Name: 자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 미세현미경을 이용한 생체 내 칼슘 화상 진찰 방법을. GCaMP 발현 세포를 실시간으로 관찰하여 신경 활동 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
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<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
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숙련된 수술 기술은 우리가 여기에서 설명한 편도체와 같은 더 깊은 두뇌 지구에 있는 헤드 마운트 소형 현미경 검사법을 가진 생체 내 광학 칼슘 화상 진찰에서 성공을 달성하기 위해 필수적입니다. 따라서 이 프로토콜은 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 최적화된 수술 과정에 대한 지침을 제공하지만 중요한 단계에 추가 최적화 프로세스가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 섹션에서 언급했듯이 수술의 편도체 좌표, 기류 부착 단계의 기류 속도, 칼슘 레코딩 및 변수(ICA 측두중량, 이벤트 가장 작은 감쇠 시간등)에서이미지 수집 설정(프레임 속도, LED 전원등)을데이터 처리에 최적화할 필요가 있다.
베이스 플레이트 부착 단계를 수정할 수 있습니다. 헤드 플레이트는 모바일 홈 케이지에서 실시베이스 플레이트 부착 중에 깨어있는 마우스의 머리를 고정하는 데 도움이되기 때문에 필요합니다. 그러나, 이동식 홈 케이지가 실험실에서 준비되지 않은 경우, 이소플루란...

칼슘은 거의 모든 세포 기능8에서중요한 역할을하는 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 뉴런에서, 작용 잠재력 발사 및 시냅스 입력은 세포내 무료 [Ca2+]9,10의급격한 변화를 일으킨다. 따라서 칼슘 과도를 추적하면 신경 활동을 모니터링 할 수있는 기회를 제공합니다. GECI는 정의된 세포 인구 및 셀룰러 내구획(11,12)에서[Ca2+]모니터링을 허용하는 강력한 도구입니다. 단백질 기반 칼슘 표시기의 많은 다른 모형 중, GCaMP, 단일 GFP 분자13에근거를 둔 Ca2+ 프로브는, 가장 최적화되고 이렇게 널리 사용되는 GECI입니다. 여러 차례의 엔지니어링을 통해 GCaMP의 여러 변형이12,14,15,16을개발했습니다. 우리는 이 프로토콜16에서최근에 개발된 GCaMPPs, GCaMP7b 중 하나를 사용합니다. GCaMP센서는 개발 17 동안 Ca2+ 과도의 이미징, 특정 피질층(18)에서의생체 이미징, 모터 작업 학습19의 회로 역학 측정 및 해마및 대미20의 연관 공포 기억과 관련된 세포 앙상블 활동의이미징과 같은 다수의 모델 유기체에서 신경 회로 기능의 연구에 크게기여했다.
GECIs의 광학 이미징은 몇 가지 장점이있습니다 22. 유전 인코딩을 통해 GECI는 유전자 프로파일 또는 해부학 적 연결의 특정 패턴에 의해 정의되는 세포의 특정 하위 집합에서 장기간 안정적으로 표현 될 수 있습니다. 광학 이미징은 살아있는 동물에서 수백에서 수천 개의 뉴런을 생체 내에서 만성 동시 모니터링할 수 있게 합니다. 몇몇 광학 이미징 시스템은 헤드 마운트 소형형 광소 현미경21,23,24,25로마우스를 자유롭게 행동하는 뇌 내에서 GECIs의 생체 이미징 및 분석을 위해 개발되었다. GECIs, GRIN 렌즈 및 헤드 마운트 소형 현미경을 기반으로 한 생체 내 광학 이미징 기술이 신경 회로 활동과 행동 사이의 연관성을 연구하는 강력한 도구임에도 불구하고, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 GRIN 렌즈를 미막도라에서 GEC를 표현하는 세포에 표적화하는 것과 관련된 몇 가지 기술적 문제로 인해 어려웠으며, 이는 GEC의 이미지를 심각하게 저하시키는 동작 아티팩트를 유발하고 이미지를 저하시키는 데 방해가 되고 있다. 이 프로토콜은 편도체에서 생체 내 광학 칼슘 이미징에서 성공적인 단계를 위한 중요한 단계인 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 외과 적 절차에 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 편도체를 대상으로하지만, 여기에 설명 된 대부분의 절차는 일반적으로 다른 깊은 뇌 영역에 적용됩니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 다른 대체 시스템에서동일한 목적을 쉽게 달성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>26G 바늘</td><td>BD</td><td>302002</td><td>수술</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>수술</td></tr><tr><td>AAV2 / 1-CaMKii&alpha; -GFP</td><td>맞춤형</td><td></td><td>수술</td></tr><tr><td>아크릴 - 치과 시멘트 (오르토 제트 아크릴 핑크)</td> <td>Lang</td><td>1334- 핑크</td><td>수술 & 베이스 플레이트 어태치먼트</td></tr><tr><td>공기 흐름 매니퓰레이터</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>베이스 플레이트 어태치먼트</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>수술</td></tr><tr><td>베이스 플레이트</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>베이스 플레이트 어태치먼트</td></tr><tr><td>베이스 플레이트 커버</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>베이스 플레이트 어태치먼트</td></tr><tr><td>행동 장치(챔버)</td><td>Coulbourn 기기</td><td>Testcage</td><td>거동 테스트</td></tr><tr><td>행동 장치 (소프트웨어)</td><td>Coulbourn 기기</td><td>Freeze Frame</td><td>거동 테스트</td></tr><tr><td>카본 케이지</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>베이스 플레이트 부착</td></tr>물 <tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td></td></tr><tr><td>수술 데이터 처리 소프트웨어</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX 데이터 처리 소프트웨어</td><td>베이스 플레이트 첨부 파일 & 행동 테스트</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>수술</td></tr><tr><td>드릴</td><td>세양</td><td>마라톤-4</td><td>수술</td></tr><tr><td>드릴 버</td><td>ELA</td><td>US1/2, 생크104</td><td></td></tr><tr><td>수술 유리 바늘</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>수술</td></tr><tr><td>그린 렌즈(INSCOPIX Proview 렌즈 프로브)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>수술</td></tr><tr><td>해밀턴 주사기</td><td>해밀턴</td><td>84875</td><td>수술</td></tr><tr><td>헤드 플레이트</td><td>Neurotar</td><td>모델 5</td><td>수술</td></tr><tr><td>육각 키</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>베이스 플레이트 부착</td></tr><tr><td>노트북 컴퓨터</td><td>삼성</td><td>NT950XBV</td><td>수술 및 베이스 플레이트 어태치먼트</td></tr><tr><td>렌즈 홀더, 입체 막대 (INSCOPIX proview 임플란트 키트)</td> <td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>수술</td></tr><tr><td>현미경 그리퍼</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td>베이스 <td>플레이트 어태치먼트</td></tr><tr><td>현미경, DAQ 소프트웨어, 하드웨어</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>베이스 플레이트 어태치먼트 & 행동 테스트</td></tr><tr><td>모바일 홈 케이지</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>베이스 플레이트 부착물</td></tr><tr><td>동력 화 된 팔</td><td>Neurostar</td><td>맞춤형</td><td>수술</td></tr><tr><td>Moterized 팔 소프트웨어</td><td>Neurostar</td><td>맞춤형</td><td>수술</td></tr><tr><td>NI 보드</td><td>National instrument</td><td></td><td>행동 테스트</td></tr><tr><td>탈착식 에폭시 본드</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>수술</td></tr><tr><td>수지 시멘트 (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C& B</td><td>수술</td></tr><tr><td>두개골 나사</td><td>스톨팅</td><td>51457</td><td>수술</td></tr><tr><td>입체 전극 홀더</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>수술</td></tr><tr><td>입체 운동 프레임</td><td>스톨 팅</td><td>51600</td><td>수술</td></tr><tr><td>입체 매니퓰레이터</td><td>스톨 팅</td><td>51600</td>베이스 <td>플레이트 부착</td></tr></tbody></table>

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

자유롭게 움직이는 동물에서 신경 활동의 생체 내 실시간 모니터링은 행동에 신경 활동을 연결하는 주요 접근 법 중 하나입니다. 이를 위해, 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs), 소형형 형광 현미경, 그라데이션 굴절지수(GRIN) 렌즈를 사용하여 뉴런의 칼슘 과도를 검출하는 생체 내 이미징 기술이 개발되어 많은 뇌 구조1,2,3,4,5,6에성공적으로 적용되었다. 이 화상 진찰 기술은 최대 몇 주까지 장기 기간 동안 유전으로 정의된 세포 집단의 만성 동시 화상 진찰을 가능하게 하기 때문에 특히 강력합니다. 유용하지만, 이 화상 진찰 기술은 편도체, 정서적 처리 및 연관 공포 기억 기억7을위한 필수적인 두뇌 구조물과 같은 두뇌 내깊은 찾아내는 두뇌 구조물에 쉽게 적용되지 않았습니다. 편도체에 이미징 기술을 적용하는 것을 어렵게 만드는 몇몇 요인이 있습니다. 예를 들면, 운동 유물은 일반적으로 두뇌에 있는 깊은 이식된 헤드 마운트 현미경이 상대적으로 불안정하기 때문에 더 깊은 두뇌 지구에서 실시하는 화상 진찰 도중 더 빈번해 깁니다. 또 다른 문제는 측면 심실이 이식된 GRIN 렌즈에 가깝게 위치하고 호흡 도중의 움직임이 쉽게 교정할 수 없는 고불규칙한 동작 아티팩트를 유발할 수 있어 안정적인 이미징 뷰를 형성하기가 어렵다는 것입니다. 더욱이, 편도체내의 세포는 일반적으로 휴식 또는 마취 상태에서 조용하기 때문에, 나중에 이미징을 위한 기질도금 절차 도중 편도체에서 GECI를 발현하는 표적 세포를 찾아 서 집중하기 어렵다. 이 프로토콜은 이러한 깊은 뇌 영역에서 생체 내 칼슘 이미징을 성공적으로 위해 헤드 마운트 소형 현미경으로 편도체에서 GECI를 발현하는 세포를 효율적으로 표적으로 하는 방법에 대한 유용한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 제한되지는 않습니다.

GRIN 렌즈 이식 의 검증 만성적으로 시멘트를 통해 뇌에 베이스 플레이트를 부착하기 전에 GRIN 렌즈 이식을 검증해야 합니다. 렌즈 이식이 성공한 동물의 경우, GCaMP 발현 세포와 혈관 모두 현미경의 객관적인 렌즈와 이식된 GRIN렌즈(그림 2A 및 B)사이의거리에 의해 결정된 초점 평면 범위 내에서 명확하게 관찰되었다. 대조적으로, 오프 타겟 이식을 가진 동물에서는, GCaMP 발현 세포의 명확한 심상이 초점 평면 범위 내에서 관찰되지 않았습니다 (초점이 외하거나 보이지 않는). 초점이 맞지 않는 경우, 잘 초점을 맞춘 혈관을 관찰할 수 있지만 초점 평면 범위 내의 세포에 대해서만 흐릿한이미지(그림 2C및 D). 보이지 않는 경우, 혈관은 대부분의 경우 관찰되지 않았으며 초점 평면 범위...

생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

편도체의 생체 내 칼슘 이미징을 위해 소형 현미경을 사용할 때 많은 문제가 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 성공적인 in vivo 칼슘 이미징을 달성하기 위한 시간 절약 지침을 제공합니다. In vivo 칼슘 이미징을 통해 이전에는 불가능했던 프로세스인 최대 몇 주에 걸쳐 유전적으로 정의된 세포 집단을 연속적으로 동시에 이미징할 수 있습니다.AAV 주사의 경우, 마취된 마우스를 입체택시 프레임에 고정한 상태에서 브레그마와 람다의 높이를 핀에 정렬하고 개두술을 위해 노출 및 소독된 두개골의 특정 위치를 식별합니다. 0.6mm 비트가 장착된 드릴을 사용하여 분당 18, 000회 회전 드릴 속도로 1.6mm 개두술을 조심스럽게 만들고 멸균 PBS로 두개골을 세척합니다. 브레그마를 기준으로 수정체 이식의 배복부 좌표인 4.2mm에서 배복부와 노출된 뇌 표면 사이의 배복부 차이를 빼서 값 A 거리를 계산하고, 3마이크로리터의 미네랄 오일과 0.7마이크로리터의 10 곱하기 10 이상의 AAV 용액 13번째 바이러스 게놈을 유리 피펫에 로드합니다.입체식 프로브 홀더에서 핀을 제거하여 피펫을 프레임에 고정하고 준비된 주입 부위 위에 피펫을 배치합니다. 출혈이 완전히 멈추면 유리 피펫 팁을 배복부 브레그마 좌표에서 뇌 조직에 4.3mm 삽입하고 주입 펌프를 사용하여 전체 부피의 바이러스를 전달한 후 피펫을 천천히 제거합니다. 모든 바이러스가 주입되면 두개골을 두 번 더 뚫어 두 개의 두개골 나사를 이식하고 PBS로 두개골 조각을 세척합니다.다음으로, 70% 에탄올 멸균 나사를 가능한 한 깊숙이 이식하고 입위 프레임에 전동 수술 암을 설치합니다. 필요한 하드웨어를 제어 소프트웨어가 설치된 랩톱 컴퓨터에 연결하고 캐뉼라 홀더를 사용하여 26게이지 바늘을 정위 프레임에 안정적으로 고정합니다. 바늘 삽입 부위의 좌표를 계산한 후 입체 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝을 노출된 뇌 표면에 놓고 PBS 2-3방울로 뇌 조직에 수분을 공급합니다.적절한 배복부 및 측면 편도체 좌표를 소프트웨어에 입력하고 GoTo를 클릭하여 바늘을 내립니다. 바늘이 완전히 멈추면 시작 위치 상자에 45mm를 입력하고 GoTo를 클릭하여 바늘을 들어 올립니다. 바늘이 움직임을 멈추면 뇌 표면에서 PBS를 제거하고 입체 프레임에서 바늘과 캐뉼러 홀더를 제거합니다.렌즈 홀더를 입체 로드에 부착하고 GRIN 렌즈를 렌즈 홀더에 고정합니다. 렌즈를 70% 에탄올로 살균하고 입체 막대를 입체 프레임에 부착합니다. GRIN 렌즈의 끝을 뇌 표면의 지정된 부위에 놓고 뇌 표면의 배복부 좌표에서 A의 절대값을 빼서 렌즈 이식을 위한 배복부 좌표를 결정합니다.PBS를 2-3방울 더 떨어뜨려 뇌 조직에 수분을 공급하고 전동 팔을 사용하여 하강 깊이를 1, 000 마이크로미터로, 올리는 높이를 300 마이크로미터로 설정합니다. GRIN 렌즈가 대상 부위에 도달하면 PBS를 제거하고 GRIN 렌즈, 나사 및 나사 측벽 주위에 수지 치과 시멘트를 조심스럽게 도포합니다. 치과 시멘트가 굳으면 렌즈에서 렌즈 홀더를 제거하고 두개골 표면에 아크릴 시멘트를 바릅니다.다음으로, 렌즈 홀더를 수평 방향으로 로드 끝에 테이프로 붙인 헤드 플레이트로 교체합니다. 렌즈가 헤드 플레이트의 내부 링의 오른쪽 가장자리에 위치할 때까지 헤드 플레이트를 1, 000마이크로미터 낮추기 전에 헤드 플레이트가 렌즈 커프 상단에 위치할 때까지 로드를 천천히 내립니다. 아크릴 시멘트를 사용하여 헤드 플레이트를 시멘트 층에 부착하고 파라핀 필름을 사용하여 이식된 GRIN 렌즈 표면을 먼지로부터 보호한 다음 파라핀 필름에 제거 가능한 에폭시 본드를 적용하여 필름을 렌즈 표면에 고정하고 동물을 완전히 누울 때까지 모니터링하면서 우리로 되돌립니다.GRIN 렌즈 이식의 품질을 평가하려면 이동식 홈 케이지 시스템의 헤드 바에 있는 마취된 마우스 아래에 탄소 케이지를 놓고 케이지가 마찰 없이 자유롭게 움직이도록 공기 흐름을 켭니다. 이식된 GRIN 렌즈의 표면이 소프트웨어 내의 이미지 시야에 나타날 때까지 현미경을 내리기 전에 현미경 그리퍼와 입체 매니퓰레이터를 사용하여 소형 현미경을 프레임에 수직으로 정렬합니다. 이식된 GRIN 렌즈의 중심을 시야의 중심과 정렬하고 이식된 GRIN 렌즈 표면의 이미지를 캡처한 다음 GCaMP 발현 세포의 모양을 관찰하면서 현미경의 대물 렌즈를 천천히 올립니다.수정체 이식에 성공한 동물에서는 GCaMP 발현 세포와 혈관을 모두 단일 초점면 범위 내에서 명확하게 관찰할 수 있습니다. 대조적으로, off-target 이식이 있는 동물에서는 혈관을 관찰하는 데 약간의 어려움이 있지만 초점면 범위 내에서 세포를 발현하는 GCaMP의 선명한 이미지는 관찰되지 않습니다. 보이지 않는 렌즈의 경우 혈관이나 GCaMP 발현 세포를 시각화할 수 없으며 이식된 GRIN 렌즈에서 밝은 가장자리를 관찰할 수 있습니다.GRIN 수정체 이식에 성공한 동물의 경우, 약 50-150개의 자발적 활성으로 보이는 세포가 일반적으로 색조가 없어도 측면 편도체의 시야 내에서 상당한 형광 변화를 보입니다. 톤이 표시될 때 델타 F 이미지 분석에 의해 결정된 GCaMP 신호의 톤별 변화를 표시하는 셀은 소수에 불과합니다. GFP 발현 AAV를 대조군으로 주입한 마우스에 대해 동일한 분석을 수행할 때 GFP 발현 세포가 초점면 범위 내에서 검출되고 색조 유무에 관계없이 상당한 형광 변화를 나타내는 세포가 없습니다.GCaMP 발현 및 GRIN 렌즈 표적화에 대한 조직학적 검증에서 GRIN 렌즈 주변의 뇌 조직 염증으로 인한 조직 손상의 징후가 나타나지 않았습니다. 바늘이나 렌즈의 속도가 일정하지 않으면 모션 아티팩트가 발생하고 이미지 품질이 저하될 수 있습니다. 전동 수술 팔을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다.바닥판 부착 단계 중에 이동식 홈 케어 시스템이 준비되지 않은 경우, 저농도의 이소플루란 가스를 사용하여 바닥판 부착 중에 마우스를 마취시킬 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

출처: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Vihaving Mouse(자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 헤드 마운트 소형 현미경을 사용한 성공적인 생체 내 칼슘 이미징). J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 구배 굴절률 또는 GRIN 렌즈와 소형 현미경을 사용하여 마우스의 생체 내 칼슘 이미징을 보여줍니다. 이 설정은 마찰이 없는 이동식 케이지 시스템 내에서 머리를 고정하여 뉴런을 자극하고 칼슘 이온 유입을 유발합니다. GRIN 렌즈는 뇌의 칼슘 신호를 포착하여 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 실시간 미세내시경 칼슘 이미징

출처: Thapa, R., et. al., 심부 뇌를 위한 입체성 바이러스 주입 및 그라디언트 인덱스 렌즈 이식 생체 내 칼슘 이미징.  J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 형질주입된 쥐의 미니스코프를 사용하여 뉴런 활동과 행동을 연관시키는 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다.

Miniscope를 사용한 쥐 내측 전전두엽 피질의 실시간 칼슘 이미징

여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 마우스에서 신경 역학과 미세 회로를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 미니 스코프를 사용하여 좋은 생체 내 칼슘 이미징을 달성하기 위해 뇌 수술을 수행하는 것을 설명합니다.

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

이 프로토콜은 냄새 기둥을 탐색하는 쥐의 해마 CA1에서 뇌-행동 관계를 조사합니다. 해마 영상에 접근하기 위한 수술, 행동 훈련, 뇌의 미니스코프 GCaMP6f 기록 및 처리, ROI 신경 활동에서 마우스 위치를 디코딩하기 위한 행동 데이터를 포함한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

냄새 기둥을 탐색하는 생쥐의 해마에서 칼슘 신호를 기록하는 미니스코프

이 프로토콜은 사회적 상태 조작(사회적 고립 및 사회적 재결합) 중 마우스의 소형화된 현미경(미니스코프)을 이용한 시상하부 신경세포의 생체 내 칼슘 이미징을 상세히 다룹니다. 이 방법은 사회적 욕구와 사회적 포만을 나타내는 시상하부 활동을 단일 뉴런 해상도로 영상화할 수 있게 하여 사회적 항상성의 기전적 연구를 가능하게 합니다.

생체 내 쥐의 사회적 행동 이해를 위한 시상하부 내 소형 현미경으로 칼슘 영상 촬영

학습하세요 자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 미세현미경을 이용한 생체 내 칼슘 화상 진찰 방법을. GCaMP 발현 세포를 실시간으로 관찰하여 신경 활동 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

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