생체 내 신경 회로 연결성 모방을 위한 체외 쐐기 슬라이스 준비

뇌 슬라이스 실험은 높은 전기 및 측두해상도와 신경 기능의 심문을 허용하지만,이 조각은 일반적으로 많은 사전 시냅스 연결을 끊습니다. 쐐기 모양의 슬라이스는 보다 그대로 사전 회로를 유지합니다. 이 수정된 두뇌 슬라이스는 시각적으로 유도된 패치 클램프 기록, 약리학 및 활동 화상 진찰과 같은 체외 실험의 이점을 제공하면서 생체 내와 같은 신경 회로에서 더 완전한 유지합니다.

정확한 쐐기 슬라이스 형상은 회로 내의 뉴런의 아틀라스 위치를 기반으로 추정될 수 있지만, 사전 시냅스 스키마타와 축삭의 무결성은 조직학을 사용하여 결정되어야 한다. 먼저 면도날을 사용하여 두개골 의 중간선에서 목 뒤쪽으로 피부를 자른다. 두개골을 드러내고 두개골의 기지에서 시작하여 코를 향해 계속 하기 위해 피부를 다시 껍질을 벗기고 작은 가위를 사용하여 중간선을 통해 두개골에 절개를합니다.

람다 봉합사에서, 뇌를 드러내기 위해 두개골을 벗겨내고 양쪽의 귀를 향해 중간선에서 두개골을 잘라냅니다. 로스트랄 끝에서 시작하여 작은 실험실 주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 부드럽게 들어 올려 시신경을 절단할 수 있습니다. 뇌를 뒤로 부드럽게 작동시키고, 복부 표면을 노출시키고 미세 한 집게를 사용하여 뇌줄기의 복부 표면 근처의 삼차 신경을 조심스럽게 꼬집어 잘라냅니다.

차가운 슬라이스 용액으로 가득 찬 유리 페트리 접시에 준비를 놓고 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 브레디불로초클레아 신경을 노출하기 위해 뇌간 가까이에 있는 안면 신경을 다듬습니다. 좋은 집게를 사용하여 현관 신경이 가능한 한 두개골을 빠져 나가는 포라미나로 팁을 밀어 넣습니다.

양쪽의 신경을 끊고 뇌간에 부착된 신경 뿌리를 남깁니다. 사다리꼴 몸 근처 뇌간의 복부 표면에서 수막과 혈관을 제거합니다. 그런 다음 남아있는 두개골 신경과 결합 조직을 꼬집어 두개골에서 뇌를 완전히 풀어 주며 가능한 경우 남아있는 척수를 보존하십시오.

무대에 고정에 대한 뇌의 표면을 준비하려면 뇌 복부 측면을 위로 배치하고 부드럽게 뇌 조직을 안정화척수를 고정하는 무딘 도구를 사용합니다. 팁이 광학 치아에 뇌 의 등쪽 표면을 종료하고 집게를 따라 절단 면도날을 사용하는 있도록 접시의 바닥에 뇌를 통해 약 20도 각도에 열린 집게를 삽입합니다. 다음으로, 4%의 한입방 센티미터 블록을 준비하고 작은 한 방울의 접착제를 무대의 사각형으로 퍼뜨립니다.

집게를 사용하여 조심스럽게 뇌를 들어 올리고 종이 타월 가장자리로 여분의 액체를 부드럽게 두드려보십시오. 그런 다음 차단된 표면을 접착제에 배치하여 복부 표면이 슬라이스 하는 동안 블레이드의 방향을 향하고 서 열 반 에 부드럽게 대 한 천 블록을 밀어 지원으로. 두꺼운 측면에 달팽이 신경 뿌리와 쐐기 조각을 취득하고, 얇은 쪽에 사다리꼴 몸의 내측 올리고 신경 및 내측 핵을 획득하려면, 날개 를 향한 뇌의 진부한 표면으로 진동챔버에 부착 된 뇌가있는 자기 디스크를 배치합니다.

얼음 차가운 슬라이스 용액으로 챔버를 채우고 칼날을 카보겐 버블 솔루션으로 낮춥니다. 슬라이스가 대칭인지 확인하기 위해 관심 영역으로 슬라이스 를 잘라냅니다. 그런 다음 스테이지를 약 15도 에서 한쪽으로 이동합니다.

청각 신경 뿌리가 한쪽면의 표면에 가까우고 안면 신경이 슬라이스의 반대편 표면에서 볼 수 있을 때까지 조심스럽게 슬라이스를 계속합니다. 스테이지를 15도 뒤로 이동하여 블레이드를 조직에서 멀리 이동합니다. 얇은 면의 측면 가장자리가 블레이드를 향하도록 스테이지 베이스 90도회전하여 블레이드를 수백 미크론을 내리고 천천히 블레이드를 조직의 가장자리에 가깝게 가져온다.

블레이드가 약간 하중하여 슬라이스의 얇은 가장자리의 원하는 두께로 후퇴합니다. 블레이드를 조직에서 다시 이동하고 원반 표면이 스테이지 베이스를 향할 수 있도록 스테이지 베이스를 다시 회전시합니다. 쐐기 슬라이스의 장밋빛 표면을 지정하고 슬라이스를 인터페이스 용지 카들 표면의 1 평방 센티미터 조각으로 옮기도록 잘라냅니다.

얼굴 신경은 장밋빛 표면에 있는 슬라이스의 두 반구에서 볼 수 있어야 합니다. 그런 다음 슬라이스를 섭씨 35도 인큐베이션 챔버로 이동하여 30분 동안 복구합니다. 전기 생리분석을 위한 쐐기 슬라이스를 설정하려면 샘플을 연속섭씨 35도ACSF로 지속적으로 침투하는 기록챔버로 배치하고 슬라이스를 안정화한다.

DIC 광학을 사용하여, 슬라이스의 두꺼운 측면에 청각 신경 뿌리에 초점을 맞추고 양극성 텅스텐 자극 전극을 청각 신경 뿌리로 이동하고 조직의 표면에 부드럽게 이동미세 조작기를 사용합니다. 시야를 얇은 측의 사다리꼴 몸체의 복부 핵으로 이동하고 561 나노미터 방출 필터를 사용하여 피광학 하에서 패치 클램프 전기 생리학의 대상으로 내측 올리고폴리아 뉴런을 선택한다. 제안된 실험에 적합한 내부 솔루션으로 레코딩 파이펫을 채우고 DIC 광학 패치 하에서 전체 셀 구성에서 내측 올리고성 폴리보코클레아 뉴런으로부터 기록한다.

청각 신경 근의 전기 자극 진폭을 조정하여 내측 올리고성 신경에서 일관된 포스트냅틱 이벤트를 얻습니다. 그런 다음 내측 올리고성 신경에서 불러일으킨 시냅스 전류를 관찰하기 위해 적절한 자극 프로토콜을 실행합니다. 이 쐐기 슬라이스 제제는 청각 신경 근과 달팽이관 핵을 기록 대상으로 한 내측 올리고성 골수 신경에 대한 모순을 포함하도록 설계되었습니다.

이 크레실 바이올렛 염색 된 절제 웨지 슬라이스에서 달팽이관 핵은 거의 전체 로스트랄 - 코달 정도에 존재한다. 그리고 청각 신경 뿌리는 달팽이관 핵을 입력 하는 관찰. 또한, 웨지 슬라이스는 레코딩이 수행되는 내측 올리고올리고 뉴런에 사다리꼴 본체의 내측 핵의 뉴런을 함유하고 있다.

웨지 슬라이스 사전 시냅스 입력 내의 뉴런 연결을 확인하기 위해 두 가지 방법으로 자극된다. 첫째, 미드라인의 복부 음향 스트리아는 전기적으로 자극되고, T-stellate 축삭을 직접 활성화하고, 구형 부시 세포 축삭 자극을 통해 사다리꼴 체뉴런의 내측 핵을 활성화시키고, 중간 올리보콜레아 뉴런에서 측정되는 포스트냅스 전류의 결과로. 청각 신경 뿌리는 그 때 전체 모루 오름차순 뇌간 회로를 활성화하고 포스트 냅틱 반응을 연상하도록 자극된다.

청각 신경 자극으로 불러일으킨 것과 복부 음향 성수기의 직접적인 자극으로 불러일으킨 첫 번째 포스트냅틱 전류의 개시 대기 시간 측정을 비교하면 청각 신경 자극 이벤트에서 훨씬 더 긴 대기 시간을 나타내며, 이는 청각 신경 자극 시자극 시냅스 자극 중에 활성화된 추가 인공와우 핵으로 인한 시냅스 지연을 나타낸다. 해부학 적 랜드 마크의 사용과 자기 디스크 단계의 신중한 기동은 그대로 뉴런 회로와 신뢰할 수있는 사후 시냅스 응답을 생성하기위한 중요합니다. 이 슬라이싱 기술은 칼슘 또는 전압 이미징, 광유전학, 신경 전달 물질 미수, 세포 내 및 세포 외 약리학을 포함한 추가 체외 전기 생리학 도구를 사용하기위한 플랫폼을 제공합니다.