Name: 장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 장기 온-어-칩 3D 모델과 공초점 단층 촬영 및 기계 학습을 활용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 암 세포와 혈뇌장벽 상호작용을 분석하고 뇌 전이 예측 진단 도구로 활용됩니다.

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MDA-MB-231-BR-GFP 세포의 관대 한 기부에 대 한 국립 암 연구소에서 Steeg 연구소에 감사 합니다. 공초점 현미경 검사는 미시간 대학 생물 인터페이스 연구소 (BI)에서 수행되었다. 흐름 세포측정은 미시간 유동 세포측정 코어 대학에서 수행되었다. 바이러스 벡터는 미시간 벡터 코어 대학에 의해 만들어졌습니다. 우리는 또한 이러한 데이터의 통계 분석에 대한 지침을 켈리 키드웰 감사합니다.
자금:
C.R.O.는 NIH T-32 교육 펠로우십(T32CA0009676) 및 1R21CA245597-01에 의해 부분적으로 지원되었습니다. T.M.W.는 1R21CA245597-01 및 국립 보건원의 번역 과학 발전 센터인 UL1TR002240에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 재료 및 특성화에 대한 기금은 수여 번호 1R21CA245597-01, P30CA0046592, 5T32CA0009676-23, CA196018, AI116482, 메타비보르 재단, 메타비보르 재단, 유방암 연구 하에 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 제공되었다. 이 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

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선언할 공개는 없습니다.

우리는 뇌 조직으로내피 장벽을 통해 암세포의 사치화 및 이동측정을 위해 임상 이미징 분석에 자주 활용되는 도구를 적응시키는 새로운 방법을 개발하고 제시했습니다. 우리는 이 접근 방식이 생체 내 및 체외 측정 모두에 유용할 수 있다고 제기합니다. 우리는 뇌 혈관을 재구성하는 3D 미세 유체 시스템에 그것의 사용을 입증했습니다. 암 세포 측정은 이 기술을 사용하여 양화된 거리, 부피, 구형 및 부피에 의해 사치되는 백분율을 포함합니다. 부피에 의해 사치화된 거리와 백분율은 사용자가 칩 내의 암세포의 위치를 재구성하여 조직 내장벽 및 이주를 통해 사치를 평가할 수 있게 합니다. 구형 및 부피와 같은 세포 형상 측정은 각 시점에서 셀의 동적 움직임 또는 기능과 관련이 있습니다. 철새 MDA-MB-231-BR-GFP 세포는 처음에 μmBBN 장치에 도입될 때 높은 수준의 구형성을 나타내고 움직임을 감소시키고 틈새 시장을 식민지화하기 시작하면서 구형이 덜 구형이 됩니다. MDA-MB-231-GFP 및 MDA-MB-231-BR-GFP의 전반...

뇌 전이는 가장 치명적인 암 병변; 모든 암의 10-30%는 뇌로 전이되고, 암 유형1에따라 5-20개월의 중간생존율로, 1,2. 암 전이를 연구할 때 발생하는 주요 질문은 서브 클론이 혈류의 유머 환경에서 뇌3,,4와같은 기관으로 이동하는 방법입니다. 이 질문은 이주, 침략 및 사치스러운 에세이의 많은 변형으로 이어졌습니다. 이러한 모든 방법은 자극에 대한 응답으로 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 셀의 특성을 계산하거나 측정하는 중요한 단계를 공유합니다. 쉽게 구할 수 있는 대부분의 이주 소는 암세포의 2차원 (2D) 이동을 연구하기 위하여 이용됩니다. 이들은 풍부한 지식을 해명했다. 그러나, 그들은 다른 방법이 제공할 수 있는 생체 내 시스템의 입체적 특성을 회수하지 않는다5. 따라서 3차원(3D) 시스템에서 종양 미세 환경(TME)을 연구할 필요가 있지만 3D 구조에 사용할 수 있는 분석 접근법은 제한적이고 종종 일치하지 않는다.
가장 인기있는 3D 도구 중 하나는 두 개의 별개의 영역을 분리, 우물의 바닥에 중단 막으로 구성된 보덴 챔버입니다. 보이덴은 백혈구 화학요법4를연구하기 위해 분석법을 도입했다. 상기 하부 영역은 화학 또는 다른수단6,,7이 상부 부위에서 세포를 유도하여 하부 영역으로 이동하도록 유도함으로써 변화될 수 있다. 마이그레이션된 세포의 수를 정량화하는 가장 일반적인 접근법은 완충액을 사용하여 멤브레인의 바닥에서 세포를 방출하고, 이를 lyse한 다음, 용액7에서DNA 함량의 양에 기초하여 세포를 계산하는 것이다. 이러한 간접적인 접근법은 기술 적 변동성으로 인해 운전자 오류가 발생하기 쉬우며 절차는 암 표현형 및 마이크로 환경에 대한 정보를 파괴합니다. 보덴 챔버 분석의 변화는 막에 남아 있는 철새 세포의 고정을 포함하지만, 지속적인 연구를 위해 더 이상 실행 가능한 세포의 수를 제공합니다6,,8,,9.
보덴 챔버의 한계와 미세 유체 지역 사회에서 혁신의 성장으로 인해, 이주 분석 칩은 3개의 10,,11,,12가아닌 한 방향으로 자극에 대응하여 세포의 움직임을 관찰하는 개발되었습니다. 이러한 마이그레이션 해석은 결과의 더 나은 해석을 가능하게 하는 흐름 또는 단세포분리(13,14)와14 같은 요인에 대한 제어를 용이하게 한다. 그러나 2D 형식은 필연적으로 동적 정보를 잃게 됩니다. 최근 연구는 3D 환경에서 사치(즉, 혈액 뇌 장벽과 같은 조직으로 순환에서 세포의 이동)에 초점을 맞추고 있다14,,15. 세포 장벽/멤브레인에서 발생하는 조직 및 프로빙 거동으로의 사치거리는 보덴 챔버 또는 2D 미세 유체 이동장치(16)를사용하여 수집된 측정보다 더 정제된다. 따라서 3D 사치에 대한 적절한 이미징 및 분석을 가능하게 하는 장치는 이러한 정교한 측정을 캡처하는 데 매우 중요하지만 문헌에는 부족합니다.
이주 와 무관하게, 강력한 이미징 기술은 3D 공간17,,18에서조직을 식별하고 정확하게 재구성할 수 있는 자기 공명 영상(MRI) 및 단층 촬영을 위해 개발되었다. 이러한 기술은 조직의 특성에 기초하여 이미지의 z 스택 및 세그먼트 부분에서 이미지를 수집한 다음 분할된 이미지를 3차원 메쉬19,,20,,21로변환한다. 이를 통해 의사는 3D 개별 장기, 뼈 및 혈관을 시각화하여 수술 계획에 도움을 주거나 암 또는 심장 질환 의 진단에 도움을 주거나22,,23을할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 이 접근이 현미경 견본 및 3D 사치 장치에 사용하기 위해 적응될 수 있다는 것을 보여줄 것입니다.
이를 위해, 우리는 기존의 단층 촬영 도구를 적응하여 멤브레인을 통해 종양 세포의 사치를 연구할 수 있는 유연성을 제공하는 본원에 제시된 혁신적인 공초점 단층 촬영 기술을 개발했습니다. 이 접근은 내피 세포 층과 같은 세포 장벽과 상호 작용할 때 암 세포 행동의 전체 영역의 연구를 가능하게 합니다. 암세포는 탐구 행동을 나타낸다; 일부는 침입할 수 있지만 멤브레인에 가깝게 남아 있는 반면, 다른 사람들은 장벽을 쉽게 통과합니다. 이 기술은 모든 차원에서 셀의 표현형에 대한 정보를 산출할 수있다(24). TME를 연구하기 위하여 이 접근법을 사용하는 것은 생체 내 murine 모형에 있는 더 복잡한에 비교될 때, 상대적으로 저렴하고, 해석하기 쉽고, 재현할 수 있습니다. 제시된 방법론은 기질 영역을 적응시킴으로써 많은 유형의 종양 및 미세 환경의 연구를 위한 강력한 기초를 제공해야 합니다.
3D 미세유체 혈액 뇌 틈새(μmBBN)플랫폼(그림 1)의사용을 설명하고 시연하며, 장벽과 틈새(뇌 미세혈관 내피 세포 및 성상세포)의 중요한 원소가 장기간 배양될 수 있는 곳(약 9일), 공초점 미세검사에 의해 형광을 배양하고, 공초점 마이크로카피에 의해 배양된형광(2)을사용하여 재초점한 이미지를 사용하여 재구성됨); 모두 반복가능하고 정량적인 방식으로 종양 미세 환경의 미세 전이 및 변화를 이해하는 것을 목표로 했다. 뇌 틈새 와 혈액 뇌 장벽 인터페이스는 지하 막에 의해 강화되는 뇌 미세 혈관 내피 세포로 구성되어, 성상세포 발, 및 pericytes25. 우리는 혈액 뇌 장벽의 형성과 조절에 중요성을 감안할 때 성상 세포및 내피 성분에 선택적으로 집중했습니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 암세포 및 종양 미세 환경 세포 및 유머 성분을 제조, 종자, 이미지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 기계 학습이 모델 μmBBN을 통해 통과 할 수있는 암세포의 본질적인 현상적 차이를 식별하고 뇌 전이성 전위24의객관적인 지수를 할당하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터 세트는 전이, 치료 전략 및 둘 다에서 TME의 역할에 대한 기본 및 번역 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA(페놀 레드 포함</td>) <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1.5mm 생검 펀치(플런저 포함</td>) <td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>150mm 페트리 디쉬</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS, Ca 및 Mg</td><td>미포함 Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>200uL 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>4인치 실리콘 웨이퍼</td><td>University Wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>48mm 너비 포장 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-072-097</td><td></td></tr><tr><td>50 x 75mm 유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>A1 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9-20</td><td></td></tr><tr><td>항생제/항진균제(페니실린/스트렙토마이신/암포테리신)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>박스 커터 블레이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1721575</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>DMEM(4.5g/L 포도</td>당 <td>포함) Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청, 열 비활성화</td><td>Corning</td><td>MT35011CV</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 소프트웨어</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25D</td><td></td></tr><tr><td>glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>35050061</tr><tr><td>hCMEC/D3</td><td>EMD Millipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Jupyter notebook</td><td>Anaconda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel - 페놀 레드로 성장 인자 감소</td><td>Corning</td><td>CB-40230A</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231-BR-GFP</td><td>Dr. Patricia Steeg, NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 성장 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>정상 인간 성상세포(NHA)</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td></td></tr><tr><td>오렌지 소프트웨어</td><td>류블랴나</td><td></td><td></td>대학</tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>포토리소그래피 마스크</td><td>Photosciences Incorporated</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7-dsRed</td><td>미시간 대학교 벡터 코어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLL-EV-GFP</td><td>미시간 대학교 벡터 코어</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pLOX-TERT-iresTK</td><td>Addgene</td><td>12245</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>폴리 카보네이트 멤브레인, 5um 기공 크기</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>PureCol, 3 mg/mL</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005</td><td>Type I 소 콜라겐</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080094</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>솔로 컵</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1416545</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2075</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 개발자</td><td>MicroChem Corporation</td><td>Y020100 4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>실가드 184</td><td>엘스워스 접착제 회사</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>시그마-알드리치</td><td>179965-1L</td><td></td></tr><tr><td>트리콜로로 퍼플루오로 옥틸 실란</td><td>시그마-알드리치</td><td>448931-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 온-a 칩 3d 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography

뇌 전이는 가장 치명적인 암 병변; 모든 암의 10-30%는 암 유형에 따라 ~ 5-20 개월의 중간 생존과 함께 뇌로 전이됩니다. 뇌 전이성 종양 부담을 줄이기 위해 기본 및 번역 지식의 격차를 해결해야합니다. 주요 과제는 재현 가능한 전임상 모델 및 관련 도구의 빈약성을 포함합니다. 뇌 전이의 3차원 모델은 전용 분석 도구와 결합될 때 이러한 요구를 해결하는 데 사용되는 관련 분자 및 페노티픽 데이터를 얻을 수 있습니다. 더욱이, 뮤린 모델에 비해, 뇌 마이크로환경으로 혈액뇌 장벽을 통과하는 환자 종양 세포의 장기-온-칩 모델은 결과를 빠르게 생성하고 정량적 방법으로 해석이 가능하므로 높은 처리량 테스트에 의존한다. 여기서 우리는 틈새 시장의 다중 요소가 장기간(며칠) 동안 배양될 수 있는 새로운 3D 미세 유체 혈액 뇌 틈새(μmBBN) 플랫폼의 사용을 설명하고 시연하며, 공초점 현미경검사에 의해 형광으로 이미지되고, 혁신적인 공초점 단층 촬영 기술을 사용하여 재구성된 이미지; 모두 반복가능하고 정량적인 방식으로 종양 미세 환경(TME)의 미세 전이 및 변화를 이해하는 것을 목표로 했다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 암세포 및 TME 세포 및 유머 성분을 제조, 씨앗, 이미지 및 분석하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 인공 지능 (AI)이 모델 μmBBN을 통해 통과 할 수있는 암세포의 본질적인 현상적 차이를 식별하고 뇌 전이성 전위의 객관적인 지수를 할당하는 데 어떻게 사용되는지 보여줍니다. 이 방법에 의해 생성된 데이터 세트는 전이에 대한 기본 및 번역 적 질문에 대답하는 데 사용할 수 있습니다, 치료 전략의 효능, 둘 다에서 TME의 역할.

이 기술을 사용하여, 우리는 다른 형광 단백질 또는 염료로 표지된 세포 모형을 분석했습니다. 우리는 hCMEC/D3-DsRed 및 비 형광 성상세포로 제조된 μmBBN 칩으로 이 접근법의 사용을 보여줍니다. 뇌 미생물 내피 세포는 다공성 멤브레인 (5 μm 트랙 에칭 모공)에 시드되고 5 % CO2미만의 37 °C에서 인큐베이터34에 배치되었다. 3일 후 내피층의 합류는 현미경검사를 통해 확인되었고, 그 후 암세포는 내피층 위에 배치되었다. 2개의 유방암 세포주, MDA-MB-231-BR-GFP라고 불리는 뇌를 추구하는 클론, 및 부모 MDA-MB-231-GFP 세포는 성상체 뇌 틈새 시장을 포함하는 μmBBN 칩에 입력하였다35,,36,,37,,38...

여기에서는 혈액 뇌 장벽 전이성 종양 미세 환경을 준비하고 배양한 다음 공초점 이미징 및 인공 지능 (기계 학습)을 사용하여 상태를 정량화하기위한 프로토콜을 제시합니다.

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

Brain metastases are the most lethal cancer lesions; 10-30% of all cancers metastasize to the brain, with a median survival of only ~5-20 months, ...

공초점 단층 촬영은 세포 장벽 및 틈새 시장과 상호 작용하기 때문에 암 세포 행동의 전체 영역을 얻기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 전이가 발생할 때 전이를 연구하기위한 기초를 제공합니다. 이 방법은 라이브 셀 동작을 정량화하는 데 유용합니다.공초점 단층 촬영은 기계 학습과 결합될 때 다양한 장기 온 칩 플랫폼에 유용합니다. 1 차 또는 재발종양 또는 순환 종양 세포를 분석하는 것은 두뇌 전이를 예측하고 비 두뇌 전이성 세포에서 두뇌 전이성을 분별하는 중요한 진단 공구를 구성할 수 있습니다. 미세 유체 BBN 장치를 조립하려면 진공 건조기에서 장치를 입구가 아래로 향하고 전체 설정을 플라즈마 챔버로 배치하여 적절한 표면으로 이송합니다.전체 설정을 플라즈마 챔버에 넣고 진공을 당기고 80 와트에서 30 초 동안 플라즈마로 장치를 처리하십시오. 치료가 끝나면 가이드를 사용하여 장치를 신속하게 배치하고 실험실 벤치의 유리 슬라이드에 입구 측면을 올려 놓고 장치의 PDM과 슬라이드 사이의 영구적 인 결합을 만듭니다. 다음으로, 200 마이크로리터 파이펫 팁을 삽입하고, 팁에서 2밀리미터를 모든 입구와 콘센트에 잘라서 장치를 플라즈마 챔버에 8분, 200와트 플라즈마 처리를 배치합니다.장치가 냉각된 후 장치를 멸균 보조 용기에 넣고 플라스미드 처리 후 15분 이내에 콜라겐 성상세포 용액 120마이크로리터를 하단 챔버의 파이펫 팁을 통해 장치에 옮기십시오. 용액이 챔버를 가로질러 반대 쪽 파이펫 팁으로 심을 수 있도록 하고 장치의 다음 채널을 채웁니다. 장치의 네 개의 채널이 모두 채워지면 칩을 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 배치합니다.콜라겐이 설정되면, 적절한 완전한 세포 배양 배지로 바닥 챔버를 공급하는 모든 파이펫 팁을 빌링하고 완전한 내피 배지에서 2 % 성장 인자 감소 된 matrigel로 상부 챔버를 코팅합니다. 두 챔버가 코딩된 경우, 적절한 매체로 상부 챔버를 헹도하기 전에 장치를 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 교대 팁은, 팁 당 세포의 총 4 개의 알리쿼트에 대한 15 분마다 상부 챔버로 팁을 통해, 적절한 매체의 밀리리터 당 10 ~ 여섯 번째 내피 세포 당 10 의 30 마이크로 리터를 참조하십시오.시드 사이에 장치를 배양합니다. 모든 내피 세포가 시드되면 모든 팁을 배지로 채우고 장치를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 반환한다. 내피층이 성숙되면, 칩내 배지를 교체하여 각 상부 챔버 채널을 30 마이크로리터로 10~6개의 암세포로 적절한 배지의 밀리리터당 10마이크로리터로 보충한다.세포의 각 30 마이크로리터 알리쿼트가 시드된 후, 15분 동안 인큐베이터로 장치를 반납한 다음, 24~48시간 동안 세포 배양 배양에 장치를 반환하는 적절한 배지로 모든 팁을 채운다. 장치가 배양 및 이미지된 후, 암세포의 표현형을 측정하고, 제공된 소프트웨어를 열고, 공초점 이미지를 메모리로 읽습니다. 이 소프트웨어는 별도의 TIFF 파일에 3D 공초점 이미지에서 각 색상 채널을 저장합니다.각 현미경 채널에 대한 불투명도 변경 값을 선택하고 배경이 제거되고 셀 내의 형광만 남아 있도록 이미지에 있는 색상 채널의 채널 알파 값을 조정합니다. 효과를 시각화하려면 3D 렌더링 보기를 선택하여 임계값이 올바르게 설정되어 있는지 확인하고 이미지가 올바른 것처럼 보이는 경우 실험 추적기 스프레드시트에 불투명도 값을 저장합니다. 그런 다음 행진 큐브를 사용하여 볼륨 이미지를 VTK 데이터 형식에 저장된 개별 3D 삼각형 메시 개체로 변환합니다.내피 장벽에 비행기에 맞게 먼저 셀 중심을 찾습니다. 폴리데이터 연결 필터를 사용하여 VTK 파일의 메쉬 목록을 반복하여 연결되지 않은 영역을 추출합니다. 각 메시의 중심을 계산하고 너무 크거나 너무 작은 메시에 대한 센트로이드 필터링 목록에 측정값을 추가합니다.내피 셀의 중심 구조 목록에 평면에 맞게하려면 오류 메서드를 최소화하고 RFP 중심 및 평면 적합성 시각화를 실행하여 비행기에 맞게 생성 및 플롯및 평면의 적합성을 검사하여 필요에 따라 수동으로 착용감을 조정합니다. 평면이 제대로 장착된 경우 평면의 정상을 실험 추적기 파일에 저장합니다. 평면으로 내피층을 특성화한 후 각 암세포 표현형을 측정하기 위해, 셀 분석 기능을 로드하고 실험 추적기 정보에서 읽기를 실행하고 존재하는 채널을 분석한다"고 VTK 파일의 각 영역을 반복하고 분석한다.각 영역에 대해 함수는 멤브레인 아래의 메시가 계산되도록 각 셀을 잘라냅니다. 세포 표현형을 측정하려면 각 암세포의 모양, 부피 및 위치를 계산합니다. 그런 다음 각 잘린 암 세포의 부피 와 위치를 측정하여 내피 장벽을 통해 사치스러운 세포의 비율을 계산합니다.여러 실험에 대한 이러한 단계를 수행한 후 데이터를 스프레드시트에 저장하기 위해 데이터를 단일 xlsx 파일로 내보내도록 실행합니다. 컨플루언스 내피 장벽이 있는 미세유체 BBN 칩은 실험에 허용되며, 특히 내피 커버리지가 열악한 미세유체 BBN 칩은 그렇지 않습니다. 이 대표적인 분석에서 암 세포주를 찾는 뇌는 내피 장벽을 가로 질러 사치화하고 노출 후 2 9 일 동안 미세 유체 BBN 칩의 뇌 틈새 공간으로 깊숙이 이동하는 세포의 하위 집단을 나타내며, 부모의 암세포는 뇌 틈새 공간에서 장벽 위에 상당한 비율을 유지했습니다. , 뇌 전이성 암 세포 인구는 100 % 이상 사치된 세포의 비율을 유지했습니다.암 세포 모양의 형태학적 정량화는 부모 세포가 1일 후 시드후 구형 세포가 적다는 것을 보여주었으며, 2일과 9일 간의 상호 작용 후 두 암 세포주가 구형체를 감소시키는 쪽으로 경향을 보였다. 또한, 혈관 틈새 시장으로 사치화암 세포 하위 인구는 뇌로 사치화하지 않고 내피 장벽과의 상호 작용에 남아 있는 암세포에 비해 크기가 작았다. 암 세포주 및 환자 유래 이종이식을 찾는 뇌는 기계 학습에 의한 뇌 전이성 및 비뇌 전이성 암세포를 구별하기 위해 악용될 수 있는 미세유체 BBN 칩에 표면 패턴을 나타낸다.자기 선택이 중요합니다. 더 높고 낮은 통로 수를 가진 내피 세포는 가변 장벽 행동을 나타냈다. 또한, 암세포와 그들의 형광발현은 시간이 지남에 따라 변할 수 있다.이 절차 후에, 연구원은 전이의 분자 기계장치를 공부하기 위하여 장치에 있는 비밀의 가정 또는 세포의 분자 프로파일링을 채택할 수 있습니다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 틈새 구성 요소의 정량적 이미징과 엔지니어링 된 마이크로 환경을 결합하여 암세포와 그 마이크로 환경 사이의 복잡한 상호 작용을 탐구 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

이 비디오는 3D 공동 문화 시스템의 개발을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 막에 놓고 형광 표지된 인간 뇌종양 세포가 그 위에서 자랄 수 있도록 합니다. 시스템이 준비되면 이미징을 위해 염색됩니다.

Organotypic Slice 공동 배양 모델에서 뇌종양 확립

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

유방암 뇌 전이의 마우스 모델은 MDA-MB231/Br-GFP 세포의 초음파 영상 유도 심장 내 주입으로 설정됩니다. 다 초점 두개 내 전이의 개발은 고해상도 9.4 T MRI를 사용하여 세로 방향으로 모니터링하고있다.

종 MRI에 이어 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 개발하기 위해 초음파 영상 유도 심장 내 주입

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

두개 내 뇌 전이 모델링은 정확하고 시기 좋은 방법으로 치료에 종양 크기와 반응을 모니터링할 수 없다는 것에 의해 복잡합니다. 제시된 방법론은 자기 공명 화상 진찰 분석과 두개 내 종양 주입을 결합할 때, 정확하고 일관된 주사, 향상된 동물 감시 및 정확한 종양 부피 측정을 육성합니다.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

뇌 전이는 암 환자의 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 대부분의 뇌 전이 마우스 모델은 사망률 및 치료 개입 결과의 혼란 분석을 혼란시키는 전신 전이에 의해 복잡합니다. 여기에 제시된 것은 최소한의 전신 종양으로 일관된 두개 내 종양을 생성하는 암세포의 내 경동맥 주사를위한 프로토콜입니다.

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입체정위 두개내 주입 기법은 종양 세포를 마우스 피질에 정밀하고 국소적으로 이식할 수 있게 하여 뇌의 전이 정착 연구에 강력한 모델이 됩니다.

뇌 전이 모델링: 입체정위 피질 내 주사를 통한 전이 정식 집락화 및 조직학적 성장 패턴 분석

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

배우세요 장기 온-어-칩 3D 모델과 공초점 단층 촬영 및 기계 학습을 활용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 암 세포와 혈뇌장벽 상호작용을 분석하고 뇌 전이 예측 진단 도구로 활용됩니다.

장기 온-A 칩 3D 모델, 기계 학습 및 공초점 단층 촬영을 사용하여 뇌 전이성 종양 미세 환경을 정량화

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