Name: 캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 학습하세요 생체외 단일 분자 이미징 분석을 통해 진핵생물의 캡 의존형 번역 역학을 연구하는 방법을. 이 기법은 벌크 번역 특성을 유지하면서 고해상도로 번역 개시와 신장 과정을 특성화하여 단백질 합성 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 건강의 국가 학회 [R01GM121847]에 의해 지원되었다; 기념 슬론 케터링 암 센터 (MSKCC) 지원 보조금 / 핵심 보조금 (P30 CA008748); MSKCC 기능 유전체학 이니셔티브.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

전형적인 시험관내 TIRF 단일 분자 실험과 비교하여, 여기에 기재된 분석기를 사용한 단일 분자 이미징은 세포 추출물의 사용과 형광으로 표기된 항체의 고농도로 인해 더욱 복잡하다. 표면 PEGylation의 한 라운드의 일반적인 관행에 비해, PEGylation (단계 2)의 두 번째 라운드는 검출 표면(15)에비특이적 항체 결합을 크게 감소시킨다. 확산형광 항체의 고농도는 항체 결합의 단일 분자 검출을 마스크하는 매우 높은 형광 배경을 일으킵니다. 이러한 형광 배경을 줄이기 위해 레이저 사고 각도가 임계 각도(단계 3.4.)보다 훨씬 높게 증가합니다. 항체 검출은 또한 과도한 불소 불안정에 의해 감소되어 거주 시간을 정량화하는 능력을 제한할 수 있습니다. 이 문제가 발생할 때, 플루오로포어를 삼중 주대기중(47)에접합한 것과 같은 더 광적인 플루오로포어로 교체하거나 레이저 조명 강도를 낮춥니다. 산소 청소 시스템은 일반적으로 ...

진핵 계통에서의 번역은 주로 7-메틸구아노신(m7G) 캡 의존경로1을통해 발생한다. 연구에 따르면 진핵 번역의 개시 단계는 속도 제한및 규정2,3,4에대한 공통의 목표임을 나타낸다. 캡 의존형 번역의 메커니즘은유전5,생화학6,7,8,구조9,및 게놈10 벌크 접근법을 사용하여 광범위하게 연구되었다. 이러한 방법은 캡 의존개시를 조절하는 다양한 메커니즘을 확인했지만, 해상도는 이기종 및 비동기 개시 이벤트에서 신호의 평균을 앙상블로 제한합니다. 최근에는 생체내 번역 이벤트가 초기 폴리펩티드(11,12,13,14)에대한에피토프에 대한 형광 항체 결합을 측정하는 방법에 의해 시각화되었다. 그러나, 이러한 새로운 접근법은 또한 다중 형광 항체가 높은 세포내 형광 배경에서 단일 번역 이벤트를 해결할 수 있도록 초기 펩티드를 결합해야 하기 때문에 개별 개시 사건을 해결하는 능력에 제한됩니다. 많은 생물학적 상호 작용에서, 해결된 개별 운동 사건은 분자 수준에서 동기화할 수 없는 복잡한 다단계 및 반복적인 생물학 프로세스를 이해하는 중요한 통찰력을 제공했습니다. 캡 의존개시 및 규제를 더 잘 이해하기 위해서는 개별 번역 이벤트의 역학을 추적할 수 있는 새로운 방법이 필요합니다.
우리는 최근에 단 하나 분자 분해능15를가진 캡 의존성 개시 운동학을 측정하는 체외 분석서를 개발했습니다. 이 개시 경로3,16에관여하는 많은 공지되고 알려지지 않은 단백질 인자를 고려하여, 단일 분자 분석체는 세포인자 및 견고한 번역활동(17,18,19,20,21,22,23,24, 25,25)의보존으로부터 이익을 얻는 기존의 체외 세포 없는 번역 시스템과 호환될 수 있도록 개발되었다. 또한, 세포 없는 번역 시스템의 사용은 단일 분자 관측및 이전 대량 결과 사이 더 호환 비교를 허용합니다. 이 접근법은 캡 의존개시의 기존 기계론적 프레임워크에 새로운 단일 분자 운동 통찰력의 직진 통합을 제공합니다. 단일 분자 분석방식을 확립하기 위해, 기존의 세포없는 번역 시스템은 세 가지 방법으로 변형된다: 에피토프 인코딩 서열은 리포터 mRNA의 개방 독서 프레임 (ORF)의 시작 부분에 삽입된다; 기자 mRNA의 3′ 끝은 단일 분자 검출 표면에 mRNA 최종 테더링을 용이하게하기 위해 바이오티닐화된다; 형광으로 표지된 항체는 번역 추출물로 보충된다. 이러한 수정은 기본적인 분자 생물학 기술과 일반적으로 사용할 수있는 시약만 필요합니다. 더욱이, 이러한 변형 및 단일 분자 이미징 조건은 대량 세포 없는 번역 반응의 번역 역학을보존한다(15).
이 분석체(그림1)에서5′-end 캡 및 3′-end 바이오타이니드 리포터 mRNA는 유동 챔버에서 스트렙타비딘 코팅 검출 표면에 고정된다. 유동 챔버는 형광으로 표지된 항체로 보충된 세포없는 번역 혼합물로 채워져 있습니다. mRNA 번역후 약 30-40코돈 하류의 에피토프서열(26,27)을위해 발생한 후, 에피토프는 리보솜 출구 터널에서 나오고 형광으로 표지된 항체와 상호 작용할 수 있게 된다. 이러한 상호 작용은 급속하고 단일 분자 형광 이미징 기술에 의한 검출을 통해 활성 세포 없는 번역 중에 단일 분자 분해능으로 번역 역학을 추적할 수 있습니다. 이 분석은 캡 의존성 번역 역학 및 규제, 특히 체외 분석에서 대량 으로 작동하는 시스템의 경우 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.
이러한 단일 분자 분석법을 확립하기 위한 전제 조건은 이전에 설명된방법(28)에따라 상업적으로 사용 가능하거나 제조된 번역 추출물을 사용하여 달성될 수 있는 대량 세포 없는 번역 분석이다. 진핵 번역 추출물은 곰팡이, 포유류 및식물(28)을포함한 다양한 세포로부터 얻을 수 있다. 이미징의 경우, 이 분석법은 튜닝 가능한 레이저 강도 및 사고 각도, 전동 식 샘플 단계, 동력 유체 시스템 및 샘플 온도 제어 장치가 장착된 TIRF 현미경이 필요합니다. 이러한 요구 사항은 현대 체외 단일 분자 TIRF 실험에 대한 일반적이며 다르게 달성 될 수있다. 여기에 제시된 실험은 재료표에나열된 시판되는 현미경, 소프트웨어 및 액세서리로 구성된 객관적인 유형의 TIRF 시스템을 사용합니다.

<table><tbody><tr><td>100X 오일 대물렌즈, NA 1.49</td><td>Olympus</td><td>UAPON 100XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스(40%, 19:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0144</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 액체 세제</td><td>Decon</td><td>5332</td><td></td></tr><tr><td>아미노실란(N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란)</td><td>UCT Specialties, LLC</td><td>A0700</td><td></td></tr><tr><td>Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CSO-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis 소프트웨어</td><td>Andor</td><td></td><td>EMCCD</td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Chroma</td><td>532/640/25</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Chroma</td><td>NF03-405/488/532/635E-25</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>Biotin-PEG-SVA</td><td></td></tr><tr><td>Coenzyme A free acid</td><td>Prolume</td><td>309-250</td><td></td></tr><tr><td>Coolterm 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>주사기 펌프 제어용</td></tr><tr><td>데스크탑 컴퓨터</td><td>Dell</td><td></td><td>현미경, 카메라, 스테이지 및 펌프를 제어합니다.</td></tr><tr><td>이색성 거울</td><td>Semrock</td><td>R405/488/532/635</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA microprep 50RNX</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1139450</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>Firefly luciferin D-Luciferin free acid</td><td>Prolume</td><td>306-250</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1185500</td><td></td></tr><tr><td>산화수소 시</td><td>그마-알드리치</td><td>216763-500ML</td><td></td></tr><tr><td>이멀젼 오일</td><td>올림푸스</td><td>Z-81226A</td><td>저자동 형광</td></tr><tr><td>루시페라제 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E1500</td><td></td></tr><tr><td>MEGASCRIPT T7 전사 키트</td><td>써모 피셔</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 과학</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>단클론 항 FLAG M2-Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9594</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVA</td><td>Laysan Bio Inc</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>MS(PEG)4</td><td>Thermo Scientific</td><td>22341</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>No 1.5 현미경 커버 유리</td><td>Fisherband</td><td>12-544-C</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 레이저, 532nm 100mM</td><td>올림푸스 디지털 레이저 시스템</td><td>CMR-LAS 532nm 100mW</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 TirfCtrl 소프트웨어</td><td>올림푸스</td><td></td><td>레이저 강도 및 입사각 제어용</td></tr><tr><td>광학 테이블</td><td>TMC 진동 제어</td><td>63-563</td><td>진동 절연 포함</td></tr><tr><td>페놀 클로로포름 이소 아밀 알코올 혼합물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-100ml</td><td></td></tr><tr><td>피어싱 RNA 3' 엔드 바이오티닐화 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>20160</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨 펠릿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Prior motorized XY translation stage</td><td>Prior</td><td>PS3J100</td><td></td></tr><tr><td>Prior PriorTest 소프트웨어</td><td>이전</td><td></td><td>전동 스테이지 제어를 위해</td></tr><tr><td>재조합 RNasin RNase Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>스테이지 상단 인큐베이터</td><td>In vivo scientific (world precision instruments)</td><td>98710-1</td><td>맞춤형 아크릴 케이지</td></tr><tr><td>염색 용기</td><td>포함 Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>43-4301</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300212</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green II</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7564</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Hamilton</td><td>1725RN</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Harvard 장치</td><td>55-3333</td><td></td></tr><tr><td>Tris (1M), pH = 7.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9850G</td><td></td></tr><tr><td>초음파 수조</td><td>Branson</td><td></td><td></td>CPX1800H</tr><tr><td>요소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia 캡핑 시스템</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-Spin IC 컬럼</td><td>Zymo Research</td><td>C1004</td><td></td></tr></tbody></table>

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존성 단백질 합성은 진핵 세포에서 주요 번역 경로입니다. 다양한 생화학 적 및 유전 적 접근은 캡 의존 성 번역 및 규제의 광범위한 연구를 허용했지만,이 번역 경로의 고해상도 운동 특성화는 여전히 부족합니다. 최근에는 단일 분자 분해능으로 캡 의존형 번역 운동학을 측정하기 위한 체외 분석서를 개발했습니다. 상기 분석법은 초기 에피토프 태그폴리펩티드에 형광표지 항체 결합을 기반으로 한다. 초기 펩타이드-리보솜-mRNA 복합체를 통해 항체의 결합 및 해리를 이미징함으로써 개별 mRNA에 대한 번역 진행을 추적할 수 있다. 여기서는 mRNA 및 PEGylated 슬라이드 제제, 번역의 실시간 이미징 및 단일 분자 궤적 분석을 포함한 이 분석 방법을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 개별 캡 종속 번역 이벤트를 추적할 수 있게 해주며 개시 및 신장 속도와 같은 주요 번역 역학을 해결합니다. 분석은 뚜렷한 번역 시스템에 널리 적용될 수 있으며 캡 의존성 번역 역학 및 번역 제어 메커니즘의 체외 연구에서 광범위하게 이점을 얻을 수 있습니다.

설명된 프로토콜에 따라 3'엔드 테더드 리포터 mRNA(그림1)의활성 세포 무분별 번역 동안 단일 분자 분해능을 가진 초기 N 단말 태그 폴리펩티드와개별 항체 상호작용의 이미징을 가능하게 한다. 최소 데모 실험은 3개의 합성 mRNA를 사용하여 보고됩니다: LUC (태그되지 않은 루시파라아제를 인코딩), LUCFLAG (3xFLAG 태그 루시파라아라기), 마력-LUCFLAG (5'리더 영역에서 안정적인 줄기 루프가 있는LUCFLAG) (그림 2C). 루시파라제-인코딩 mRNA를 사용하면 단일 분자 관측과 대량 발광 측정 사이의 비교가 가능합니다. 3' 바이오티니졸트 mRNA의 무결성은 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE) 및 RNA 염색...

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

이 프로토콜은 활성 진핵생물 번역의 단일 분자 분석을 위해 기존 cell-free translation system을 활용할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 bulk translation 특성을 보존하고 단일 분자 분해능을 제공하며 다른 bulk translation assay에서 비교적 간단하게 적용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 벌크 조건에서 효율적인 캡 의존 번역이 가능한 것으로 확인된 모든 cell-free 번역 시스템에 적용할 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 연구원인 Hongyun Wang과 Xiaohui Qu 실험실의 선임 연구원인 Anthony Gaba입니다. 단일 분자 실험을 수행하기 최소 3시간 전에 현미경 인큐베이터를 켜고 공기 흐름을 낮은 속도로 줄여 실험의 과도한 음향 방해를 방지합니다. 그런 다음 incubator 온도를 cell-free translation system에 맞는 최적의 온도로 설정합니다.실험 최소 1시간 전에 레이저 상자 뒤에 있는 레이저 전원 버튼을 누르고 레이저 안전 키를 돌린 다음 시작 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 현미경을 켜고 이미징 모드, 대물렌즈 및 필터 세트를 선택합니다. EMCCD 카메라, 스테이지 컨트롤러, 시린지 펌프 및 컴퓨터를 켜고 카메라, 레이저, 전동 스테이지 및 시린지 펌프 소프트웨어를 엽니다.레이저 제어 소프트웨어에서 연결을 클릭하여 레이저 강도를 설정하고 셔터 상자를 선택 취소한 다음 제어를 클릭하여 레이저 제어 팝업 창에서 강도 슬라이드 바를 드래그합니다. 침투 깊이를 입력하여 레이저를 원하는 각도로 설정하고 이미징하지 않을 때 레이저를 꺼짐 모드로 유지하기 위해 셔터 박스가 닫혀 있는지 확인합니다. 카메라가 냉각되고 지정된 작동 온도로 안정화되면 카메라 소프트웨어에서 획득 모드로 kinetic을 선택하고 노출 시간, kinetic series length 및 electron multiplying gain 값 매개변수를 입력합니다.디렉토리를 선택하고 데이터 이미지 파일을 저장하기 위한 파일 이름을 지정합니다. 주사기 펌프를 적당한 유속에서 빠른 유속으로 설정하고 마이크로분리 튜브에 70% 에탄올 500마이크로리터를 추가합니다. 주사기 펌프 튜브 끝을 에탄올 용액에 삽입하고 주사기 펌프 소프트웨어를 사용하여 주사기 펌프를 인출 모드와 분배 모드 사이에서 전환하여 튜브를 에탄올로 세 번 세척하고 RNase가 없는 물로 세 번 세척합니다.최종 물 세척 후 튜브 끝을 깨끗한 티슈 와이프에 두드려 튜브 내부에 남아 있는 물을 제거하고 튜브 끝을 깨끗한 마이크로퓨지 튜브에 넣습니다. 3 프라임 엔드 비오틴화된 mRNA 고정을 위해 커버 슬립 면이 아래를 향하도록 하여 플로우 챔버를 현미경 샘플 홀더에 넣고 테이프로 챔버를 고정합니다. 테이프를 사용하여 사용하지 않는 유동 채널 입구와 출구를 덮고 유동 채널에 밀리리터당 200마이크로그램 스트렙타비딘 용액 부피의 1.5배를 추가합니다.실온에서 10분 후 세척당 T50 세척 버퍼의 3배와 접힌 실험실 조직으로 채널을 세 번 세척하고 닦습니다. 마지막 세척 후 이멀젼 오일 한 방울을 현미경 대물렌즈에 떨어뜨리고 홀더와 챔버를 현미경 스테이지에 놓습니다. 그런 다음 대물렌즈의 이멀젼 오일이 커버슬립에 닿을 때까지 대물렌즈를 커버슬립에 가깝게 가져오고 s를 이동합니다.tage 유동 채널의 위치가 대물렌즈 바로 위에 있도록 합니다.microscope control touchscreen에서 focus 탭을 선택하고 focus search and start(초점 검색 및 시작)를 클릭합니다. 초점 평면이 성공적으로 달성되면 신호음이 들립니다. 카메라 소프트웨어에서 라이브 모드를 선택합니다.레이저 제어 소프트웨어에서 레이저 셔터를 열고 레이저 강도 수준을 조정합니다. 라이브 모드와 현미경 제어 터치스크린에서 미세 단계 제어를 사용하여 대물렌즈 위치를 조정하여 실시간 형광 이미지를 관찰합니다. 카메라 소프트웨어에서 스테이지를 이동하여 유동 채널 감지 표면의 다양한 영역에서 형광 배경 수준을 평가합니다.형광이 낮으면 라이브 모드를 중지하고 레이저 제어 소프트웨어의 레이저 셔터를 닫고 유동 채널의 세척 버퍼를 비오틴화된 mRNA 용액 부피의 2배로 교체합니다. 15분 후, 세척당 translation compatible buffer의 3배로 채널을 3회 세척합니다. 단일 분자 검출의 경우, mRNA 없이 갓 해동한 번역 믹스 부피의 3배를 조립하고 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 최적화된 농도의 형광 표지 항체를 보충한 다음 튜브를 잠시 돌려 튜브 바닥에서 혼합물을 수집합니다.translation mix를 700 microlit microfuge tube cap 내부로 옮기고 주사기 펌프를 회수 모드로 설정합니다. 펌프 튜빙 끝을 번역 혼합물에 삽입하고 주사기 회수를 시작합니다. translation mix가 pump tubing에 완전히 유입되면 회수를 중지하고 주사기 펌프 설정을 분주 모드로 전환한 다음 translation mix 전달을 위한 최적의 속도로 흐름을 설정합니다.필요에 따라 병진 혼합물이 튜빙 끝에 도달할 수 있도록 주사기를 시작 및 중지하고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 펌프 튜빙 끝을 흐름 채널의 입구에 삽입합니다. 맞춤형 금속 브래킷을 현미경 샘플 홀더 플레이트에 나사로 고정하여 연결을 안정화하고 현미경 초점 및 이미징 영역 형광을 평가합니다. 동영상 획득 매개변수가 올바른지, 파일을 저장하기 위해 적절한 파일 이름과 디렉토리가 입력되었는지 확인합니다.스테이지를 이동하여 흐름 채널 감지 표면의 중앙에 있는 영역을 이미징할 수 있도록 합니다. 그리고 연속 AF 탭에서 시작 버튼을 클릭합니다. 초점면이 성공적으로 달성되면 신호음이 들립니다.주변광을 줄인 후 레이저 셔터를 열고 신호 받기 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 5초 후 run 명령을 입력하여 변환 믹스를 흐름 채널로 전달합니다. 그런 다음 프레임 시간당 0.5초에서 2초의 해상도로 최대 2시간 동안 데이터를 기록합니다.Cy3 ANTI-FLAG 결합 이벤트를 분석하기 위해 선택한 Cy3 알파 플래그 스폿의 형광 강도를 전체 영화에 대해 프레임별로 계산하고 연결하여 강도 궤적을 형성했습니다. 원시 궤적은 노이즈가 있는 것처럼 보일 수 있으며 배경 노이즈를 줄이기 위해 비선형 앞으로/뒤로 필터를 사용하여 미세 조정해야 할 수 있습니다. 궤적을 디지털화하기 위해 단계 감지 알고리즘을 사용하여 더욱 세분화할 수 있습니다.초기 폴리펩타이드에 대한 항체 결합은 형광의 순간적인 증가를 유발하는 반면, 항체 폴리펩티드 해리는 순간적인 형광 감소를 유발합니다. 루시페라제 플래그 mRNA에 대한 체류 시간 히스토그램은 로그 정규 분포에 적합하며 초당 2.5 플러스 또는 마이너스 0.1 아미노산의 펩타이드 합성 속도를 산출합니다. 첫 도착 시간 히스토그램은 shifted log normal function에 적합하며, 이는 단일 mRNA 번역 활성에서 높은 수준의 이질성을 보여줍니다.히스토그램에서 알 수 있듯이, 단일 루시페라제 플래그 mRNA 분자에 대한 첫 번째 펩타이드 합성 이벤트는 번역 믹스 전달 후 빠르면 2분에서 늦어도 20분 후에 시작될 수 있습니다. 루시페라제 플래그 mRNA를 사용한 번역과 비교했을 때, 헤어핀 루시페라제 플래그 mRNA를 사용한 첫 번째 도착 시간 히스토그램은 항체 결합 속도가 느린 것으로 나타났습니다. 그러나 이와 동일한 mRNA를 사용한 cell-free translation 반응에서 벌크 발광 측정을 사용하는 것은 translation kinetics의 차이를 해결하지 못합니다.이 분석법의 단일 분자 분해능은 다른 접근법으로는 쉽게 얻을 수 없는 캡 의존적 번역에 대한 보다 역동적인 통찰력을 제공합니다. 진핵생물 cell-free translation은 작은 변화와 실험 조건에 민감합니다. 따라서 이 분석을 사용하여 번역의 작은 차이를 정확하게 검출할 때 세부 사항과 일관성에 주의를 기울이는 것이 중요합니다.

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Research

연구

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Biochemistry

생화학

우리는 이미지 절단하여 형광 현미경 방법, 공동 병진 인증 (CoTrAC), 단백질의 기능을 perturbing없이 단일 분자 정밀도 라이브 세포의 단백질 분자의 생산을 설명합니다. 이 메소드는 전사 인자, λ 억제 CI의 확률 표현 역학을 수행하는 데...

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

SINEUPs는 합성 센스 비 코딩 RNAs는 바인딩 도메인 (BD)와 이펙터 도메인 (ED)를 포함 하 고 최대 조절의 번역 대상 mRNA. 여기, 우리 교양된 셀 라인, 서양 오 점 및 이미징 시스템 반자동된 높은 처리량의 번역 홍보 활동의 분석에 SINEUPs에 대 한 검색 방법을 설명 합니다.

셀 기반 비 코딩 RNAs 특히 mRNA 번역을 향상 시킬 수 있는 SINEUP의 분석 실험

우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

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단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

우리는 살아있는 효모와 포유류 세포에서 포름알데히드가 교차하는 번역 (단백질 생합성) 복합체를 급속하게 안정화시키는 기술을 제시합니다. 접근은 과도 중간및 동적 RNA:단백질 상호 작용을 해부할 수 있습니다. 교차 연결된 복합체는 심층 시퀀싱 기반 프로파일링 방법, 현미경 검사법 및 질량 분석법과 같은 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용할 수 있습니다.

진핵 세포에서 번역 단지의 신속한 생체 내 고정 및 격리

단일 분자 형광 에너지 전달은 리보소말 단백질 합성 시 tRNA 역학을 추적하는 방법입니다. 개별 리보솜을 추적함으로써, 불동성 집단 집단이 식별되어 메커니즘에 빛을 비추게 됩니다. 이 방법은 다른 많은 복잡한 생물 시스템에서 동적 기능 관계를 밝히기 위해 일반적으로 생물학적 형성 변화를 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 단일 분자 방법은 평균 효과로 인해 기존의 앙상블 방법에 의해 접근할 수 없는 비비율 제한 단계 및 낮은 인구밀도키 중간체를 관찰할 수 있다.

리보솜 단백질 합성의 단일 분자 형광 에너지 전송 연구

이 프로토콜은 플루오로 생성 RNA 압타머 시금치2 및 브로콜리의 동역학을 결정하는 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 플레이트 리더로 시험관 내에서 형광 발생 압타머 역학을 측정하는 방법을 설명하는 반면, 두 번째 방법은 유세포 분석에 의한 세포의 형광 발생 압타머 역학 측정을 자세히 설명합니다.

플루오로겐 RNA 압타머에 대한 시험관 내 및 세포 턴온 역학 결정

학습하세요 생체외 단일 분자 이미징 분석을 통해 진핵생물의 캡 의존형 번역 역학을 연구하는 방법을. 이 기법은 벌크 번역 특성을 유지하면서 고해상도로 번역 개시와 신장 과정을 특성화하여 단백질 합성 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

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