캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

이 프로토콜은 활성 진핵생물 번역의 단일 분자 분석을 위해 기존 cell-free translation system을 활용할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 bulk translation 특성을 보존하고 단일 분자 분해능을 제공하며 다른 bulk translation assay에서 비교적 간단하게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 벌크 조건에서 효율적인 캡 의존 번역이 가능한 것으로 확인된 모든 cell-free 번역 시스템에 적용할 수 있습니다.

절차를 시연하는 사람은 연구원인 Hongyun Wang과 Xiaohui Qu 실험실의 선임 연구원인 Anthony Gaba입니다. 단일 분자 실험을 수행하기 최소 3시간 전에 현미경 인큐베이터를 켜고 공기 흐름을 낮은 속도로 줄여 실험의 과도한 음향 방해를 방지합니다. 그런 다음 incubator 온도를 cell-free translation system에 맞는 최적의 온도로 설정합니다.

실험 최소 1시간 전에 레이저 상자 뒤에 있는 레이저 전원 버튼을 누르고 레이저 안전 키를 돌린 다음 시작 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 현미경을 켜고 이미징 모드, 대물렌즈 및 필터 세트를 선택합니다. EMCCD 카메라, 스테이지 컨트롤러, 시린지 펌프 및 컴퓨터를 켜고 카메라, 레이저, 전동 스테이지 및 시린지 펌프 소프트웨어를 엽니다.

레이저 제어 소프트웨어에서 연결을 클릭하여 레이저 강도를 설정하고 셔터 상자를 선택 취소한 다음 제어를 클릭하여 레이저 제어 팝업 창에서 강도 슬라이드 바를 드래그합니다. 침투 깊이를 입력하여 레이저를 원하는 각도로 설정하고 이미징하지 않을 때 레이저를 꺼짐 모드로 유지하기 위해 셔터 박스가 닫혀 있는지 확인합니다. 카메라가 냉각되고 지정된 작동 온도로 안정화되면 카메라 소프트웨어에서 획득 모드로 kinetic을 선택하고 노출 시간, kinetic series length 및 electron multiplying gain 값 매개변수를 입력합니다.

디렉토리를 선택하고 데이터 이미지 파일을 저장하기 위한 파일 이름을 지정합니다. 주사기 펌프를 적당한 유속에서 빠른 유속으로 설정하고 마이크로분리 튜브에 70% 에탄올 500마이크로리터를 추가합니다. 주사기 펌프 튜브 끝을 에탄올 용액에 삽입하고 주사기 펌프 소프트웨어를 사용하여 주사기 펌프를 인출 모드와 분배 모드 사이에서 전환하여 튜브를 에탄올로 세 번 세척하고 RNase가 없는 물로 세 번 세척합니다.

최종 물 세척 후 튜브 끝을 깨끗한 티슈 와이프에 두드려 튜브 내부에 남아 있는 물을 제거하고 튜브 끝을 깨끗한 마이크로퓨지 튜브에 넣습니다. 3 프라임 엔드 비오틴화된 mRNA 고정을 위해 커버 슬립 면이 아래를 향하도록 하여 플로우 챔버를 현미경 샘플 홀더에 넣고 테이프로 챔버를 고정합니다. 테이프를 사용하여 사용하지 않는 유동 채널 입구와 출구를 덮고 유동 채널에 밀리리터당 200마이크로그램 스트렙타비딘 용액 부피의 1.5배를 추가합니다.

실온에서 10분 후 세척당 T50 세척 버퍼의 3배와 접힌 실험실 조직으로 채널을 세 번 세척하고 닦습니다. 마지막 세척 후 이멀젼 오일 한 방울을 현미경 대물렌즈에 떨어뜨리고 홀더와 챔버를 현미경 스테이지에 놓습니다. 그런 다음 대물렌즈의 이멀젼 오일이 커버슬립에 닿을 때까지 대물렌즈를 커버슬립에 가깝게 가져오고 s를 이동합니다.tage 유동 채널의 위치가 대물렌즈 바로 위에 있도록 합니다.

microscope control touchscreen에서 focus 탭을 선택하고 focus search and start(초점 검색 및 시작)를 클릭합니다. 초점 평면이 성공적으로 달성되면 신호음이 들립니다. 카메라 소프트웨어에서 라이브 모드를 선택합니다.

레이저 제어 소프트웨어에서 레이저 셔터를 열고 레이저 강도 수준을 조정합니다. 라이브 모드와 현미경 제어 터치스크린에서 미세 단계 제어를 사용하여 대물렌즈 위치를 조정하여 실시간 형광 이미지를 관찰합니다. 카메라 소프트웨어에서 스테이지를 이동하여 유동 채널 감지 표면의 다양한 영역에서 형광 배경 수준을 평가합니다.

형광이 낮으면 라이브 모드를 중지하고 레이저 제어 소프트웨어의 레이저 셔터를 닫고 유동 채널의 세척 버퍼를 비오틴화된 mRNA 용액 부피의 2배로 교체합니다. 15분 후, 세척당 translation compatible buffer의 3배로 채널을 3회 세척합니다. 단일 분자 검출의 경우, mRNA 없이 갓 해동한 번역 믹스 부피의 3배를 조립하고 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 최적화된 농도의 형광 표지 항체를 보충한 다음 튜브를 잠시 돌려 튜브 바닥에서 혼합물을 수집합니다.

translation mix를 700 microlit microfuge tube cap 내부로 옮기고 주사기 펌프를 회수 모드로 설정합니다. 펌프 튜빙 끝을 번역 혼합물에 삽입하고 주사기 회수를 시작합니다. translation mix가 pump tubing에 완전히 유입되면 회수를 중지하고 주사기 펌프 설정을 분주 모드로 전환한 다음 translation mix 전달을 위한 최적의 속도로 흐름을 설정합니다.

필요에 따라 병진 혼합물이 튜빙 끝에 도달할 수 있도록 주사기를 시작 및 중지하고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 펌프 튜빙 끝을 흐름 채널의 입구에 삽입합니다. 맞춤형 금속 브래킷을 현미경 샘플 홀더 플레이트에 나사로 고정하여 연결을 안정화하고 현미경 초점 및 이미징 영역 형광을 평가합니다. 동영상 획득 매개변수가 올바른지, 파일을 저장하기 위해 적절한 파일 이름과 디렉토리가 입력되었는지 확인합니다.

스테이지를 이동하여 흐름 채널 감지 표면의 중앙에 있는 영역을 이미징할 수 있도록 합니다. 그리고 연속 AF 탭에서 시작 버튼을 클릭합니다. 초점면이 성공적으로 달성되면 신호음이 들립니다.

주변광을 줄인 후 레이저 셔터를 열고 신호 받기 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 5초 후 run 명령을 입력하여 변환 믹스를 흐름 채널로 전달합니다. 그런 다음 프레임 시간당 0.5초에서 2초의 해상도로 최대 2시간 동안 데이터를 기록합니다.

Cy3 ANTI-FLAG 결합 이벤트를 분석하기 위해 선택한 Cy3 알파 플래그 스폿의 형광 강도를 전체 영화에 대해 프레임별로 계산하고 연결하여 강도 궤적을 형성했습니다. 원시 궤적은 노이즈가 있는 것처럼 보일 수 있으며 배경 노이즈를 줄이기 위해 비선형 앞으로/뒤로 필터를 사용하여 미세 조정해야 할 수 있습니다. 궤적을 디지털화하기 위해 단계 감지 알고리즘을 사용하여 더욱 세분화할 수 있습니다.

초기 폴리펩타이드에 대한 항체 결합은 형광의 순간적인 증가를 유발하는 반면, 항체 폴리펩티드 해리는 순간적인 형광 감소를 유발합니다. 루시페라제 플래그 mRNA에 대한 체류 시간 히스토그램은 로그 정규 분포에 적합하며 초당 2.5 플러스 또는 마이너스 0.1 아미노산의 펩타이드 합성 속도를 산출합니다. 첫 도착 시간 히스토그램은 shifted log normal function에 적합하며, 이는 단일 mRNA 번역 활성에서 높은 수준의 이질성을 보여줍니다.

히스토그램에서 알 수 있듯이, 단일 루시페라제 플래그 mRNA 분자에 대한 첫 번째 펩타이드 합성 이벤트는 번역 믹스 전달 후 빠르면 2분에서 늦어도 20분 후에 시작될 수 있습니다. 루시페라제 플래그 mRNA를 사용한 번역과 비교했을 때, 헤어핀 루시페라제 플래그 mRNA를 사용한 첫 번째 도착 시간 히스토그램은 항체 결합 속도가 느린 것으로 나타났습니다. 그러나 이와 동일한 mRNA를 사용한 cell-free translation 반응에서 벌크 발광 측정을 사용하는 것은 translation kinetics의 차이를 해결하지 못합니다.

이 분석법의 단일 분자 분해능은 다른 접근법으로는 쉽게 얻을 수 없는 캡 의존적 번역에 대한 보다 역동적인 통찰력을 제공합니다. 진핵생물 cell-free translation은 작은 변화와 실험 조건에 민감합니다. 따라서 이 분석을 사용하여 번역의 작은 차이를 정확하게 검출할 때 세부 사항과 일관성에 주의를 기울이는 것이 중요합니다.