후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

이 비디오에 처음으로 표시된 프로토콜은 화학적 후성유전학적 소거와 생체역학적 단서의 사용을 결합하여 성체 말기 분화 세포에서 다능성을 유도하고 유지합니다. 이 프로토콜의 주요 강점은 형질전환 또는 바이러스 벡터가 필요하지 않다는 것입니다. 또한 견고하고 재현성이 높으며 유연합니다.

이 기술은 유전자 형질주입(transfection)을 사용할 필요가 없기 때문에 중개 의학 및 세포 치료에 대한 주목할 만한 기술적 진보를 나타내는 동시에 높은 가소성 세포의 장기 배양을 지원합니다. 이 절차를 시연하는 사람은 조교수인 Georgia Pennarossa와 제 연구실의 박사 과정 학생인 Teresina De Iorio입니다. 새로운 1-millimolar 5-aza-CR 원액을 준비하는 것으로 시작합니다.

2.44mg의 5-aza-CR 무게를 측정하고 포도당이 높은 DMEM 10ml에 용해시킵니다. 볼텍싱으로 분말을 다시 현탁시키고 0.22마이크로미터 필터로 용액을 살균합니다. 1마이크로리터의 원액을 1ml의 섬유아세포 배양 배지에 희석하여 5-aza-CR 작업 용액을 준비합니다.

텍스트 원고에 설명된 대로 세포를 트립신화하고 부드러운 피펫팅으로 세포를 제거합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하여 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 광학 현미경 아래에서 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.

세포 현탁액을 150배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 다음, 상등액을 제거하고 40의 000의 1 마이크로몰 5-aza-CR로 보충된 섬유아세포 배양 매체의 30 마이크로리터에 있는 000의 세포를 얻기 위하여 펠릿을 다시 현탁시키십시오. 35mm 페트리 접시에 PTFE 분말을 채워 베드를 만들고 30마이크로리터의 셀을 파우더 베드에 분배합니다.

PTFE 분말이 액체 방울의 표면을 완전히 덮어 액체 대리석 미생물 반응기를 형성하도록 페트리 접시를 원을 그리며 부드럽게 회전합니다. 대리석의 직경을 수용하기 위해 절단된 1000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 액체 대리석 미생물 반응기를 집습니다. 미생물 반응기를 깨끗한 세균학 페트리 접시에 접시에 올려 안정화합니다.

그런 다음 페트리 접시의 미생물 반응기를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 우물 가장자리에서 100마이크로리터의 미디어를 천천히 추가합니다. 미생물 반응기는 배지 위에 떠 있어야 합니다.

액체 대리석 미생물 반응기를 섭씨 37도에서 18시간 동안 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양합니다. 배양 후 1000마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 액체 대리석 마이크로바이오리액터를 수집하고 새로운 35mm 세균학 페트리 접시에 넣습니다. 바늘을 사용하여 액체 대리석에 구멍을 뚫고 부수십시오.

실체현미경으로 가장자리에서 절단된 200마이크로리터 피펫 팁으로 형성된 스페로이드를 회수합니다. 5-aza-CR 잔류물을 씻어내려면 오가노이드를 ESC 배지가 포함된 페트리 접시로 옮깁니다. PTFE 파우더 베드가 들어있는 새로운 35mm 페트리 접시를 준비하고 200마이크로리터 절단 피펫 팁을 사용하여 30마이크로리터의 ESC 배양 배지 방울에 단일 오가노이드를 분말에 분배합니다.

접시를 원을 그리며 부드럽게 회전시켜 새로운 액체 대리석 미생물 반응기를 형성하고 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 우물 가장자리에서 100 마이크로 리터의 매체를 추가하여 대리석을 천천히 목욕시킵니다. 액체 대리석 microbioreactors를 섭씨 37도에서 배양하고 5% 이산화탄소를 배양합니다.

형태학적 분석에 따르면 탈메틸화제인 5-aza-CR로 18시간 동안 배양한 후 PTFE 마이크로바이오리액터에 캡슐화된 3종의 포유류 종의 섬유아세포가 응집되어 균일한 크기의 기하학적 구조를 가진 3D 구형 구조를 형성했습니다. 3D 조건에서 캡슐화된 세포의 86.31%가 표현형을 현저하게 변형시켰습니다. 대조적으로, 2D 표준 조건에서 배양된 post-5-aza-CR 세포는 크기가 상당히 작았고 과립화된 핵이 있었고 단층 분포를 유지했습니다.

형태학적 변화는 3D 및 2D post-5-aza-CR 세포 모두에서 다능성 관련 유전자 발현의 시작을 동반했습니다. 처리되지 않은 섬유아세포에는 없는 POU class five homeobox one, NANOG homeobox, ZFP42 zinc finger protein 및 sex-determining region Ybox2에 대한 전사가 관찰되었습니다. 10-11 전좌 2 상피 세포 접착 분자 및 cadherin 1 유전자의 상당한 상향 조절도 2D 표준 플라스틱 접시에서 배양된 세포와 비교하여 3D post-5-aza-CR 세포에서 관찰되었습니다.

이와 동시에, 섬유아세포 특이적 마커 Thy1 세포 표면 항원의 하향 조절이 3D 및 2D post-5-aza-CR 세포 모두에서 검출되었습니다. ELISA로 3D 및 2D post-5-aza-CR 세포 모두에서 메틸화 수준의 현저한 감소가 확인되었습니다. DNA 메틸화 수준은 2D 조건에서 배양된 세포에 비해 3D post-5-aza-CR 세포에서 현저히 낮았습니다.

또한, 3D post-5-aza-CR 세포는 획득한 3D 구형 구조, 다능성 관련 유전자의 높은 발현 수준 및 낮은 DNA 메틸화 수준을 28일 동안 유지했으며, 이 시점에서 배양이 중단되었습니다. 또한 미생물반응기는 전구 세포 배양을 위한 최적의 조건을 유지하고 말단 분화 효율을 높이는 데 사용할 수 있습니다.