고분해능 용융 분석을 이용한 CALR 유전자의 유전적 변이체 검출

이 방법은 혈액학적 질환이 의심되는 환자, 특히 다른 진단 옵션이 제한적이거나 비혈액학적 질환과 중복되는 경우 칼레티큘린 돌연변이를 정확하게 정의합니다. 고해상도 미러 기술의 주요 장점은 칼레티큘린 유전자의 핫스팟 영역에서 일반적인 체세포 유전 변이를 허용 가능한 검출 한계와 저렴한 비용으로 검출할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 골수증식성 질환, 특히 본태성 혈소판 증가증 및 원발성 골수섬유증의 신속하고 비침습적인 진단을 가능하게 합니다.

현재로서는 이러한 환자의 치료법 선택에 영향을 미치지 않습니다. 그러나 이는 향후 변경될 수 있습니다. 먼저 텍스트 원고에 설명된 대로 qPCR HRM 마스터 믹스를 준비하여 각 DNA 샘플과 대조군을 3회 복제하기에 충분합니다.

튜브를 부드럽게 두드리고 뒤집어 2-3초 동안 와류를 일으킨 다음 튜브를 짧게 돌려 흩어진 방울을 모으는 방식으로 반응 내용을 혼합합니다. 19마이크로리터의 qPCR HRM 마스터 믹스를 96웰 광학 반응 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 1마이크로리터의 negative control, positive control 및 sample을 무템플릿 대조군 또는 NTC를 위한 플레이트의 적절한 well에 DNA 대신 qPCR HRM 마스터 믹스를 준비하는 데 사용되는 1마이크로리터의 멸균 RNA 및 DNA의 자유수를 피펫으로 주입합니다.

실행 중 증발을 방지하기 위해 광학 접착 필름으로 반응판을 단단히 밀봉하십시오. 그런 다음 실온에서 780회 G로 1분 동안 돌립니다. 액체가 반응 플레이트의 웰 바닥에 있는지 확인하고 분석을 실행합니다.

컨트롤과 샘플을 기기 시스템 소프트웨어의 적절한 웰에 할당하고 기본 기기 증폭 프로토콜을 변경합니다. qPCR 직후 해리 분석을 수행하도록 텍스트 원고에 설명된 대로 기기를 프로그래밍합니다. 실행이 끝나면 증폭 플롯을 검토하고 확인합니다.

기기 시스템 소프트웨어의 실험 메뉴에서 증폭 플롯 옵션을 선택합니다. 데이터가 표시되지 않으면 녹색 분석 버튼을 클릭합니다. 플롯 유형 드롭다운 메뉴의 Amplification Plot 탭에서 증폭 데이터를 형광 판독값으로 표시하는 플롯을 선택하고, cycle number의 함수로 수동 참조에서 형광으로 정규화된 플롯 색상 드롭다운 메뉴에서 sample을 선택합니다.

그래프 유형 드롭다운 메뉴에서 선형 증폭 그래프 유형을 선택하고 기준선 시작 및 종료 주기가 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 종료 주기는 상당한 형광 신호가 감지되는 주기 번호보다 몇 주기 전에 설정해야 합니다. 그래프 유형 드롭다운 메뉴에서 로그 10 증폭 그래프 유형을 선택하고 임계값 옵션을 선택하여 그래프에 임계값 선을 표시하고 임계값을 조정합니다.

임계값 선은 qPCR 곡선에서 지수 위상을 교차해야 합니다. 모든 샘플 및 양성 대조군 웰이 정상 증폭 곡선을 가지고 있고 NTC 웰에 증폭이 없는지 확인합니다. 정규 증폭 플롯은 사이클 15와 35 사이의 임계값을 초과하는 개화의 기하급수적 증가를 보여줍니다.

파생 용융 곡선에서는 용융 전후 영역 또는 온도 라인을 검토합니다. 용융 전후 영역은 형광등에 큰 봉우리나 경사가 없는 평평한 지역 내에 있어야 합니다. 필요한 경우 사전 용융 및 사후 용융 온도 라인의 시작과 중지를 서로 약 섭씨 0.5도 간격으로 설정합니다.

매개변수가 조정된 경우 분석 버튼을 클릭하여 분석을 다시 시작합니다. 차이 포트 탭의 플롯 설정 탭에서 와일드 타입 제어 복제 중 하나를 참조 DNA로 선택하고 분석 버튼을 클릭하여 분석을 다시 시작합니다. 정렬된 용융 곡선 탭에서 모든 양성 대조군이 올바른 유전자형을 가지고 있고 NTC가 증폭에 실패했는지 확인합니다.

웰 표에서 대조군 웰을 선택하여 분석 플롯에서 해당 용융 곡선을 강조 표시하고 선의 색상이 올바른 유전자형에 해당하는지 확인합니다. 정렬된 용융 곡선 탭에서 알 수 없는 샘플에 대한 플롯 표시를 주의 깊게 검토하고 이를 컨트롤에 대한 플롯 표시와 비교합니다. 알 수 없는 샘플 복제가 포함된 Well을 선택하고 제어 요소를 하나씩 선택하여 용융 곡선을 컨트롤과 정렬된 순서로 정렬합니다.

차이 플롯 탭에서 알 수 없는 샘플에 대한 결과를 분석하여 얻은 결과가 일치하는지 확인합니다. 알 수 없는 샘플 복제가 포함된 well을 선택하고 용융 곡선을 정렬된 순서로 컨트롤에 정렬하여 control을 포함하는 Well을 하나씩 선택합니다. 형광 핵산 균주를 함유한 4% 아가로스 프리캐스트 겔에서 qPCR HRM 제품을 실행합니다.

하나의 양성 음성 NTC 및 샘플 qPCR HRM 반복실험만 실행합니다. 패키지에서 프리캐스트 젤과 카세트를 제거한 다음 빗을 제거하고 제조업체의 지침에 따라 젤을 장치에 삽입합니다. 10마이크로리터 샘플을 멸균 RNA 및 DNA가 없는 물로 20마이크로리터로 희석하고 각 웰에 20마이크로리터의 희석된 샘플을 로드합니다.

3마이크로리터의 DNA 크기 표준 용액을 20마이크로리터로 희석하고 마커 웰에 로드합니다. 빈 우물을 20마이크로리터의 멸균 RNA와 DNA의 자유수로 채웁니다. 실행 중인 젤의 백분율에 따라 즉시 프로그램을 선택하고 장치의 런타임을 20분으로 설정합니다.

샘플을 로드한 후 1분 이내에 전기영동을 시작합니다. 전기영동이 완료되면 청색광 또는 UV 투과광을 사용하여 DNA와 겔을 시각화합니다. 또한 주기 15와 35 사이의 임계값을 초과하는 형광의 기하급수적인 증가와 모든 복제 및 대조군에서 정량화 주기의 매우 좁은 값으로 관심 DNA 영역을 성공적으로 증폭하는 것은 고분해능 용융 분석을 통해 유전적 변이를 안정적으로 식별하기 위한 전제 조건입니다.

HRM 분석은 qPCR 직후에 수행되며, 샘플의 활성 용융 영역, 대조군 및 NTC를 사용하여 정렬된 용융 곡선 플롯을 생성합니다. 용융 전후 영역을 올바르게 설정하는 것은 샘플의 유전적 변이를 적절하게 시각화하고 식별하는 데 중요합니다. 정렬된 용융 곡선과 다른 포트가 여기에 표시됩니다.

미확인 샘플은 양성 대조군 중 하나와 밀접하게 정렬되어 있습니다. 용융 전후 영역 또는 온도 선을 잘못 설정하면 용융 곡선이 정렬되고 유전적 변이를 올바르게 식별하기가 더 어려운 다른 플롯이 생성됩니다. 샘플의 유전적 변이는 샘플의 밴드 패턴을 대조군과 비교하여 식별할 수 있습니다.

그리고 HRM과 아가로스 젤 전기 영동을 결합하여. 올바른 유전적 변이 식별은 HRM 분석에 사용된 대조군 중 하나와 동일한 유전적 변이를 포함하는 샘플에 대해서만 수행할 수 있습니다. 희귀한 칼레티큘린 유전적 변이를 포함하는 샘플은 HRM 결과와 전기영동 밴드 패턴이 다릅니다.

이 프로토콜을 시도할 때는 알려진 샘플과 대조 샘플의 정렬된 용융 곡선 플롯 표시를 주의 깊게 비교하는 것이 중요합니다.