면역 반응 강화 기술을 이용한 초고속 웨스턴 블롯

웨스턴 블로팅(western blotting)은 이식된 멤브레인에서 항원을 검출하는 확립된 방법이며 생물 의학 연구에 일반적으로 사용되지만 전체 절차를 완료하는 데 몇 시간 또는 며칠이 걸립니다. 면역 강화 기술과 순환 배출 및 보충을 함께 사용하면 블록 멤브레인을 확보하면 감도를 희생하지 않고 20분 이내에 전체 절차를 완료할 수 있습니다. 웨스턴 블로팅은 다양한 연구 분야에서 공통적이기 때문에 연구 속도를 높일 수 있는 광범위한 적용 가능성이 있습니다.

이 프로토콜의 성공적인 사용은 면역 반응을 통한 항체 희석의 최적화, 시약 및 배양 시간 향상에 달려 있습니다. PVDF 멤브레인을 적절한 차단 완충액에 넣고 실온에서 교반하면서 1시간 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 멤브레인이 인큐베이팅되는 동안 증류수로 10% 면역반응 강화제 단일 용액 또는 IRE1을 준비하고 잘 와류로 만든 다음 1차 항체를 10% IRE1로 희석하여 부드럽고 철저히 혼합합니다.

핀셋으로 PVDF 멤브레인을 들어 올리고 차단 용액을 잠시 배출합니다. 1차 항체가 있는 원뿔형 튜브에 멤브레인을 삽입하여 전체 멤브레인이 튜브 벽에 부착되고 원래 겔과 접촉했던 멤브레인의 측면이 안쪽을 향하도록 합니다. 튜브를 단단히 닫으십시오.

하이브리드화 오븐용 유리병에 튜브를 삽입하고 오븐을 켭니다. 최소 5분 동안 6RPM 회전으로 멤브레인을 배양합니다. 회전을 중지하고 핀셋으로 튜브에서 PVDF 멤브레인을 조심스럽게 제거합니다.

멤브레인을 PBST 50ml가 담긴 용기에 넣고 헹군 다음 기포가 나타나지 않을 때까지 증류수가 담긴 용기에 헹구면 대부분의 항체가 제거됩니다. 멤브레인을 250ml의 PBST가 들어 있는 샐러드 스피너로 옮깁니다. 스트레이너 바스켓을 스피너에 놓고 뚜껑이 단단히 닫혔는지 확인한 다음 스피너를 활성화하고 20-30초 동안 실행합니다.

용액을 버리고 증류수로 스피너 내부를 잠시 헹굽니다. 스피너에 PBST 250ml를 추가하고 스핀을 반복한 다음 멤브레인에 2차 항체를 배양하고 텍스트 원고에 설명된 대로 다시 세척합니다. 평평한 표면에 반투명 플렉시블 필름 조각을 놓습니다.

5 밀리리터 튜브에 화학발광 기질의 두 성분을 혼합하고 1.5 밀리리터의 혼합 기질을 반투명 필름으로 즉시 옮깁니다. PVDF 멤브레인을 용액에 놓고 나머지 기질 용액을 멤브레인에 옮깁니다. PVDF 멤브레인을 혼합된 기질과 함께 1분 동안 배양합니다.

핀셋으로 PVDF 멤브레인을 들어 올리고 기질 용액을 잠시 배출합니다. 한 쌍의 투명 필름 사이에 멤브레인을 끼우고 화학발광 모드에서 이미지화합니다. 웨스턴 블롯의 화학발광 검출에 필요한 항원과 항체의 양이 각각 여기에 나와 있습니다.

정적 인큐베이션과 CDR 인큐베이션 모두에서 IRE 용액을 사용하면 감도가 증가했습니다. 유사하게, anti-6s His 태그 항체의 최소 농도는 정적 조건에서 밀리리터당 100에서 50나노그램으로, CDR 조건에서 밀리리터당 100에서 12.5나노그램으로 낮아졌습니다. 5분 또는 10분 동안의 CDR 배양은 정적 배양에 비해 검출 한계를 크게 낮췄습니다.

또한, CDR과 IRE의 조합은 극히 짧은 잠복기 내에서도 웨스턴 블롯에 대한 우수한 감도를 보여주었습니다. 형광 검출 기능이 있는 웨스턴 블롯(Western blot)에 이 방법을 성공적으로 적용한 사례가 여기에 나와 있습니다. 화학발광 검출과 대조되는 형광 검출은 항체를 벗겨내거나 회수하지 않고 동일한 블롯에서 동시에 여러 표적을 검출할 수 있는 고유한 기능을 가지고 있습니다.

세포 용해물에서 His-tagged alkaline phosphatase 및 beta-actin을 2색 형광단을 사용하여 동시에 검출했습니다. IRE를 사용한 CDR 배양은 검출을 가속화했을 뿐만 아니라 감도도 높였습니다. 배양 중에 멤브레인은 튜브 벽에 부착된 상태를 유지해야 합니다.

튜브는 용액이 멤브레인 표면 위로 계속 씻겨 지도록 수평으로 회전해야 합니다. 이 프로토콜은 서양의 블로팅 절차에 크게 의존하는 연구 생산성을 크게 향상시켰습니다.