5 μg/200 μL에서 재조합 인간 뇌 유래 신경 영양인자(BDNF)의 50 μL 및 PBS에서 아스코르브 산 용액 2.9 g/50 mL의 50 μL. 플레이트를 인큐베이터에 37°C 및 5% CO2로놓습니다.</li>
</ol>6. 혈액 유래 신경 세포의 면역 형광 현미경 분석
<ol><li>위에서 설명한 바와 같이 세포를 16일 동안 배양하고 미디어를 제거한다.<ol>
<li>멸균수 75mL, 파라포름알데히드 4g으로 구성된 사전 데운 고착처리된 인큐베이션을 증식합니다. 필요에 따라 10 N NaOH를 추가하고 용액이 지워날 때까지 저어줍니다. 그런 다음 10x PBS 10mL, MgCl2mL 0.5mL, 0.5M EGTA 2mL, 자당 4 g를 추가합니다. 6 N HCl로 pH 7.4에 titrate, 15 분 동안 멸균 수의 100 mL에 가져, 마르첸코 등7. 7.</li>
		<li>고정을 버리고 매번 5 분 동안 세포를 3 번 씻으십시오. 즉시 새로 만든 0.3 % 트리톤 X 용액을 추가하고 5 분 동안 세포를 permeabilize. PBS로 3번 세척하고 PBS및 5% BSA로 만든 블로킹 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>로커 플레이트의 실온에서 셀을 1시간 동안 차단합니다.</li>
		<li>1% BSA/PBS에서 항체의 적절한 희석을 준비하고 실온에서 1.5 시간 동안 로커 플레이트에 항체 희석으로 세포를 배양한다. 각각 5 분 동안 PBS로 세포를 3 번 세척하고 DAPI로 세포를 배양하고 현미경에 시각화를위한 장착 매체로 커버립을 장착하십시오. 참고: 본 실험에 사용된 직접 표지된 항체는 재료표에기재되어 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 새로 생성된 세포의 전송 전자 현미경 분석
<ol><li>8웰 챔버 슬라이드에서 TEM에 대한 세포를 시드합니다.</li>
	<li>37°C에서 1시간 동안 3.5% 글루타랄데히드로 세포를 고정하고, 실온에서 2% OsO4에서 2% 후고리, 2시간 30분 동안 어둠 속에서 2%의 우란 아세테이트를 2% 소변을 드린 후 수정한다.</li>
	<li>마지막으로, 증류수에 세포를 헹구고 에탄올에 탈수하고 하룻밤 에폭시 수지에 담근다. 다음 날 수지 경화에 대해 72h의 시료를 70°C 오븐으로 옮기다.</li>
	<li>임베디드 세포 배양을 챔버 슬라이드및 접착제에서 아랄디테 블록으로 분리합니다.</li>
	<li>기계로 직렬 반박형 섹션(1.5 μm)을 자르고, 유리 슬라이드에 장착하고, 1% 토루이딘 블루로 가볍게 얼룩을 감습니다.</li>
	<li>접착제는 반박면을 선택하여 아를디테 블록을 차단하고 유리 슬라이드에서 분리하여 반복된 동결(액체 질소)과 해동을 반복합니다.</li>
	<li>기계로 초박형 섹션(0.06-0.08 μm)을 준비하고 납 구연산염과 더욱 대조를 이룹니다.</li>
	<li>디지털 카메라로 전자 스캐닝 현미경을 사용하여 현미경을 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine%3A+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).</li>
<li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neural+stem+cells%3A+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li>
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<li>Becker-Kojić, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Technologies+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li>
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<li>Melková, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c%3A+Similarities+and+Differences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105(2019).</li>
<li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li>
<li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin-expressing+progenitor+cells%3A+function%2C+identity+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li>
</ol>

해당 저자는 그녀가 소설 인간 GPI 연결 단백질과 관련된 특허 보유자뿐만 아니라 그녀가 공동 설립및 ACA CELL 생명 공학에 대한 작동한다고 선언합니다. 다른 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.

본 업무에서 기재된 인간 세포를 재프로그래밍하는 비GM 방법은 비조작된 인간 말초 혈액으로부터 얻은 전 생체 생성 및 자가 갱신 PSC의 확장으로 이어지는 비분화 과정을 개시하는 GPI 연계 인간 막 당단백질 의 뒤에 있는 신호(들) 기계류의 핵 활성화에 기초한다. 이러한 세포는 적절한 배지에서 배양될 때 상이한세균층(6)에속하는 세포로 재분화할 수 있다.
이 작품에서 제시된 데이터는 신경 분화 매체에서 배양할 때 GM이 없는 생성된 BD-PSCs 세포가 완전히 다른 표현형을 획득했다는 것을 보여줍니다, 길쭉한 모양으로, 그들의 세포기관의 더 높은 발달및 세포 사이 더 복잡한 상호 작용을 설치하. 더욱이, 여기에 설명된 조건을 사용하여 재분화, 다양한 신경 혈통을 향한 신경 분화를 의미한다.
재분화 연구에서 사용하기 위해 최적의 수와 재프로그래밍 된 세포의 최고 품질을 얻...

기본 및 전임상 줄기 세포 연구 방법의 개발은 신경 질환에 대한 줄기 세포 기반 치료의 임상 적용을 장려합니다. 이러한 잠재적 치료는 기능적 회복1로이어지는 인간 신경 세포의 생성 방법에 비판적으로 의존한다.
신경 줄기 세포 (NSC) 자체 갱신 하 고 성인 신경 발생 이라고 하는 프로세스에 평생 새로운 뉴런으로 분화. 만 매우 제한 된 뇌 영역 은 성인기에 신생아 뉴런을 생성 할 수있는 NsCs를 항구. 이러한 NSC는 학습과 메모리에 관여하는 성숙한 뉴런을 초래할 수 있으므로 분실되거나 손상된 뉴런을 대체할 수 있습니다. 불행하게도, 이러한 NSC는 제한된 양에 존재하고이 제한된 신경 발생은 청소년 발달 동안 급속하게감소2. 따라서 신경 세포의 다른 소스는 세포 치료 목적으로 고려되어야합니다.
퇴행성 신경 질환은 표준 약리학적 접근법을 사용하여 치료하기가 어렵습니다. 많은 치료 신경 장애를 수용 하기위한 새로운 치료 전략은 질병과 부상 조직의 세포 대체 요법에 기초. NSC 이식은 손상된 세포를 대체하고 유익한 효력을 제공할 수 있었습니다. 신경세포 교체를 위한 그밖 근원은 포유류 분폭물3의내세포 질량에서 파생되는 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 및 ESC 같이 광대한 자기 갱신 능력을 가지고 있고 각종 세포 혈통으로 분화할 수 있는 iPSCs4를포함합니다. 또한 만능 상태5를피하는 인간 섬유아세포로부터 직접 리프로그래밍하여 NSC를 생성할 수 있다.
세포 대체 요법은 여전히 어려운 문제입니다. ESC, 태아 또는 iPS는 많은 난치성 신경 질환을 치료하기위한 신경 세포의 세대에 대한 소스가 될 수 있지만 손상된 조직의 자가 성 성인 SCs 세포 교체는 면역학적, 윤리적 및 안전 문제를 우회하는 더 나은 대안입니다.
PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN의 인산화를 통해 항체-교차연결에 의한 인간 GPI 연계 단백질의 활성화는 혈액 전구 세포의 비차별화를 시작하고 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)6. 이 세포는 밝은 필드, 면역 형광 및 전염 전자 현미경 검사 (TEM) 분석을 통해 확인 된 바와 같이 신경 세포를 향해 시험관 내 분화.
이 작품에서 우리는 BD-PSC의 GM 없는 생성 및 그들의 성공적인 재 분화 신경 표현형을 가진 세포로 기술합니다.

<table><tbody><tr><td>알부민 분획 V</td><td>Roth</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3402C3</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB3418A5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB5326A4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUJ1 Alexa Fluor 488</td><td>BD Pharmingen</td><td>560381</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI 세포 생존도 키트</td><td>Biozym</td><td>872045</td><td>Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다.</td></tr><tr><td>아스코르브산, 2-인산염, 세퀴마그네스</td>, <td>시그마, 알드리치</td>, <td>A8960-5G</td><td></td>,</tr><tr><td>B27, 무혈청, 50x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11530536</td><td></td></tr><tr><td>기본 FGF 솔루션</td><td>, Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10647225</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll</td>, <td>Merck, Millipore</td><td>L6115-BC</td>, <td>밀도 구배 매체</td></tr>, <tr><td>BSA Frac V, 7.5%</td><td>Gibco</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>나노 크기 마그네틱 비드</td></tr><tr><td>세포 계수 슬라이드 Luna</td><td>Biozym</td><td>872010</td><td>Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다.</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드 Lab-Tek</td><td>Fisher Scientific</td><td>10234121</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F12</td><td>Merck Millipore</td><td>FG4815-BC</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44610</td><td>에폭시 수지</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>제품 생산 중단 TMS-013-B</td></tr><tr><td>GDNF 재조합 인간</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10679963</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>L-글루타</td></tr><tr><td>민 글루타르알데히드 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 세포</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Human BDNF</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11588836</td><td></td></tr><tr><td>Iscove (IMDM)</td> <td>Biochrom</td><td>FG0465</td><td></td></tr><tr><td>라미닌 마우스</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td> <td>10267092</td><td></td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15326-25G</td><td></td></tr><tr><td>Luna FL Automated Cell Counter</td><td>Biozym</td><td>872040</td><td>Biozym 단종 로고스 바이오시스템즈(Logos Biosystems)에서 생산한 제품입니다.</td></tr><tr><td>MACS 버퍼</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Trenns&auml; ulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Morada 디지털 카메라</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiplatte Nunclon 4 웰</td><td>Fisher Scientific</td><td>10507591</td><td></td></tr><tr><td>N2 보충제 100x</td><td>Fisher Scientific (Gibco)</td><td>11520536</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>PBS sterile</td><td>Roth</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue-3 Loctite</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td><td>FEI Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracut UC-6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate C</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

혈액 유래 신경 세포의 gm 무료 생성

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

많은 인간 신경 장애는 두뇌에 있는 신경 세포 및 신경교 세포의 변성에 기인합니다. 약리학 및 기타 치료 전략의 한계로 인해 현재 부상또는 병에 걸린 뇌에 사용할 수있는 치료법이 없습니다. 세포 교체는 신경 퇴행성 조건에 대한 유망한 치료 전략으로 나타납니다. 현재까지, 신경 줄기 세포(NSC)는 태아 조직, 인간 배아 세포(ES) 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 성공적으로 생성되었다. 변분화 과정은 다능성 줄기 세포의 생성으로 이어지는 새로운 인간 GPI 연결 당단백질의 활성화에 의해 시작되었다. 이러한 혈액 유래 만능 줄기 세포 (BD-PSC)는 밝은 필드와 면역 형광 현미경 검사법에 의해 나타난 바와 같이 신경 표현형을 가진 세포로 시험관내에서 분화한다. 전자 현미경 검사를 통해 이러한 세포의 초구조적 분석은 그들의 원시 구조뿐만 아니라 뉴런 형 형태와 세포 극성 특성을 확인합니다.

결과는 이 새로운 GM 자유로운 방법이 인간 게놈에 직접 행동하지 않고 그들의 가장 원시적인 상태로 혈액 전구 세포를 되돌릴 수 있다는 증거를 제공합니다.
앞서 우리는 이전에 GPI 연결 단백질 특정 항체 교차 연결이 PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN 강화 조절을 통해 WNT, NOTCH 및 C-Kit와 같은 고도의 발달 관련 유전자의 개시를 보여주었으며, 따라서 HSC의 세대와2세대,2세대, 최종PSC의2단계로 이어지는 비차별적 과정을 개시하는 것으로나타났다.
활성화된 MNC 배양은 CD45 마이크로비드를 사용하여 면역자기 분류를 실시하였다. 이 방법으로 다시 프로그래밍할 수 없는 성숙한 혈액 세포(예를 들어, CD45 양성 세포)는 컬럼상에 유지되었지만, 재프로그래밍된 세포(CD45 네거티브 셀)를...

우리는 유전자 변형되지 않은 (GM 무료) 방법을 제시하여 재프로그래밍 된 말초 혈액 세포에서 신경 표현형을 가진 세포를 얻습니다. 새로운 인간 GPI 연결 단백질에 연결 된 신호 경로의 활성화 인간의 다능 한 줄기 세포를 얻기 위한 효율적인 GM 무료 방법을 밝혀.

혈액 유래 신경 세포의 GM 무료 생성

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

프로토콜의 중요성은 핵 신호에 막에 의존하고 유도 된 만능 줄기 세포의 경우처럼 게놈에 직접 영향을 미치지 않습니다. 혈액 유래 만능 줄기 세포의 비 기질성 특성은 기술의 주요 장점이며, 다양한 재생 의학 분야에서 안전한 임상 적용에 적합합니다. 이 절차를 시연하는 것은 프로젝트 리더인 앤-카트린 쇼트 박사와 실험실의 실험실 조수인 옥사나 그리나크레입니다.PBMC를 분리하려면 PBS로 희석된 1대 1 혈액 25밀리리터를 밀도 그라데이션 미디어 10밀리리터에 추가하고 혼합물을 30분 동안 300배 G로 원심분리합니다. 파이펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 인터페이스 레이어를 분리합니다. 멸균 PBS와 원심분리기 5밀리리터로 10분 간 300회 G로 세척합니다.절차를 두 번 반복한 후, 카운팅 챔버를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 15 밀리리터 튜브에 6 x 10을 추가한 다음, 1%BSA로 PBS의 세포에 인간 GPI 연결 막 단백질 특이적 항체를 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양함으로써 항체 교차 연결을 수행합니다. 교차 연결 후, 10 %의 FBS로 보충 이스코브의 수정 된 덜벡코의 매체로 인큐베이션 매체를 교체합니다.15 밀리리터 폴리스티렌 튜브에서 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 흔들어주지 않고 인큐베이터에 넣음으로써 세포를 성장시십시오. 다섯 번째 날에는 이스코브 의 중간 크기의 1~2밀리리터를 15밀리리터 튜브에 10%의 FBS로 보충합니다. 계수 챔버를 가진 배양된 세포를 계산합니다.그런 다음 약 5 x 10x6세포의 세포 현탁액을 10분 동안 300배 G로 분리하고 멸균 파스퇴르 파이펫으로 생성된 슈퍼네티트를 흡인시한다. 0.5%BSA 와 2 밀리몰러 EDTAp7.2의 사전 냉각 된 PBS의 90 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단. 그런 다음 80 마이크로리터 CD-45 양성 나노 크기의 마그네틱 구슬을 세포 현탁액에 넣고 15분 동안 얼음에 배양합니다.세포를 세척하려면 PBS 버퍼와 원심분리기 2밀리리터를 10분 동안 300배 G로 추가합니다. PBS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 미리 냉각된 PBS 버퍼 500마이크로리터로 컬럼을 세척하고 자기장에 놓습니다.셀 서스펜션을 기둥에 놓고 PBS 버퍼 500 마이크로리터로 두 번 세척합니다. 1%BSA로 보충된 Iscove의 매체에서 세포를 수집하고 카운팅 챔버에 있는 세포를 계산합

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

이 방법은 마우스의 뇌에서 microvascular 내피 세포를 분리하고 불멸하게하다하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 뇌 조직, 소화 단계, 시딩하고 세포의 불멸화의 균질화부터 단계별로 절차를 설명합니다. 보통, 그것은 동질, 불후의 microvascular 내피 세포 라인을 얻기 위해 다섯 주 소요됩니다.

로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

이 동영상은 혈액 유래 만능 줄기 세포(BD-PSC)에서 신경 세포를 생성하는 기술을 보여줍니다. BD-PSC는 혈액 전구 세포를 재프로그래밍하여 얻습니다. 미분화 BD-PSC는 신경 유도 배지와 신경 분화 배지를 사용하여 세포 배양 기질로 코팅된 커버슬립에서 배양되어 신경 표현형을 가진 세포로의 분화를 유발합니다.

혈액 유래 만능 줄기 세포에서 신경 세포 생성

이 비디오는 성인 인간 진피 섬유아세포(aHDF)의 뉴런 생성을 보여줍니다. aHDF는 뉴런 전사 인자(neuronal transcription factor)와 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)에 대한 유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 재프로그래밍됩니다. shRNA는 뉴런 전사 억제인자(neuronal transcriptional repressor)의 발현을 억제하고, 뉴런 전사 인자(neuronal transcription factor)는 aHDF를 뉴런으로 분화하기 위해 유전자를 활성화합니다. 이러한 재프로그래밍된 aHDF는 성숙한 뉴런을 생성하기 위해 초기 및 후기 뉴런 변환 배지에서 배양됩니다.

인간 피부 섬유아세포 리프로그래밍을 통한 뉴런 생성

출처: Becker-Kojić, Z. A., et. al., 혈액 유래 신경 세포의 GM 프리 생성. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 형광 현미경 검사를 위해 재프로그래밍된 말초 혈액 세포에서 유래한 신경 세포를 준비하는 프로토콜을 보여주며, 면역 형광 이미징을 통해 뚜렷한 세포 유형과 발달 단계를 보여줍니다.

말초 혈액 유래 세포와 분화된 신경 세포의 면역형광 현미경 검사 

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

이 기사에서는 벤치탑 3D 현탁액 바이오리액터에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

배우세요 유전자 변형 없이 말초 혈액 세포에서 신경 세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 재생 의학에서 안전한 임상 적용을 위한 비종양성 줄기세포를 제공합니다.

혈액 유래 신경 세포의 GM 무료 생성

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