Name: 다이에이트/PARK-ATP1A3 근긴장전증에 대한 증상, 약리학적 마우스 모델을 확립하기 위해 삼투성 펌프의 이식 및 스트레스 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 배우세요 DYT/PARK-ATP1A3 근긴장전증 약리학적 마우스 모델을 삼투성 펌프와 뇌 캐뉼라 이식으로 확립하는 방법을. 운동 과제를 통한 스트레스 유도로 표현형을 유발하고 행동학적 특성 분석을 수행합니다.

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이 연구는 연방 교육 연구부 (BMBF DysTract to C.W.I.)와 뷔르츠부르크 대학 (Z2-CSP3 ~ L.R.)의 임상 연구를위한 학제 간 센터 (IZKF)에 의해 지원되었다. 저자들은 루이자 프리에스, 케알리 뢰름, 베로니카 센거, 하이케 멘젤과 기술 지원, 헬가 브룬너에게 동물 관리를 해준 것에 감사드립니다.

모든 절차는 동물의 치료 및 사용에 대한 해당 국제, 국가 및 /또는 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 독일 뷔르츠부르크의 레지에룽 폰 운테르프랑켄(Regierung von Unterfranken)의 현지 당국은 모든 동물 실험을 승인했다.
1. 삼투압 펌프프라이밍
참고: 이 단계는 수술 전에 적어도 48 시간 수행되어야 합니다. ALZET 삼투성 펌프는 펌핑 속도가 이식 전에 안정된 상태에 도달하도록 하기 위해 미리 채워야 합니다.
<ol><li>만성 관류에 원하는 용액을 미리 준비하십시오. 용매 및 에이전트가 삼투성 펌프 및 카테터와 호환되는지 확인합니다. 본 원에 대한 프로젝트의 경우, 10초 동안 실온 및 소용돌이에서 와베인의 10배 스톡 용액(-20°C에 저장)을 해동한다. 주의: 와베인은 독성이 있습니다: 장갑으로만 취급해야 하며 흡입을 피하기 위해 멸균 후드 아래에만 개방되어야 합니다.</li>
	<li>멸균 후드를 켜십시오. 후드를 후드 아래에 두기 전에 필요한 모든 악기와 재료를 소독하십시오.</li>
	<li>삼투압 펌프를 취급하기 전에 수술 용 장갑을 착용하십시오. 별도로 줄무늬와 소뇌의 펌프에 지정된 와베인 솔루션을 준비합니다. 참고: striatum용 펌프내용 용액의 농도는 소뇌에 지정된 펌프내용액의 농도에 비해 두 배가 되어야 한다는 점을 고려하십시오. 이는 줄무늬용 펌프가 이중 캐뉼라에 연결되어 있기 때문이며, 유량은 단일 캐뉼라에 연결되는 소뇌의 펌프와 동일합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 필요한 솔루션의 양을 계산합니다. 대량 전달 속도 (ko)= 차량 내에이전트의 대량 전달 속도 (Q) x 농도 (Cd) 본 프로젝트의 경우, 삼투성 펌프는 11.2 ng/h 또는 대조군에 대한 0.9% 식염수의 농도로 ouabain 용액으로 준비되고 채워졌습니다.</li>
	<li>10s용 와아베인 용액과 멸균 필터(즉, 0.22 μm 주사기-엔드 필터)를 각각의 솔루션에 대해 다른 필터를 사용하여 별도의 새로운 미세센트심분리기 튜브로 들어갑니다.</li>
	<li>유동 중재자(약 0.4g)와 함께 빈 삼투압 펌프의 무게를 측정합니다.</li>
	<li>멸균 여과 된 와베인 용액 또는 차량 용액으로 27 G 충전 캐뉼라 (바람직하게는 무딘 팁)로 1 mL 주사기를 채웁니다.</li>
	<li>주사기에서 모든 기포를 꺼내고, 삼투압 펌프를 똑바로 세워 펌프에 넣을 수 있으며, 캐뉼라를 펌프에 넣고 여분의 용액이 위에 나타날 때까지 천천히 저수지를 채웁니다 (펌프의 기포로 이어질 수 있기 때문에 빠른 충전을 피하십시오). 다음으로 흐름 중재자를 펌프에 삽입합니다(초과 솔루션이 맨 위에 표시되어야 합니다).</li>
	<li>흐름 중재자를 꺼내 (약 5mm), 조심스럽게 가위로 흰색 플랜지를 벗고 흐름 중재자에 비닐 튜브의 조각을 연결합니다. 카테터가 동물의 적절한 이동성을 허용하기 위해 약 2cm의 길이를 가지고 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>채워진 삼투질 펌프의 무게를 다시 한 번 계량하여 채워진 펌프와 빈 펌프 사이의 무게 차가 로드된 용액의 예상 중량과 일치하도록 합니다. 참고: 대부분의 수성 솔루션의 경우 이 중량은 마이크로리터의 부피와 동일합니다. 무게가 예상 된 부피에 해당하지 않는 경우 공기가 펌프 내부에 갇혀있을 수 있으며, 이를 비우고 다시 채워야합니다.</li>
	<li>펌프의 프라이밍을 위해 2mL 마이크로센트심분리기 튜브 2개, 줄무늬 튜브 1개, 소뇌를 위한 튜브 1개를 준비합니다.</li>
	<li>0.9% 식염수 용액으로 중간으로 채워진 마이크로센심심분리기 튜브에 펌프를 담급합니다. 카테터의 열린 끝을 침수하지 마십시오. 마이크로센트심분리기 튜브를 37°C에서 48시간 동안 열순환기에 넣어 이식 전에 펌프가 꾸준한 펌핑 속도에 도달하고 카테터가 예충되도록 하십시오.</li>
</ol>2. 캐뉼라 및 삼투성 펌프 이식
<ol><li>마우스 (남성, C57Bl/6N, 11-12 주)를 흡입 마취를 위해 설계된 챔버에 놓습니다. 이소플루란의 유량을 2-3%로 설정하고 산소의 유속량을 2L/min으로 설정합니다.</li>
	<li>마우스가 승인 된 프로토콜에 따라 깊이 마취 된 후 동물의 머리, 등목 및 뒷면의 근위 3 분의 1을 면도하십시오.</li>
	<li>동물을 스테레오테틱 프레임에 넣고 입체 계측기(이소플루란 유량 1.5-2%, 2 L/min 산소)용으로 설계된 마우스 마취 마스크를 통해 이소플루란으로 마취를 계속합니다.</li>
	<li>고무 팁이나 파열되지 않는 이어 바를 사용하여, 머리가 수평되는 것을 주의하여, 스테레오 테틱 프레임에 동물의 머리를 고정합니다.</li>
	<li>저체온증을 방지하기 위해, 동물 아래에 가열 패드를 배치, 직장 온도 프로브를 삽입하고 온도를 37 °C로 설정합니다. 각 눈에 안연고 한 방울을 사용하여 동물의 눈을 건조시키는 것을 방지하십시오.</li>
	<li>카프로펜 (5 mg/kg 체중)과 같은 진통제를 수술 시작 전에 피하로 적용하십시오.</li>
	<li>주사기피칸0.2mL까지 피하하여 0.25%까지 주입하고 국소 마취가 시행될 때까지 30대까지 기다립니다.</li>
	<li>옥텐디딘 디하이드로염화물과 같은 방부제로 면도 부위를 철저히 소독합니다.</li>
	<li>수술 부위의 철저한 소독 후 메스를 사용하여 머리 위에 절개를 하고 가위를 사용하여 앞다리까지 절개를 계속합니다. 불독 클램프의 도움으로 두개골을 노출하고 멸균 면 팁 어플리케이터로 음막 통을 닦아.</li>
	<li>펜 또는 bregma와 검은 잉크에 염색 캐뉼라의 끝을 정렬하고 두개골에 뇌 캐뉼라에 대한 세 가지 진입점을 표시하기 위해 적절한 좌표를 사용합니다 (기저 검정의 관류에 필요한 양자 구멍에 대한 좌표 : 전방 / 후방 : + 0.74 mm, 내측/측면: +/- 1.50 mm (+오른쪽을 나타내는 것, - 브레그마에 상대하는 왼쪽); 소뇌의 중간선에 있는 구멍에 대한 좌표: 전방/후방: - 6.90mm). 다음으로, 기저 신경질에 지정된 이중 캐뉼라와 소뇌에 지정된 단일 캐뉼라에 대한 구멍을 주의 깊게 드릴한다(도1A).</li>
	<li>줄무늬와 소뇌 사이에 작은 나사에 대한 네 번째 구멍을 드릴. 이 나사는 결국 치과 시멘트에 내장되어 있으며 캐뉼라에 대한 추가 보류를 제공합니다. 미세 한 집게와 나사 드라이버를 사용 하 여, 조심스럽게 두개골에 고정 될 때까지 작은 구멍에 나사를 소개합니다. 이 뇌 조직을 손상으로 너무 깊이 나사를 이식하지 마십시오. 참고: 삼투압 칸누라를 삽입하기 전에 삼투압 펌프 이식을 계속하는 것이 좋습니다. 이것은 펌프를 이식 할 때 캐뉼라에 우발적 인 손상을 입히는 것을 방지합니다.</li>
	<li>동물의 양쪽에 삼투압 펌프용 작은 포켓을 만들려면 조직 집게를 사용하여 피하 조직 층을 분리하십시오. 집안의 한 쪽 뒷다리쪽으로 전진하고 피하 포켓을 넓히기 위해 약간 포셉을 엽니다. 다른 쪽에 대해 동일한 절차를 반복하고 먼저 절개에서 집게를 제거한 다음 두 번째 뒷다리쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 참고 : 주머니는 펌프가 쉽게 미끄러 지도록 허용해야하지만 피부 밑으로 움직일 공간이 너무 많아서는 안됩니다.</li>
	<li>조직 집게의 도움으로 튜브의 연결된 조각과 함께 첫 번째 펌프를 가지고 하나의 피하 포켓에 밀어 넣습니다. 두 번째 펌프로 동일한 절차를 반복합니다.</li>
	<li>미니 펌프 홀더를 사용하여 소뇌의 중간에 뚫린 구멍에 3.0mm의 사용자 정의 길이가있는 단일 삼투압 캐뉼라를 소개합니다. 캐뉼라 헤드를 조심스럽게 분리하고 캐뉼라와 작은 나사를 치과 시멘트로 고정하여 삼투성 펌프의 튜브를 덮지 않도록 주의하십시오. 캐뉼라를 둘러싼 치과 시멘트가 수술을 계속하기 전에 완전히 건조되었는지 확인하십시오.</li>
	<li>중앙에서 중앙까지 3.0mm의 이중 캐뉼라와 4.0mm의 맞춤형 길이를 기저간 갱리아 위의 양자 드릴 구멍에 삽입하기 전에 두 개의 짧은 비닐 튜브(0.5cm)를 더블 캐뉼라의 두 개의 연결 부분에 부착합니다. 비닐 튜빙을 양면 어댑터와 연결하고 어댑터와 캐뉼라를 포함한 전체 튜브 시스템을 우아베인 용액 또는 차량(실온, 멸균 사전에 여과)으로 조심스럽게 미리 작성합니다. 이는 1mL 주사기와 27G 충전 캐뉼라를 분기 어댑터(그림1B)의단일 후면 단부로 도입하여 가장 잘 수행할 수 있다.</li>
	<li>미니 펌프 홀더를 사용하여 양간 구멍에 더블 캐뉼라를 조심스럽게 삽입하십시오. 클램프를 사용하여 캐뉼라 머리를 분리하고 치과 시멘트로 이중 캐뉼라를 고정하십시오.</li>
	<li>삼투압 펌프의 카테터를 각각 단일 캐뉼라뿐만 아니라 분면 어댑터에 연결합니다. 카테터가 카누라의 연결 조각을 강력하게 고정하고 있는지 확인하십시오. 참고: 두 펌프 모두 유량이 동일하므로 삼투성 펌프와 이중 농축 액액을 분기 적응대에 연결하여 동일한 농도가 기저 신경리아와 소뇌모두에 도달할 수 있도록 주의하십시오.</li>
	<li>두개골 방향으로 가능한 한 바늘로 동물의 뒷면에 절개를 닫고 피부를 과도하게 늘리지 않도록주의하십시오(도 1C).</li>
	<li>0.9% 식염수의 0.5mL을 체온이 있어야 하는 식염수는 마우스의 탈수를 피하기 위해 동물의 뒤쪽 양쪽에 피부 접을 넣고 펌프를 조심스럽게 피한다.</li>
</ol>3. 모터 챌린지
<ol><li>피험자 우아베인-또는 차량 에 퍼진 마우스는 수술 후 4시간 마다 가벼운 스트레스 노출의 한 형태로 운동 작업에 도전하고 근긴장과 같은 움직임을 유도하기 위해 24시간마다 반복적으로 반복적으로 작동합니다. 여기에는 행동 특성화가 포함되지 않습니다. 그 목적은 일반 케이지 유지에 비해 더 높은 응력 수준을 유도하는 것입니다.</li>
	<li>마우스를 50cm 거친 표면의 나무 기둥에 놓고 직경이 1cm이고 코가 아래쪽으로 향합니다. 폴이 낙하 시 침구가 충분한 대형 케이지에 놓이도록 하십시오. 하강의 시간을 측정 할 필요는 없지만, 극을 내려 동안 와베인 이퍼폰 동물에 의해 제시 된 앞 사지와 뒷다리의 비자발적 인 하이퍼 확장을 찾아보십시오. 마우스가 극을 세 번 내려 와서 하강 사이에 2 분 의 회복을 허용하십시오. 참고 : 와베인 퍼프 주입 마우스는 서마근 4 시간 수술과 같은 첫 번째 증상을 제시해야합니다. 그러나, 수술 마우스 후 24 시간 하강 하는 동안 근 긴장 증 같은 운동의 표시로 앞 사지와 뒷다리의 무의식적인 hyperextensions를 제시 하기 시작 한다.</li>
	<li>두 번째 모터 작업의 경우 로타로드 성능 테스트와 마찬가지로 회전 막대에 마우스를 배치합니다. 로타로드 장치는 늦을 대기 시간의 척도로 사용되지 않으며, 목표는 마우스를 강제 활성으로 대상화하는 것이다. 회전 하는 막대에 마우스를 세 번 배치 하 고 테스트 사이 복구의 2 분 허용. 참고: 응력 노출을 증가하려면 가속로타로드 장치를 사용하십시오. 본 명세서에 설명된 프로젝트의 경우, 막대는 300초의 정해진 기간 동안 5~50rpm으로 가속한다.</li>
	<li>동물이 극 테스트와 로타로드 성능 테스트 사이에 30 분 동안 회복하고 프로토콜 단계 4에 따라 설명 된 바와 같이 근긴장 내와 같은 움직임을 득점하기 전에 또 다른 30 분 동안 회복하십시오. 반복적인 응력 노출 사이에서, 마우스가 24 h 간격을 위해 복구할 수 있도록 합니다.</li>
</ol>4. 근긴장 장애와 같은 움직임의 평가를위한 점수 시스템
참고: 실험자는 편견을 방지하기 위해 분석된 그룹 할당에 눈을 멀게 해야 합니다. 마우스의 표현형을 특성화하는 데 사용되는 행동 테스트는 두 가지 채점 시스템입니다: 근긴장이상 등급 척도 득점 이상, 근긴장이상과 같은 움직임 및 꼬리 서스펜션 테스트를 이용한 행동 점수. 가벼운 스트레스에 노출 된 후 30 분의 회복 시간 후에 근긴장 이상과 같은 움직임을 평가하십시오.
<ol><li>근긴장 이상 등급 척도 참고: 미리 정의된 행동 작업의 부족으로 인해 근긴장 이상 등급 척도는 인간 근긴장 이상의 임상 등급 척도와 유사한 관찰자 기반 점수 시스템으로 확립되었습니다. 칼데론 외13에의해 사용되는 근긴장 이상 등급 척도의 수정된 버전이다.<ol>
<li>동물이 플라스틱 이나 나무 상자에 배치 된 후 4 분 동안 동물의 자세와 걸음걸이를 기록합니다.</li>
		<li>0에서 4점까지 근긴장이상과 같은 움직임의 주파수 및 분포 점수: (0) 일반 모터 거동; (1) 비정상적인 운동 거동, 근긴장 이상과 같은 움직임; (2) 온화한 초점 근긴장 이상 같은 운동을 가진 온화한 운동 손상; (3) 심한 초점 근긴장 이상 같은 움직임을 가진 적당한 운동 장애; (4) 중증 장애, 지속, 일반화 된 근긴장 이상 과 같은 운동(그림 2). 근긴장 이같은 다음과 같은 움직임이나 자세를 고려하십시오 : 앞 사지의 하이퍼 확장, 넓은 자세 또는 뒷다리의 하이퍼 확장뿐만 아니라 kyphosis. 단일 신체 부위가 영향을 받는 경우 근긴장 이상을 중심으로 고려하고 트렁크와 적어도 두 개의 다른 신체 부위가 영향을 받을 경우 일반화됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>테일 서스펜션 테스트 참고: 꼬리 서스펜션 테스트는 종종 뒤다리 걸림을 관찰하고 점수를 매기는 데 사용됩니다. 이것은 그러나 모터 손상을 나타내는 매우 특이한 표현형입니다. 다음 프로토콜은 근긴장 이상과 같은 움직임에 대한 특정 점수 매기기 시스템을 제안합니다. DYT/PARK-ATP1A3 환자에서 근긴장 이상의 일반화로 인해 근긴장 이상과 같은 운동은 앞 사지, 트렁크 및 뒷다리에서 평가되어야 합니다. 0-8점의 신작 득점 시스템이 개발되었고, 총 점수와 2는 근긴장이상과 같은 움직임이 존재하지 않는다는 것을나타냈다(그림 3).<ol>
<li>기지 근처의 꼬리에 마우스를 집어 들고 동물을 들어 올립니다. 테일 서스펜션 테스트의 2분 비디오를 녹화하고 기록을 철저히 분석하여 점수를 할당합니다.</li>
		<li>앞 사지를 0에서 4점까지 점수매기, 한쪽 또는 양쪽 앞 사지의 반복또는 지속적인 강장제 후퇴뿐만 아니라 앞 사지의 교차와 결합된 초확장은 근긴장 이상과 같은 것으로 분류되었습니다: (0) 비정상적인 움직임없음; (1) 발의 하이퍼 확장을 가진 앞 사지의 움직임을 감소시켰으며, 기록된 시간의 ≥ 50%를 보았습니다. (2) 전지의 가벼운 근긴장 이상 과 같은 움직임 (들) 및 기록 된 시간의 50 %; (3) 전방 사지의 가벼운 근긴장 이상 과 같은 움직임 ( 들) ≥ 50% 기록 된 시간 또는 심한 & 50% 기록 된 시간의; (4) 앞 사지의 심한 근긴장 이상 같은 움직임 (들) ≥ 50% 기록 된 시간의. 참고 : 힌드다리 걸기는 근긴장 이상과 같은 것으로 득점해서는 안되는 비정상적인 운동입니다.</li>
		<li>0에서 3점까지 뒷다리를 득점하여, 후방 사지의 후퇴와 클렌칭뿐만 아니라 지속적인 초확장이 근긴장 이상과 같은 것으로 평가되었습니다: (0) 비정상적인 움직임없음; (1) 발의 하이퍼 확장을 가진 뒷다리의 움직임을 감소시켰으며, 기록된 시간의 ≥ 50%를 보았습니다. (2) 하나의 뒷다리의 근긴장 이상 같은 운동; (3) 두 뒷다리의 근긴장 이상 같은 움직임.</li>
		<li>트렁컬 왜곡 > 기록 된 시간의 80 %의 경우 점수에 추가 포인트가 추가됩니다.</li>
		<li>동물을 다시 케이지에 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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이 DYT/PARK-ATP1A3 약리마우스 모델은 기저 신경질 및 소뇌에서 나트륨 칼륨 이온 펌프의 억제뿐만 아니라 스트레스 노출과 관련된 변경에 의해서만 유도되는 인트레이스역 구조 및 신경화학적 변화에 대한 상세한 분석을 허용합니다. 마우스의 경우 최대 2개의 삼투압 펌프를 피하로 이식할 수 있습니다. 여기서 는 단일 캐뉼라 이외에 양면 어댑터에 연결된 이중 캐뉼라를 구현하여 다중 뇌 구조에 만성 약물 전달을 상세히 설명하는 방법을 제시한다. 이 방법론은 여러 뇌 구조가 동시에 만성적으로 퍼프되는 모든 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
우리는 환자가 스트레스에 노출 된 후 영구적 인 증상을 개발하는 희귀 운동 장애의 마우스 모델을 제시합니다. 이 추정된 유전자 환경 상호 작용은 아직도 잘 이해되지 않습니다, 그러나 DYT/PARK-ATP1A3 발달에 있는 중요한 병기의 한을 나타낼 지도 모릅니다. 과거에 쥐를 스트레스에 노출시키는 다른 방법이 발표되었으며, 전기발 충격, 절제, 추위 또는 따뜻한 환경 및 다양한 냄새에 대한노출(11,12,,13)을포함한다., 번역값을 가진 가벼운 스트레스 인자에 마우스를 노출시키기 위한 노력의 일환으로, 우리는 여기에 어려운 운동 작업에 마우스의 반복적인 주관을 설명합니다. 극 검사를 위해, 와베인 이 퍼진 동물은 앞사지와 뒷다리의 비자발적 과잉 확장을 드러냈다. 이러한 움직임은 동물의 4분 비디오 녹화 와 꼬리 서스펜션 테스트 중에 관찰된 근긴장이상과 유사한 움직임과 매우 유사했다. 도전적인 운동 작업의 형태로 가벼운 스트레스의 응용 프로그램은 유전자 환경 상호 작용이 질병 진행정도에 큰 영향을 미치는 운동 증상 이나 신경 변성을 보여주는 다른 마우스 모델에서 유용 할 수 있습니다.
마우스에 있는 이상한 운동 그리고 자세를 분류하기 위하여 미리 정의된 행동 업무 의 일반적인 부족 이뿐만 아니라 평가 저울이 있습니다. 이용 가능한 모터 작업의 대부분은 신경변성18,,19를가진 운동 장애의 많은 마우스 모형에서 잘 알려진 현상인 힌드리 걸기와 같은 특이한 이상을 드러내는 다. 표현형의 적절한 특성화를 위해서는 마우스 모델이 질병의 현저한 특징을 재구성하는지 여부를 분석할 필요가 있다. 본 명세서, 우리는 근긴장 이상 마우스모델(15,,16)에서모터 장애의 평가를 위해 이전에 사용된 근긴장 이상 등급 척도의 수정된 버전을 제시한다. 우리는 또한 인간 근긴장 이상의 임상 평가 규모와 유사하게 설립된 꼬리 서스펜션 시험을 위한 관찰자 기지를 둔 채점 시스템을 개발했습니다. 두 등급 척도 모두 와뱅퍼, 스트레스가 많은 마우스에서 상당히 높은 점수를 보이며, 스트레스가 많은 동물뿐만 아니라 차량에 퍼진 동물에 비해 스트레스를 받는 쥐입니다. 관찰자 기반 득점 시스템의 단점은 일관된 점수를 보장하고 관찰자 가변성을 감소시키고 분석된 그룹에 완전히 눈이 멀지 않으면 평가자의 편향가능성을 줄이는 데 필요한 평가자 교육입니다. 그러나 관찰자 기반 채점 시스템은 여전히 표현형을 특성화하기 위한 쉽게 접근할 수 있는 방법을 제시하고, 근긴장이상과 같은 움직임의 평가를 위해 본 프로젝트에서 와 같이 분석된 마우스 모델에 적응할 수 있다. 서로 다른 평가자들 사이에서 일관된 점수를 보장하기 위해 교육 비디오를 사용할 수 있어야 합니다. 잠재적인 편향을 줄이려면 다른 평가자가 동일한 비디오 클립을 점수매기고 개별 점수가 평균화되는 것이 좋습니다. 이 작업에서 언급 된 두 채점 시스템은 동물에서 근긴장 이상과 같은 움직임의 존재를 기록합니다. 등급 척도는 프로젝트 내의 특정 요구 사항에 따라 조정할 수 있으며, Ip et al.에서 이전에 수행한 바와 같이, 난간증 1(DYT-TOR1A)20을위한 마우스 모델에서 난긴장증과 같은 움직임에 대해서만 뒷다리가 득점되었다. 평가 척도는 이전에 게시된 다른 채점 시스템에 의해 보완될 수 있으며, 예를 들어 칼데론 외13에의한 운동 장애 점수와 마찬가지로 설치류의 서진증 정도를 평가할 수 있다.

뇌로 직접 연속 약물 전달의 장점은 수많은. 동물에 대 한 불필요 한 스트레스 요소를 나타내는 반복 적이 고 빈번한 주사, 피할 수 있으며 약물의 더 일정 한 추적 농도 달성 될 수 있다. 이것은 체계적으로 투여된 약이 혈액 두뇌 장벽을 쉽게 관통하지 않을 때 특히 유효합니다. 더욱이, 삼투성 펌프를 통한 만성 약물 전달은 그렇지 않으면 시스템 전반에 걸친 부작용이 있을 기판의 국소화된 납품을 허용한다. 약물은 원하는 뇌 구조에 표적 방식으로 전달 될 수있다, 결과 효과는 따라서 직접 추적 할 수있다. 이것은 치료 효과의 연구뿐만 아니라 병기 메커니즘의 연구와 같은 응용 프로그램의 배열에 활용할 수 있습니다. 이 마지막 응용 프로그램은 근긴장 이상에 대한 약리학적 마우스 모델을 만들기 위해 본원에서 프로젝트에서 사용되었다.
세 번째로 흔한 운동 장애를 나타내는 난독증 증후군의 분석과 이해는 유전 동물 모델이 병인 인간뿐만 아니라 병리학에서 발견되는 질병 표현형을 크게 재현하지 못한다는 사실에 의해 크게 제한되었습니다. 이 문제는 난독증 증후군에 국한되지 않지만 실제로 운동 장애1,,2분야에서 많은 형질 전환기 모델에 관한 것입니다. 형질형 설치류 모델에서 표현형이 결여된 이유는 매우 효과적인 보상 메커니즘3을기반으로 할 수 있다. 근긴장 이상의 경우, 질병은 비틀기 운동과 비정상적인 자세를 일으키는 무의식적 인 근육 수축을 특징으로합니다4. 이차성 증상의 이차 원인(즉, 뇌 손상)의 연구는 기저 신경리아5와같은 이러한 운동 이상 의 증상에 관련된 구조를 식별하는 데 도움이 되었습니다. 뇌 영상형 근긴장이상증에 대한 뇌영상 연구는 모터 제어 및 감각운동통합을담당하는 거의 모든 뇌 영역에서 기능성 이상을 나타내었다6,7. 그러나, 설치류 모형은 아직도 분자및 대규모 네트워크 수준에 신경 기능 장애의 이해를 심화하고 치료 선택권의 발달을 위해 필요합니다. 이것은 약리학적 마우스 모형이 더 정확한 방식으로 질병의 임상 및 병리학적 특징을 복제할 가능성을 제공하는 곳입니다.
급속한 개시 근긴장 이상 -파킨슨증 (DYT/ 공원-ATP1A3; RDP; DYT12)는 근긴장 이상의 유전 형태 중 하나입니다. ATP1α3 유전자의 기능 상실 돌연변이에 의해 발생하며, 이는 Na+/K+-ATPase8의α3-서브유닛을 인코딩한다. 더욱이, 유전자 돌연변이 운반대는 스트레스가 많은 사건에 노출된 후 지속적인 일반화 근긴장증및 파킨슨증을 심각하게 개발하기 전에 수년 동안 증상이 없는 것으로 인식된다. 실제로, DYT/PARK-ATP1A3의 침투는 신체적 과로와 극한의 온도에서 알코올 및 감염의 과소비에 이르기까지 트리거 범위역할을 하는 불완전하고 스트레스가 많은사건이9,,10이다. DYT/PARK-ATP1A3을 연구하고 잠재적인 치료 내정간섭을 찾기 위해 설치류 모델에서 스트레스 의존성 질병 개발을 모방하기 위해 여러 번 시도되었습니다. 그러나, 기존의 유전다이T/PARK-ATP1A3 마우스 모델을 제외하면, 과도비 및 경련과 같은 움직임이 저체온증에 의해 유도된 곳, DYT/PARK-ATP1A3에 대한 모든 공래된 유전마우스 모델은 난독증 증상을 일으키지 못했다11,11,,12.. 칼데론 외는 이전에 야생형 마우스에서 심장 글리코사이드 와베인을 통해 기저간및 소뇌에서 α3-서브유닛을 간간으로 차단하는 것이 경미한 걸음걸이방해(13)를초래한다는 것을 입증하였다. 따뜻한 환경에서 전기 발 충격에 대한 추가 노출은 난독증과 서진 표현형을 일으켰기 때문에 우아베인의 만성 및 표적 관류가 DYT/PARK-ATP1A3 표현형을 성공적으로 모방한다는 것을 입증했습니다.
그러나, 2시간 동안 38-40°C의 따뜻한 환경에서 전기발 충격에 동물을 노출시키면 동물내 통증과 불안을 유발하며, 이는 특히 난독증 의 발달과 관련된 카콜라민 시스템의 변화 평가를 위해 혼동요인을 나타낸다. 따라서, 본 원에서 우리는 높은 번역 값을 가진 스트레스 패러다임의 다른 종류를 기술하며, 이는 온화한 운동에서 중간 정도의 운동이 DYT/PARK-ATP1A3 환자9의트리거로 설명되었다는 사실에 다시 관한 것이다. 더욱이, 반복적인 운동은 초점 근긴장이상(14)에대한 잘 알려진 트리거입니다. 마우스는 반복적으로 나무 기둥의 세 하강 ("극 테스트")와 로타로드 장치에 세 실행으로 구성된 도전적인 모터 작업을 실시했다 ("로타로드 성능 테스트"). 50cm 나무 기둥 위에 동물의 배치는 동물을 하강하도록 강요하는 데 사용되었고, 로타로드 장치는 회전 막대에 배치하여 강제 활성을 대상 마우스에 고용하였다.
근긴장 이상에 대한 마우스 모델의 모터 표현형의 특성화는 미리 정의된 테스트 및 점수의 부족으로 인해 특히 도전적입니다. 그러나, 지난 몇 년 동안 운동 장애 평가의,한 가지 변형은 설치류13,,15,16에서근긴장 이상과 같은 운동의 중증도 및 분포를 평가하기 위해 반복적으로 사용되어 왔다. 본 명세서에서는 4분 동안 관찰될 때 동물의 근긴장이상과 같은 표현형을 평가하는 데 효과적인 것으로 입증된 근긴장이상 등급 척도의 수정된 버전을 제시한다. 근긴장 이상과 같은 움직임을 평가하는 두 번째 방법으로, 우리는 꼬리 서스펜션 시험 도중 이상한 운동의 평가를 위한 새로 개발된 채점 시스템을 제시합니다. 그것은 근긴장 이상과 같은 움직임과 앞다리, 뒷다리 및 트렁크의 자세의 주파수 그리고 기간의 평가를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% 식염수</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>PZN06178437</td></tr><tr><td>Alzet 삼투압 펌프</td><td>Durect</td><td>4317</td><td>모델 1002, 유량 0.25 &mu; L/h</td></tr><tr><td>앵커 나사</td><td>AgnTho의</td><td>MCS1x2</td><td>길이 2mm, 나사산 1mm O.D.</td></tr><tr><td>불독 클램프</td><td>AgnTho의</td><td>13-320-035</td><td>스트레이트, 3.5cm</td></tr><tr><td>Bupivacain 0.25% Jenapharm</td><td>mibe GmbH Arzneimittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannula 및 미니 펌프 홀더</td><td>Stoelting Co.</td><td>51636</td><td>3.4mm 캐뉼러 헤드를 고정하도록 설계된</td></tr><tr><td>캐뉼러 분기</td><td>플라스틱 1개</td><td>21Y</td><td>맞춤형</td></tr><tr><td>캐뉼러 튜빙</td><td>플라스틱 1개</td><td>C312VT/PKG</td><td>비닐 1개, 0.69mm x 1.14mm</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>미세 집게</td></tr><tr><td>아이 크림 Bepanthen</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가스 마취 마스크 입체식, Mouse</td><td>Stoelting Co.</td><td>56109M</td><td></td></tr><tr><td>경화 미세 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>고속 회전식 마이크로 모터 키트</td><td>Foredom</td><td>K.1070-2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane CP 1 mL / mL, 250 mL</td><td>cp-pharma</td><td>1214</td><td>처방전 필요</td></tr><tr><td>Isoflurane 시스템 Dr &auml; ger Vapor 19.3</td><td>Wilfried M&uuml 박사; ller GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>치과 시멘트, 액체</td></tr><tr><td>Kallocryl CPGM rot</td><td>Speiko</td><td>1692</td><td>치과 시멘트, 빨간색 분말</td></tr><tr><td>마우스 및 신생아 어댑터</td><td>Stoelting Co.</td><td>전통적인 U-프레임 바늘 홀더용 마우스용</td> <td>51625</td> 어댑터</tr><tr><td></td><td>KLS Martin Group</td><td>20-526-14</td><td></td></tr><tr><td>비파열 이어바 및 고무 팁 f/ Mouse Stereotaxic</td><td>Stoelting Co.</td><td>51649</td><td></td></tr><tr><td>Octenisept</td><td>Sch&uuml; lke</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double</td><td>Plastics One</td><td>3280PD-3.0/SPC</td><td>28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm</td></tr><tr><td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single</td><td>Plastics One</td><td>3280PM/SPC</td><td>28, Gauge, custom length 3.0</td></tr><tr><td>mm Ouabain octahydrate 250 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03125-250MG</td><td>주의: 독성</td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>컨 & 손</td><td>PFB 6000-1</td><td></td></tr><tr><td>직장 열 프로브</td><td>Stoelting Co.</td><td>50304</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl 50 mg/mL, 주사 가능한</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Carprofen, 처방전 필요</td></tr><tr><td>쥐 가열 패드가 있는 설치류 워머 X1</td><td>Stoelting Co.</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>RotaRod 고급</td><td>TSE 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스크류 드라이버 세트</td><td>AgnTho의</td><td>30090-6</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 버</td><td>AgnTho의</td><td>HM71009</td><td>0.9 mm &Oslash;</td></tr><tr><td>버 스테인리스 스틸 버</td><td>AgnTho의</td><td>HM71014</td><td>1.4 mm &Oslash; 버</td></tr><tr><td>StereoDrive</td><td>Neurostar</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>입체 악기</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td>Neurostar</td></tr><tr><td>입체 로봇</td><td>Neurostar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>봉합사: 코팅된 비크릴, 폴리글라틴 910</td><td>Ethicon</td><td>V797D</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf AG</td><td>5382000015</td><td></td></tr></tbody></table>

다이에이트/park-atp1a3 근긴장전증에 대한 증상, 약리학적 마우스 모델을 확립하기 위해 삼투성 펌프의 이식 및 스트레스 유도

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

유전자 변형 마우스 모델은 특히 이동 장애를 연구할 때 한계에 직면하고 있으며, 사용 가능한 트랜스제닉 설치류 모델의 대부분이 인간 질환의 임상 적 측면을 닮은 운동 표현형을 제시하지 않는 경우. 약리학적 마우스 모델은 병리학적 메커니즘과 행동 표현형에 미치는 영향에 대한 보다 직접적인 연구를 허용합니다. 뇌 캐뉼라에 연결된 삼투성 펌프는 국소 및 만성 약물 전달을 통해 약리학적 마우스 모델을 만들 가능성을 열어주습니다. 급속발병 근긴장증의 유전운동 장애의 경우, Na+/K+-ATPase의 α3-서브유닛에서의 기능 상실 돌연변이는 글리코사이드 와바인을 통해 매우 특이적인 봉쇄에 의해 시뮬레이션될 수 있다. 기저 신경질과 소뇌의 α3-소단위를 로컬로 차단하기 위해, 이는 급속발병 난독증의 발병에 크게 관여하는 것으로 여겨지는 두 개의 뇌 구조이며, 양자 수뇌부는 스테레오탈세티로 천체적으로 이식되어 추가 단일 캐뉼라가 소뇌부에 도입된다. 캐뉼러는 비닐 튜빙을 통해 두 개의 삼투성 펌프에 연결되어 있으며, 이는 동물의 뒷면에 피하로 이식되어 와베인의 만성적이고 정확한 전달을 허용합니다. 급속한 난독증-파킨슨증을 위한 약리학적 마우스 모델은 무증상 및 증상 돌연변이 운반체의 임상 및 병리학적 특징을 재구성하는 추가적인 이점을 전달합니다. 급속한 난소 근긴장증의 돌연변이 운반대 같이, ouabain perfused 마우스는 긴장에 추가 노출 후에 만 근긴장증 같이 운동을 개발합니다. 우리는 가벼운 스트레스 패러다임을 시연하고 모터 표현형의 평가를 위한 두 개의 수정된 채점 시스템을 소개합니다.

도 4는 라우셴베르거 외17에서수정되었습니다. 근긴장 이상 등급척도(A)와꼬리 서스펜션테스트(B)의데이터 분석을 위해 각 동물에 대한 각 시간 지점에 대한 총 점수를 계산합니다. 각 시간 지점과 각 그룹의 평균은 적절한 그래프에 그려야 합니다. 값의 분포를 조사해야 하며 의미를 결정하기 위해 적절한 통계 테스트를 적용해야 합니다. 충분한 수의 동물을 통해, 모터 표현형은 소화전 등급 척도뿐만 아니라 꼬리 서스펜션 테스트에서 비정상적인 움직임의 평가를 통해 모두 검출될 수 있다. 근긴장 이상과 같은 표현형은 와베인-퍼퓨즈, 스트레스군에서 두 평가모두에서 상당히 높은 모터 점수에 의해 입증되며, 응력되지 않은 마우스뿐만 아니라 대조마우스에 비해 응력이 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> 그림 1: 캐뉼라 및 삼투압 펌프 이식을 위한 주요 수술 단계. (A)표시된 좌표의 경우, 기초 신경교에 지정된 이중 캐뉼라와 소뇌의 중간선에 배치된 단일 캐뉼라에 대해 양측으로 구멍을 뚫어야 한다. 완전히 제작된 두 개의 삼투성 펌프는 동물의 각 측면에 표시됩니다. (B)사진은 치과 시멘트로 고정된 소뇌에 이식된 단일 캐뉼라를 보여줍니다. 기저 간질에 대한 이중 캐뉼라는 분화 어댑터에 연결하고 이식 전에 ouabain으로 미리 채워져야합니다. (C)완성된 절차의 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> 그림 2: 근긴장 이상 등급 척도를 가진 근긴장 이상과 같은 운동의 평가. 4분 동안 비디오 동안 신체 분포와 지속 시간을 기준으로 근긴장 이상과 같은 움직임이 득점되었습니다. 앞 사지의 비자발적 과잉 확장, 넓은 자세 또는 힌드다리뿐만 아니라 kyphosis의 하이퍼 확장은 근긴장 이상과 같은 것으로 평가되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> 그림 3: 꼬리 서스펜션 테스트 중 근긴장 이상과 같은 움직임의 평가. 2분 동안 비정상적인 움직임을 위한 새로 개발된 득점 시스템은 앞사지, 뒷다리 및 트렁크의 난독증 같은 움직임을 총 0-8점에서 평가합니다. 앞 사지의 경우, 앞 사지의 하이퍼 확장 및 횡단뿐만 아니라 난독증과 같은 자격을 갖춘 트렁크를 향한 강장제 굴곡. 뒷다리의 경우 무의식적 인 hyperextension뿐만 아니라 중간선을 통해 연장으로 철회는 근긴장 이상과 같은 것으로 득점되었다. 기록된 시간의 80% 이상 트렁컬 왜곡이 1점으로 득점되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> 그림 4: 근긴장 이상 등급 스케일 및 꼬리 서스펜션 테스트의 대표적인 그래프. (A)그래프는 NaCl-perfused, 응력 마우스 (점선 검정선), 와베인 퍼퓨즈, 비 스트레스 마우스 (점선 오렌지 라인) 및 와바인 퍼퓨즈, 스트레스 마우스 (진한 파란색 선)에 대한 난독증 등급 척도를 묘사한다. 각 시간 지점에 대해 평균 값 ±표준 오차(SEM)가 표시됩니다. (B)다이어그램은 NaCl-perfused, 스트레스 마우스 (점선 블랙 라인), 와베인 perfused, 비 스트레스 마우스 (점선 오렌지 라인) 및 와베인 퍼퓨즈, 스트레스 마우스 (어두운 파란색 선)에 대한 2 분 꼬리 현탁액 테스트 동안 비정상적인 운동의 평가를 보여줍니다. 두 꼬리 만 휘트니 테스트를 사용하여 근긴장 이상 등급 척도 및 꼬리 서스펜션 테스트 점수를 위해 통계 분석이 수행되었습니다. p값의 본페로니-홈 보정(§)은 72h의 관측 기간에 상당한 차이를 보였다. 다크 블루 * 와베인 퍼퓨징, 스트레스가 많은 마우스와 와베인 이내, 스트레스가 없는 마우스, 검은 * NaCl-perfused, 스트레스마우스 와 와베인 퍼퓨어, 스트레스마우스 뿐만 아니라 NaCl-perfused, 스트레스 마우스 와 아우아베인 사이의 상당한 차이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

당사는 삼투성 펌프에 연결된 기저 신경질및 소뇌에 캐뉼라를 이식하여 약리학적 DYT/PARK-ATP1A3 난긴장증 마우스 모델을 생성하는 프로토콜을 제공합니다. 우리는 운동 도전의 적용과 행동 점수 시스템을 통해 표현형의 특성화를 통해 근긴장 이상과 같은 운동의 유도를 설명합니다.

다이에이트/PARK-ATP1A3 근긴장전증에 대한 증상, 약리학적 마우스 모델을 확립하기 위해 삼투성 펌프의 이식 및 스트레스 유도

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 삼투성 펌프에 뇌 캐뉼라를 사용하고 도전적인 모터 작업을 통해 스트레스를 유도하여 DYT/PARK-ATP1A3 근긴장 이상증에 대한 증상, 약리학적 마우스 모델을 확립하는 데 관련된 절차를 설명하는 것입니다. 이 방법은 다중 뇌 캐뉼라에 삼투성 펌프를 통해 만성 약물 전달을 사용하여 약리학적 마우스 모델을 설정하는 방법과 도전적인 운동 작업을 통해 표현형을 유도하는 방법을 자세히 설명합니다. 가벼운 모터 스트레스 패러다임은 또한 운동 장애에서 유전자 환경 상호 작용의 역할에 대한 통찰력을 제공하고 다른 설치류 모델에 적용 할 수 있습니다.동물 실험은 동물의 치료와 사용을 위한 해당 국가 및 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 멸균 환경에서 삼투압 펌프를 준비하여 시작합니다. 먼저, 멸균 여과 된 와뱅 용액 또는 차량 용액으로 27 게이지 충전 캐뉼라로 밀리리터 주사기를 채웁니다.삼투압 펌프를 똑바로 세워 펌프에 넣을 수 있는 캐뉼라를 펌프에 삽입하고 여분의 용액이 위에 나타날 때까지 천천히 저수지를 채웁니다. 다음으로 흐름 중재자를 펌프에 삽입합니다. 흐름 중재자의 흰색 플랜지를 가위로 조심스럽게 벗고 비닐 튜브 조각을 흐름 중재자에 연결합니다.각 펌프를 식염수 용액으로 반쯤 채워진 Eppendorf 튜브에 담그고 펌핑 속도가 수술을 시작하기 전에 정상 상태에 도달하도록 하기 위해 37도열사이클러에 넣습니다. 동물이 승인 된 프로토콜에 따라 심층 마취 된 후 동물을 고정 프레임에 넣고 고무 팁이나 파열되지 않은 이어 바를 사용하여 머리를 고정하십시오. 수술 부위를 철저히 소독한 후 메스를 사용하여 머리 꼭대기에 절개를 하고 가위를 사용하여 앞다리까지 절개를 계속합니다.불독 클램프의 도움으로 두개골을 노출하고 멸균 면 팁 어플리케이터로 음막 통을 닦아. 펜또는 검은 잉크에 염색된 캐뉼러 끝을 브레그마로 정렬하고 적절한 좌표를 사용하여 두개골에 있는 뇌 캐뉼라의 세 가지 진입점을 표시합니다. 다음으로, 기저 신경교에 지정된 이중 통과 소뇌에 지정된 단일 캐뉼라에 대한 구멍을 신중하게 드릴한다.줄무늬와 소뇌 사이에 작은 나사에 대한 네 번째 구멍을 드릴. 이 나사는 결국 치과 시멘트에 내장되어 있으며 캐뉼라에 대한 추가 보류를 제공합니다. 동물의 양쪽에 삼투압 펌프용 작은 주머니를 만들려면 조직 집게를 사용하여 피하 조직 층을 분리하십시오.집안의 한 쪽 뒷다리쪽으로 전진하고 피하 포켓을 넓히기 위해 약간 포셉을 엽니다. 다른 쪽에 대해 동일한 절차를 반복하고 먼저 절개에서 집게를 제거한 다음 두 번째 뒷다리쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 집게의 도움으로 펌프와 연결된 카테터를 각 피하 포켓에 조심스럽게 삽입하십시오.포켓은 펌프가 쉽게 밀어 넣을 수 있도록해야합니다. 미니 펌프 홀더를 사용하여 소뇌의 중간선에 뚫린 구멍에 3.0밀리미터의 사용자 정의 길이가 있는 단일 삼투압 캐뉼라를 소개합니다. 캐뉼라 헤드를 조심스럽게 분리하고 캐뉼라와 작은 나사를 치과 시멘트로 고정하여 삼투성 펌프의 튜브를 덮지 않도록 주의하십시오.캐뉼라를 둘러싼 치과 의사 시멘트가 수술을 계속하기 전에 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 기저 간질 위의 양자 간 구멍에 이중 캐뉼라를 삽입하기 전에 0.5센티미터 길이의 비닐 튜브 두 개를 더블 캐뉼라의 두 개의 연결 조각에 부착하십시오. 비닐 튜빙을 양면 어댑터와 연결하고 멸균 우아베인 솔루션 또는 차량으로 튜브 시스템 전체를 조심스럽게 미리 작성합니다.다음으로, 단일 캐뉼라에 대해 이전에 표시된 것과 동일한 단계를 반복하고 치과 시멘트로 이중 캐뉼라를 고정하여 끝납니다. 삼투압 펌프의 카테터를 각각 단일 캐뉼라뿐만 아니라 분면 어댑터에 연결합니다. 두 펌프 모두 동일한 유량을 가지므로 삼투성 펌프를 이중 농축 용액과 이중 농축 액액을 분기 어댑터에 연결하여 동일한 농도가 기저 신경리아와 소뇌 모두에 도달할 수 있도록 주의하십시오.피부를 과도하게 펴지 않고 가능한 한 바늘로 동물의 뒤쪽절개를 닫습니다. 탈수증을 피하기 위해 체온이 있어야하는 멸균 식염수에 피하시 주입하십시오. 스테레오전술 프레임에서 동물을 제거하고 복구 케이지에 넣습니다.근긴장 이상과 같은 운동을 유도하기 위해, 와베인 퍼진 마우스는 수술 후 4 시간 동안 가벼운 스트레스 패러다임으로 도전적인 운동 작업에 노출되어야하며 그 후 24 시간마다 반복적으로. 여기에는 동물의 행동 특성화가 포함되지 않습니다. 우리는 50센티미터 의 거친 표면 나무 기둥에 배치되는 차량 으로 퍼진 동물의 예를 여기에서 보여 주며, 코가 아래쪽을 향하고 있습니다.낙상 시 극 기슭에 충분한 침구를 제공합니다. ouabain perfused 마우스에 대 한, 동물 은 수술 후 4 시간 같은 첫 번째 증상을 제시 하기 시작 한다. 그러나 수술 후 24 시간, 당신은 하강 하는 동안 근 긴장 증 같은 운동의 표시로 앞 팔 다리 또는 뒷다리의 무의식적인 hyperextension을 볼 수 있어야 합니다.마우스는 극을 세 번 하강해야하며 각 하강 사이에 적어도 2 분 동안 회복할 수 있습니다. 하강의 시간을 측정할 필요가 없습니다. 폴 테스트다음에 회전로드를 사용하여 두 번째 모터 작업이 따라야 합니다.로타로드 성능 테스트와 마찬가지로 응력 그룹에서 나온 와아베인 및 차량 침투 마우스를 회전 막대에 배치합니다. 늦을 대기 시간을 측정할 필요가 없습니다. 이전 테스트에 대해 수행한 것처럼 마우스를 회전 막대에 세 번 배치하여 2분간의 회복이 진행됩니다.수정된 근긴장 이상 등급 척도는 마우스의 근긴장 이상 과 같은 운동의 주파수, 엄격 및 바디 분포를 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 동물은 플라스틱 또는 나무 상자에 배치해야하며 움직임은 4 분 동안 기록해야합니다. 평가자는 그룹 할당에 눈을 멀게 해야 합니다.근긴장 장애로 간주되는 운동이나 자세는 앞 사지의 비자발적 인 하이퍼 확장, 넓은 자세, 또는 뒷다리의 하이퍼 확장뿐만 아니라 kyphosis입니다. 한 신체 부위만 영향을 받는 경우 근긴장 이상은 초점으로 간주되어야 합니다. 트렁크와 적어도 두 개의 다른 신체 부위가 영향을 받는 경우 근긴장 이상은 일반화된 것으로 간주되어야 합니다.0에서 8점까지 새로 개발된 두 번째 득점 시스템은 테일 서스펜션 테스트 중 근긴장 이상과 같은 움직임의 존재와 심각도를 평가합니다. 테스트를 위해, 2 분 동안 베이스 근처 꼬리에 의해 마우스를 잡아. 테일 서스펜션 테스트를 기록하고 푸티지의 후속 분석에 점수를 할당하는 것이 좋습니다.앞팔다리는 0에서 4점으로 득점됩니다. 전면 사지 중 하나의 반복되거나 지속적인 강장제 회수뿐만 아니라 앞 사지의 교차와 결합 된 확장은 근긴장 이상과 같은 것으로 득점됩니다. 뒷다리의 근긴장이상과 같은 움직임은 후퇴와 클렌칭을 의미하며 지속적인 하이퍼익스텐션은 0에서 3점으로 점수가 매겨집니다.기록된 시간의 80% 이상이 존재하는 트런칼 왜곡은 추가 포인트로 득점됩니다. 뒷다리 걸쇠는 모터 손상에 대한 비특이적 징후이며 득점해서는 안됩니다. 이 그래프는 근긴장 이상 등급 척도의 결과를 보여줍니다.와베인을 가중한 스트레스마우스는 비응우스트레스와 백아베인 퍼퓨즈 그룹, 차량 동물보다 72시간 의 관측 기간 동안 훨씬 더 많은 근긴장증 같은 움직임을 존재한다. 이 이미지는 꼬리 서스펜션 테스트의 결과를 묘사하고 근긴장 이상 등급 척도와 유사한 결과를 보여줍니다. 각 시간 지점에 대한 각 동물의 총 점수에서 평균의 결과가 유의하시기 유의하십시오.이 비디오를 시청 한 후, 당신은 고정 관제 여러 뇌 캐뉼라를 이식하는 방법과 피하 삼투성 펌프를 피형적으로 이식하는 방법을 잘 이해해야합니다. 이 방법의 주요 장점은 반복적이고 스트레스가 많은 주사를 피할 수 있으며, 그렇지 않으면 시스템 전체의 부작용이 있는 우아베인과 같은 기판이 특정 뇌 구조로 직접 전달될 수 있다는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Wang, X. et. al., 중추신경계에 대한 생체 내 재수초화 연구를 위한 삼투압 펌프 기반 약물 전달. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 탈수초화된 마우스 모델에서 삼투압 펌프를 사용하여 신경 치료 약물을 전달하는 방법을 보여줍니다. 제어된 약물 방출은 뇌량에서 미엘린 생성 세포를 활성화하여 재수초화를 촉진합니다.

 탈수초화된 마우스 모델에서 삼투압 펌프 기반 신경치료 약물 전달

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

병리학적 조건에서 뇌 재구성을 연구하기 위해 우리는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 뇌로 단백질을 직접 전달하기 위해 미량삼투압 펌프를 사용했습니다. 그런 다음 단백질의 영향으로 뇌 연결성의 변화를 연구하기 위해 요로 추적자를 주입합니다.

Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

저가 프로토콜 발자국 분석의 구성 및 구속 스트레스 마우스 모델의 운동 장애를 평가 하는 데 유용 후 상자 테스트를...

공간 분석 및 쥐 상자 테스트 매달려의 저가 프로토콜 적용 구속 만성 스트레스

이식된 삼투펌프를 통한 이소프로테레놀의 만성 투여는 마우스의 고급 심부전을 모방하기 위해 널리 사용되어 왔다. 여기서, 우리는 성공적인 모델 생성을 위한 심초음파 평가뿐만 아니라 3주 동안 의 지속적인 이소프로테레놀 투여를 위한 수술용 미니 펌프 이식에 대한 상세한 방법을 설명합니다.

마우스에서 심부전을 유도하는 이소프로테레놀 미니 펌프 의 이식

탈수초화는 여러 중추 신경계 질환에서 발생합니다. 신뢰할 수 있는 생체 내 약물 전달 기술은 약물 검사를 재수초화하는 데 필요합니다. 이 프로토콜은 뇌실질로 직접 장기간 약물 전달을 허용하고 약물 생체 이용률을 향상시키는 삼투압 펌프 기반 방법을 설명하며 수초화 연구에 광범위하게 적용됩니다.

중추 신경계에 대한 생체 내 수초화 연구를위한 삼투압 펌프 기반 약물 전달

이 프로토콜은 미니 펌프를 사용하여 제어된 레트로졸 방출을 통해 마우스에서 다낭성 난소 증후군(PCOS) 모델을 유도하는 기술을 소개합니다. 적절한 마취 하에 미니 펌프를 피하 주사하고, 미니 펌프 방출 일정 기간 후에 마우스에서 PCOS를 성공적으로 유도하였다.

생쥐에서 다낭성 난소 증후군을 유도하기 위한 수정된 기술

여기에서는 화학적으로 재프로그래밍된 줄기세포를 엔지니어링하여 이러한 세포를 도파민성 전구세포로 분화하고, 파킨슨병의 마우스 모델에 이식하고, 이식된 세포의 성공적인 통합 및 기능적 효과를 확인하기 위해 행동 및 전기생리학적 결과를 평가함으로써 정확한 신경 조절을 달성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경퇴행성 질환 치료에서 재프로그래밍된 줄기세포 유래 전구세포의 화학유전학적 조절

여기서는 생체 내에서 받은 디스토닉 햄스터 모델의 급성 소뇌 절단에서 체외 고밀도 마이크로전극 배열 기록을 위한 프로토콜을 설명합니다. 11일간 연속 창백 심부 뇌 자극.

고밀도 미세전극 배열을 이용한 망백 심부 뇌 자극의 네트워크 전반 메커니즘 조사

자기 공명 영상 (MRI)은 유전자 조작 생쥐의 표현형을 조사를위한 점점 인기있는 도구가되고 있습니다. 이 문서는 여러 마우스 MRI를 사용하여 유전자 조작 생쥐의 높은 처리량 phenotyping을 달성하는 데 필요한 방법을 보여줍니다.

여러 마우스 Neuroanatomical 자기 공명 영상

배우세요 DYT/PARK-ATP1A3 근긴장전증 약리학적 마우스 모델을 삼투성 펌프와 뇌 캐뉼라 이식으로 확립하는 방법을. 운동 과제를 통한 스트레스 유도로 표현형을 유발하고 행동학적 특성 분석을 수행합니다.

다이에이트/PARK-ATP1A3 근긴장전증에 대한 증상, 약리학적 마우스 모델을 확립하기 위해 삼투성 펌프의 이식 및 스트레스 유도

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