오스트레일리아 싱크로트론의 직렬 결정학 측정을 위한 지질 주입 프로토콜

이 프로토콜은 과학자들이 고점도 물질뿐만 아니라 현재 기존 설정을 사용하여 특성화하기 어려운 기타 연성 물질에 포함된 단백질 결정을 특성화할 수 있는 기회를 제공합니다. 이 방법을 사용하여 주입기에 직접 장착된 유리 주사기에서 시료를 준비하여 주입기 시스템을 쉽게 사용하고 시료 낭비를 최소화합니다. 고점도 매체에서 결정을 준비하려면 먼저 결정 용액을 저속으로 원심분리하여 부드러운 결정 펠릿을 형성합니다.

여분의 매체를 제거한 후 100마이크로리터 유리 주사기 1개의 끝에 커플러를 고정하고 28마이크로리터의 결정 용액을 주사기 배럴에 로드합니다. 플런저를 주사기 상단에 천천히 삽입하고 용액을 커플러 팁 끝까지 부드럽게 밀어 넣습니다. 기포를 제거하려면 장갑을 낀 한 손가락을 사용하여 무딘 커플러 바늘 끝의 상단에 매우 부드러운 압력을 가하여 밀봉을 만들고 플런저를 후퇴시켜 바늘 끝에서 용액을 빼내어 주사기 내에 압력을 축적한 다음 손가락을 제거하여 압력을 빠르게 해제하고 주사기 내의 기포를 터뜨립니다.

또는 바늘이 위를 향하고 플런저를 두 손가락 사이에 끼운 상태에서 한 손으로 주사기를 잡고 주사기를 한 방향으로 잡고 팔을 빠르게 2-3회 회전합니다. 그 결과 발생하는 원심력은 주사기에서 기포를 밀어냅니다. 기포가 모두 제거되면 가는 주걱을 사용하여 42마이크로리터의 고진공 실리콘 그리스를 두 번째 100마이크로리터 주사기 상단에 직접 추가하고 플런저를 끝까지 눌러 기포를 제거하고 주사기 끝에 에어 갭이 없는지 확인합니다.

두 주사기에서 기포가 모두 제거되면 양쪽 주사기의 끝을 잡고 커플러로 주사기를 부착합니다. 샘플을 함께 혼합하려면 재료가 완전히 혼합되고 균질한 것처럼 보일 때까지 결정 용액과 실리콘 그리스 실린지 플런저를 모두 50-100회 부드럽게 순차적으로 누릅니다. 그런 다음 광학 현미경으로 결정을 시각화합니다.

실리콘 그리스의 결정 농도를 확인하려면 광학 현미경 이미지를 사용하여 특정 영역에 있는 결정의 수를 세십시오. 결정 농도를 줄이려면 더 많은 양의 실리콘 그리스를 사용하여 결정 준비를 반복하거나 주사기 설정 전에 결정 펠릿을 결정화 버퍼에서 희석합니다. 결정 농도를 높이려면 더 적은 양의 실리콘 그리스를 사용하여 결정 준비를 반복하고 점도를 10파스칼초 미만으로 낮추지 않도록 주의하십시오.

적절한 결정 농도가 얻어지면 전체 샘플을 단일 주사기로 옮기고 커플러를 주사기 바닥에 매우 단단히 나사로 고정된 108미크론 내경 주입 바늘로 교체합니다. 인젝터를 설정하려면 도구와 원점 복귀 모드 및 음극 리미트 스위치를 선택하고 원점 복귀를 시작하고 100마이크로리터 주사기가 나사 아래에 맞을 만큼 나사가 충분히 집어넣을 때까지 소프트웨어를 실행합니다. 주사기 홀더의 슬릿을 통해 빈 주사기의 바늘을 삽입하여 주사기를 주입기에 장착하고 주사기를 브래킷에 맞춥니다.

주사기의 중간 부분을 가로질러 하나의 O-링을 감고 주사기 양쪽에 있는 고리에 링을 부착하고 주사기 위쪽에 있는 고리 주위에 두 번째 O-링을 감습니다. 두 번째 O-링의 한 부분이 유리 주사기 위에 위치하는지 확인합니다. 샘플 주사기를 준비하려면 주사기를 프라이밍하고 주입기 캡을 샘플 주사기 플런저 헤드에 놓고 주사기를 주입기에 로드합니다.

드라이브 나사를 캡 상단으로 이동합니다. 인젝터 제어 소프트웨어에서 속도 모드를 선택하고 속도 모드를 활성화합니다. 설정 값을 분당 3, 000 회전으로 설정하고 설정 값 적용을 클릭합니다.

나사가 실린지 플런저 헤드의 캡에 접근하면 설정 값을 0으로 변경합니다. 접촉이 이루어지면 설정 값 적용을 클릭하여 사전 설정 값을 활성화하고 나사를 즉시 중지합니다. 그런 다음 캡을 부드럽게 흔들어 제자리에 단단히 고정되었는지 확인합니다.

주입기를 실행하려면 설정 값을 분당 100회전으로 변경하고 팁을 육안으로 검사하여 샘플이 압출되기 시작할 때 관찰합니다. 허치를 닫은 후 느리지만 안정적인 재료 흐름이 관찰될 때까지 설정 값을 10씩 감소시킵니다. 샘플 스트림이 잘 흐르지 않으면 스트림이 더 직선이 될 때까지 분당 10회전씩 설정 값을 높입니다.

스트림이 안정화되지 않으면 폴리스티렌 sample 아래에 sample 캐처를 sample 안내를 돕기 위해ample. 또는 Venturi 흡입 깔때기를 샘플 캐처에 삽입하여 호주 싱크로트론의 허치에 있는 공기 배출 튜브에 연결할 수 있습니다. 흐름의 유속을 측정하려면 Lipidico 장치 유량 계산기를 사용하십시오.

주입기의 최적 시료 실행 속도를 결정하는 것은 스트림 안정성에 매우 중요합니다. 유속이 느리면 인젝터에서 압출되는 실리콘 그리스가 팽창하는 반면, 유속이 빠르면 흐름이 더 얇아집니다. 점성이 있는 미디어 스트림의 말림이 정기적으로 관찰되었습니다.

전하가 높은 샘플에서 이 문제를 극복하기 위해 폴리스티렌 캐처를 사용하여 약한 정전기력을 도입할 수 있습니다. 이 분석에서는 실리콘 그리스에 현탁된 26마이크로리터의 라이소자임 결정을 포함하는 유리 주사기를 사용했습니다. 38분 이내에 충분한 양의 데이터가 수집되어 라이소자임 구조에서 이황화 결합을 둘러싼 전자 밀도 맵을 생성할 수 있었습니다.

유리 슬라이드에 소량의 샘플을 사용하여 샘플의 결정 농도를 평가하고 점도를 보정해야 하는지 여부를 결정하는 것을 잊지 마십시오. 인젝터의 다양성으로 인해 다른 고점도 물질의 X선 특성화가 가능합니다. 예를 들어, 배터리 연구를 사용하는 이온 액체 구조 또는 유제품을 사용하는 콜로이드 재료가 있습니다.