Name: Agrobacterium-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 학습하세요 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 이용한 벼 남성 불임 계통 생성 방법을 Agrobacterium 매개 변환으로 수행하는 과정을. 이 기술은 Oryza sativa에서 OsABCG15 유전자 녹아웃을 통해 안정적인 남성 불임 계통을 생산하여 작물 개량과 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

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저자는 샤오페이 첸이 쌀 조직 배양 배지를 만드는 데 있어 젊은 쌀 꽃가루와 도움을 제공한 것에 대해 인정하고 자합니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31900611)에 의해 지원되었다.

1. sgRNA-CAS9 플랜트 발현 벡터 시공 및 아그로박테리움-중재된변환
<ol><li>발표된문헌(28)에따라 쌀에 남성 멸균 유전자 OsABCG15를 표적으로 한다.</li>
	<li>OsABCG15의 두 번째 엑소에서 106-125 bp 사이에 위치한 표적 부위에 대한 sgRNA설계(그림 1).</li>
	<li>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제는 sgRNA 올리고(sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGAT3' 및 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGATGTGCTT')를 합성합니다.</li>
	<li>endonuclease BbsI를 사용하여 psgR-Cas9 백본벡터(29)를소화한다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 T4 리구아제를 사용하여 선형화된 psgR-Cas9 백본으로 합성된 sgRNA 올리고를 리게이트합니다.</li>
	<li>힌드III/에코리를 사용하여, sgRNA 카세트를 1단계에서 1.5단계로부터 소화하고 pCAMBIA1300 바이너리 벡터의 힌드III/에코리 부위로 서브클론을 소화하여 안정적인변환(29)을한다.</li>
	<li>효소 소화 및 염열에 의해 생성된 플라스미드를 확인합니다. 나중에, 이진 구조를 Agrobacterium tumefaciens 균주 EHA105로 변환하고 2-3 일 동안 28 °C에서 칸 / 리프 선택 플레이트에 성장한다.</li>
</ol>2. 쌀 유전 적 변형 및 식물 조직 배양
<ol><li>캘러스 유도 및 재생 참고: 신선한 젊은 쌀 꽃집을 시동재료로 사용하여 캘러스(그림2)를유도합니다.<ol>
<li>1.6-4.8 mm(그림 2A)29의꽃 길이에 의해 결정 된 meiosis 단계에서 논 또는 녹색 집에서 젊은 꽃집을 수집합니다. 쌀 꽃피는 잎 칼집으로 덮여 있는지 확인합니다. 70% 알코올 면봉으로 각 꽃집을 닦고 절단하기 전에 건조하게 하십시오.</li>
		<li>깨끗한 멸균 벤치에 꽃을 가져옵니다. 살균 된 가위로 작은 조각 (더 작은 것)으로 자른 다음 절단을 NBD2 배지(그림 2B, 표 1)가함유 된 페트리 플레이트로 옮겨넣습니다.</li>
		<li>약 10-14일 동안 26°C에서 어둠 속에서 플레이트를 배양하여 캘러스(도3A)를유도한다. 참고: 새로 형성된 콜러스를 Agrobacterium 침투(단계 2.2.7)에 직접 사용하거나 신선한 NBD2 배지에서 한 번 더 재조정하여 더 많은 callus를 얻습니다. 8-10일마다 캘러스를 새로운 NBD2 매체로 전송합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>변환 및 공동 재배<ol>
<li>변형을 위해 1.6 단계에서 이진 플라스미드를 함유한 A. tumefaciens 박테리아를 사용한다. A. tumefaciens 균주를 YEB배지(표 1)에저장하여 -80°C에서 글리세롤을 50% 저장합니다.</li>
		<li>-80°C 글리세롤 스톡에서 선택적항생제(표 1)를함유한 YEB 천 배지로 줄무늬 A. 투메파시엔스는 48-72h에 대해 25-28°C로 성장하여 식민지가 나타날 수 있도록 한다.</li>
		<li>50mL 원추형 멸균 시험관에서 동일한 선택적항생제(표 1)를함유하는 액체 YEB 배지의 5mL에 선택적 항생제를 가진 YEB 플레이트로부터 단일 콜로니를 접종한다. 박테리아가 0.5의 OD 600으로 성장할 때까지 250 x g에서600 궤도 셰이커를 흔들어 25-28 °C에서 흔들어주세요.</li>
		<li>250mL 원추형 플라스크에서 동일한 선택적 항생제를 가진 YEB배지(표 1)의100mL에 세균현탁액 1mL을 넣고 250 x g에서궤도 셰이커를 흔들어 4h에 28°C로 흔들어 줍니다.</li>
		<li>심열기4,000 x g에서 10 분 동안 실온에서 박테리아를 수집합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>AAM-AS배지(표 1)로세균펠릿을 재연하고 현탁액을 OD600 = 0.4로 희석한다. 참고: 세균 현탁액의 완벽한 OD는 효율적인 변환에 매우 중요합니다. 그것은 callus에 과잉 세균성 성장을 제거에 도움이.</li>
		<li>약 150mL 멸균 플라스크로 단계 2.1.3에서 약 150 건강한 성장하는 밝은 노란색 연약한 배아 성 칼리를 수집합니다. 50-75mL 세균세포 현탁액을 멸균 플라스크에 2.6단계부터 추가한 다음, 10-25mL의 신선한 AAM-AS 배지를 추가하여 10-20분 동안 칼리를 담그고 가끔 흔들어 줍니다.</li>
		<li>플라스크에서 세균 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 필터 용지 #1 또는 티슈 페이퍼를 사용하여 캘러스에서 과도한 세균 현탁액을 건조시라. 그런 다음 멸균 필터 종이로 덮인 NBD-AS매체(표 1)로페트리 접시에 #1 놓습니다. 3 일 동안 어둠 속에서 25-28 °C에서 배양하고 세균 성 과성장을 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>내성 콜러스 선택<ol>
<li>3일간의 공동 재배 후, 멸균 필터 용지를 사용하여 멸균 페트리 접시에 칼리를 옮기.</li>
		<li>깨끗한 벤치에서 2 시간 동안 칼리를 공기 건조시하십시오. 캘러스가 필터 용지에 부착되지 않았는지 확인합니다.</li>
		<li>1차 선택 매체 NBD2(40 mg/L hygromycin 및 250 mg/L timentin)(표1)로멸균 트위저를 사용하여 캘리를 균등하게 전송한다. 어둠 속에서 25-28 °C에서 2 주 동안 컬쳐 칼리.</li>
		<li>후 2 주, 신선한 선택 매체 NBD2를 포함하는 새로운 플레이트에 고르게 전송 캘리 (와 40 mg/L hygromycin 및 250 mg/L timentin)(표 1). 어둠 속에서 25-28 °C에서 또 다른 2 주 동안 칼리를 문화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>캘러스 차별화<ol>
<li>신선한 MS 매체로 캘러스를 전송 (와 25 mg/L hygromycin 및 150 mg/L timentin)(표 1). 약 2 주 동안 25-28 °C에서 빛 아래 배양.</li>
		<li>2.4.1 단계를 한 번 더 반복합니다.</li>
		<li>촬영 싹을 새로운 MS 매체(10 mg/L hygromycin)로 전송하여 더 많은 촬영을 증식합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>루트 유도<ol>
<li>새로운 촬영은 1/2 MS매체(표 1)로전송합니다. 25 °C - 28 °C에서 빛 아래 배양. 변형 된 식물은 2 주 이내에 뿌리를 생산합니다.</li>
		<li>1 주 후, 탈수 방지하기 위해 식물을 덮고 깨끗한 냄비에 식물을 전송합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 유전자형 식별
<ol><li>세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 방법을 이용하여 총 DNA 추출을 위해 새로 생성된 식물로부터 어린 잎을채집한다(31)</li>
	<li>유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여, 프라이머(Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATTATT 3' 및 히그로마이신-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTCA 3' 하이그로마이신 지역에 위치) 중합체 연쇄 반응(PCR)을Figure 4선택하여 중합체 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 4가지 유전자 통합을 검증한다. 다음 PCR 조건: 5 분 동안 94 °C; 36 사이클 (30 s에 대 한 94°C; 30 s에 대 한 56°C; 1 분 동안 72°C); 72 °C7 분. 성공적인 PCR 반응은 604 bp 앰플리턴을 생성합니다.</li>
	<li>특정 프라이머(OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3'와 OsABCGG15-ID-R: 5'TTGGTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACATTGCTAT 3')를 사용하여 CRISPR 표적 사이트를 둘러싼 게놈 영역을 증폭시키기 위해 다른 PCR을 수행합니다. PCR 조건은 3.2단계와 동일합니다.</li>
	<li>Sanger 시퀀싱을 위해 3.3 단계에서 PCR 단편을 사용하여 돌연변이를 식별합니다.</li>
</ol>4. 돌연변이의 기본 표현형을 준수
<ol><li>I2-KI용액 준비: 10mL의 증류수에 KI(요오드 칼륨)를 2g을 녹인 다음 I 2(재서브요오드)의 0.2 g를 추가합니다.2 혼합 후 총 부피를 증류수와 함께 100mL로 가져옵니다.</li>
	<li>FAA 용액(63% 무수성 에탄올, 빙하 아세트산 5%, 포름알데히드 5%, 물 27%)을 준비하고 사용하기 전에 섞는다.</li>
	<li>0.5% Toluidine 블루 스테인닝 솔루션을 준비: 100mL의 증류수에 톨루이딘 블루 0.5g을 녹입니다.</li>
	<li>디지털 카메라로 전체 식물을 이미징하여 식물학적 현상 관찰을 수행합니다.</li>
	<li>생식 표현형 관찰을 수행하고, 꽃에서 팔레아와 뢰마를 제거합니다. 스테레오 현미경으로 전체 anthers의 사진을 찍습니다.</li>
	<li>요오드 염색에 의해 꽃가루 생존가능성을 관찰하십시오.<ol>
<li>꽃 무신 전에 성숙한 쌀 스파이크를 선택하고, 팔레아와 뢰마를 제거하여 마취자를 방출합니다.</li>
		<li>6 개의 anther를 가져 와서 유리 슬라이드에 놓습니다. 증류수 1방울을 넣고 핀셋으로 앤터를 잘 부수고 꽃가루 곡물을 방출한 다음 I2-KI용액2-3방울을 추가합니다. 커버 슬립으로 덮습니다.</li>
		<li>낮은 배율 현미경에서 관찰하십시오. 검은 색으로 염색된 꽃가루 곡물은 더 활발한 생존력을 나타내며, 염색된 색상이나 황갈색은 기절하거나 퇴화되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>쌀 앤서의 반 박면 부분을 수행<ol>
<li>다양한 개발 단계의 쌀 꽃을 FAA 솔루션으로 수정합니다. 재료가 수집 병의 바닥으로 가라 앉을 때까지 고정이 조직에 침투 할 수 있도록 4 ° C (일반적으로 15 분)에서 재료를 진공 청소기.</li>
		<li>다음 날 새로운 FAA 솔루션으로 교체하십시오. 재료가 바닥에 가라앉으면 70 % 에탄올로 교체하고 4 °C에서 저장하여 장기간 사용하십시오.</li>
		<li>에탄올의 다른 그라데이션으로 재료를 탈수 (70%, 80%, 95% 30 분 동안 매번, 2 h에 대한 100 % 에탄올, 2 h에 대한 사프란 염료의 조금을 포함하는 100 % 에탄올). 참고: 두 번째 100% 에탄올에 사프란 염료를 약간 추가하여 마취제에 색상을 추가하여 나중에 쉽게 단면할 수 있습니다.</li>
		<li>제조업체의 지시(재료 표)를 따라 포함 작업을 수행합니다. 그런 다음 단면화 하기 전에 48 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 구우습니다.</li>
		<li>마이크로토메를 사용하여 샘플을 2 μm두께로 섹션화합니다. 유리 슬라이드에 물 한 방울을 추가합니다. 그런 다음, 집게에 의해 개미 블록을 포함하는 얇은 섹션을 선택하고 슬라이드에 물 방울의 표면에 넣어.</li>
		<li>슬라이드를 50°C의 수조에 놓고 단면을 완전히 분산하여 슬라이드에 단단히 부착합니다.</li>
		<li>0.5% toluidine 블루 용액을 사용하여 슬라이드를 30 분 동안 얼룩지게하십시오. 그런 다음 물로 헹구고 연기 후드에서 건조시다. 중립 나무 접착제로 밀봉하십시오. 슬라이드에 커버슬립을 부드럽게 놓고 연기 후드에 건조시다.</li>
		<li>현미경으로 샘플을 관찰하고 촬영합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

인공 유전자 남성 멸균 돌연변이는 전통적으로 무작위 물리적, 화학적, 또는 생물학적 돌연변이발생에 의해 생성됩니다. 이들은 강력한 기술이지만, 그들의 무작위 자연은 분자사육32에있는 맞춤형 개선을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있는 현대 유전체 지식의 광대 한 양을 활용하지 못합니다. CRISPR-Cas9 시스템은 DNA29,,33을조작하고 편집하는 간단하고 저렴한 수단으로 인해 식물에서 널리 사용되어 왔습니다. 그것은 전통적인 돌연변이 발생 방법에 비해 시간을 절약 할 수있는 잠재력을 가지고.
여기에서, 우리는 callus 유도를 위한 병으로 젊은 꽃식물을 사용하여 편리한 Agrobacterium-매개변환 시스템을 개발했습니다. 시간을 절약하기 위해 생략 할 수있는 트랜스진 절차에몇 가지 단계가 있습니다. 시작 재...

쌀은 특히 개발도상국에서 가장 중요한 식품 작물이며, 전 세계 인구의 절반 이상을 위한 주식 식품입니다. 전체적으로 쌀알에 대한 수요가 증가하고 있으며 2030년까지 50%, 2050년1,2에100% 증가할 것으로 예상됩니다.1 쌀 수율의 향후 개선은 쌀을 단장 식물 연구를위한 훌륭한 모델로 만드는 다양한 분자 및 유전 자원을 활용해야합니다. 여기에는 효율적인 변환 시스템, 고급 분자 맵 및 표현된 시퀀스 태그의 공개적으로 액세스할 수 있는 데이터베이스가 포함되며, 이는 수년 동안 생성된3,,4. 작물 수확량을 개선하기 위한 한 가지 전략은 하이브리드 종자 생산5이며,그 중 핵심 요소는 남성 다산을 조작하는 기능입니다. 시리얼 작물에서 남성 다산의 분자 제어를 이해 하이브리드 종자 생산을 개선 하 고 작물 생산성 향상 을 위해 실용적인 기술로 주요 지식을 번역 하는 데 도움이 될 수 있습니다6,,7.
유전자 변환은 작물 식물에 있는 외국 유전자의 소개 또는 내인성 유전자의 조작을 가능하게 하고, 유전자 변형 선의 생성귀착되기 때문에 기본적인 연구 및 상업적 농업을 위한 중요한 공구입니다. 적절한 변형 프로토콜은 유전자 조절8의근본적인 이해를 위한 유전 및 분자 생물학 연구를 가속화하는 데 도움이 될 수 있다. 박테리아에서, 유전 변환은 자연적으로 일어난다; 그러나, 식물에서는 분자 생물학 기법9,,10을사용하여 인위적으로 수행된다. Agrobacterium tumefaciens는 T-DNA를 전송하여 식물에 크라운 담즙 질환을 일으키는 토양 매개, 그램 음성 박테리아, T-DNA의 영역, 유형 IV 분비 시스템을 통해 식물 세포로11,,12. 식물에서, A. tumefaciens-매개변환은 숙주 게놈(13)으로 T-DNA의 안정적이고 낮은 복사13수 통합으로 유도되기 때문에 유전자 변형을 위한 광범위한 방법으로 간주됩니다. 트랜스제닉 쌀은 1990년대 중반 자포니카 품종14에서 아그로박테리움-중재유전자변환을 통해 처음 생성되었다. 이 프로토콜을 사용하여 변환 효율이 10%-30%인 4개월 이내에 여러 트랜스제닉 라인을 획득했습니다. 연구 결과는 성공적인 변환을 위한 2개의 중요한 단계가 있다는 것을 표시했습니다: 하나는 성숙한 씨앗에서 배아 원소의 유도이고 다른 하나는 식물14,,15에서더 높은 변환 효율성을 허용하는 공동 재배 도중 세균 문화에 아세토시링곤, 페놀 화합물의 추가입니다. 이 프로토콜은 japonica16,17,,,18,,19뿐만 아니라 인디카,20,21,22, 23및 열대 japonica23 ,24,,25와같은 다른 품종에서 사소한 변경으로 광범위하게 사용되었습니다., 실제로, 쌀 변환을 설명하는 기사의 80% 이상이 Agrobacterium-매개유전자 변환을 도구로사용한다(13). 현재까지, 여러 유전자 변형 프로토콜은,쌀 씨를 서두유도16,17,,18,19의시작 재료로 사용하여 개발되었다., 그러나, 거의 콜러스 생산을위한 흥분으로 젊은 꽃에 대해 알려져있다. 전반적으로 기능성 유전체학 및 작물 개선에 대한 연구를 위한 신속하고 재현 가능하며 효율적인 유전자 변환 및 재생 프로토콜을 확립하는 것이 중요합니다.
최근 몇 년 동안 CRISPR-Cas9 기술의 발전은 유전자 기능을 이해하고 식물 사육26,,27에대한 농업적으로 중요한 개선을 제공하는 정밀한 게놈 편집 메커니즘을 초래했다. CRISPR은 또한 남성 생식 개발 및 하이브리드 생산의 조작에 대한 상당한 약속을 제공합니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 기술을 이용한 유전자 녹아웃 시스템을 활용하여 젊은 꽃식물을 사용하여 효율적인 쌀 유전자 변형 프로토콜에 결합하여 생식 발달 연구를 위한 안정적인 남성 멸균 선을 생성했습니다.

<table><tbody><tr><td>1-나프탈렌아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0640</td><td></td></tr><tr><td>2, 4-디클로로페녹시아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-벤질아미노퓨린(6-BA)</td><td>시그마-알드리</td>치 <td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>아세토시링곤</td><td>시그마-알드리치</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>시노팜 화학 시약 10000561</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산 암모늄</td><td>Sinopharm 화학 시약 10002918</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aneurine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>무수 에탄올</td><td>Sinopharm 화학 시약 (주</td><td>) 10009218</td><td></td></tr><tr><td>세균 펩톤</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100636</td><td></td></tr><tr><td>쇠고기 추출물</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600114</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Sinopharm 화학 시약 10004808</td><td></td><td></td></tr> 염화<tr><td>칼슘 이수화물</td><td>Sinopharm 화학 시약</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>카제인 산 가수분해물</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>코발트 (II) 염화물</td><td>Sinopharm 화학 시약 10007216</td><td></td><td></td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염 5 수화물</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-포도당 무수</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>63005518</td><td></td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>Sinopharm 화학 시약 63011037</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA, Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>EOS 디지털 SLR 및 컴팩트 시스템 카메라</td><td>Canon</td><td>EOS 700D</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>완전 자동화된 회전식 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems Leica</td><td>RM 2265</td><td></td></tr><tr><td>빙초산</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10000208</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sinopharm 화학 시약 62011516</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>H370</td><td></td></tr><tr><td>이노시톨</td><td>시노팜 화학 시약 Co., Ltd</td><td>63007738</td><td></td></tr><tr><td>요오드</td><td>Sinopharm 화학 시약 10011517</td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산철 (II) 헵타 하이드레이트</td><td>Sinopharm 화학 시약 10012116</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0753</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌</td><td>시노팜 화학 시약 Co., Ltd</td><td>62004034</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>시노팜 화학 시약</td><td>62004736</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>베이징 XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>G229</td><td></td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>베이징 XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 헵타하이드레이트</td><td>시노팜 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>황산 망간 수화물</td><td>Sinopharm 화학 시약 10013418</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>NIKON</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Phytotech</td><td>M519</td><td></td></tr><tr><td>니코틴산</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0765</td><td></td></tr><tr><td>피타젤</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sinopharm 화학 시약 10016308</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산 이수소 칼</td>륨 <td>Sinopharm 화학 시약 10017608</td><td></td><td></td></tr><tr><td>요오드화 칼</td>륨 <td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>질산 칼</td>륨 <td>Sinopharm 화학 시약</td><td>1001721933</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine Hydrochloride (B6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47862</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>R501</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>몰리브덴산 나트륨 이수화물</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10019816</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica M205 A</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sinopharm 화학 시약 유한 공사</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Technovit 임베딩 키트 7100</td><td>Heraeus Teknovi, Germany</td><td>14653</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Beijing XMJ Scientific Co., Ltd</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine Blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 섹션 용 수조</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica HI1210</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Sangon Biotech</td><td>A515245</td><td></td></tr><tr><td>황산 아연 헵타하이드레이트</td><td>Sinopharm 화학 시약 10024018</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

남성 멸균은 일반적으로 남성 생식 기관/게임테의 기능적 결함을 특징으로 하는 하이브리드 종자 생산을 위한 중요한 농업 특성입니다. CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술의 최근 발전은 특정 사이트에서 내인성 후보 유전자의 높은 편집 효능 및 시간 절약 녹아웃 돌연변이를 허용합니다. 또한, 쌀의 아그로박테리움-중재된유전적 변화는 또한 많은 공공 및 민간 실험실에서 널리 채택된 유전자 변형을 위한 중요한 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 게놈 편집 도구를 적용하고 japonica 품종에서 OsABCG15의 표적 게놈 편집을 통해 3개의 남성 멸균 돌연변이 라인을 성공적으로 생성했습니다. 우리는 쌀에서 하이브리드 종자 생산을위한 유전 방출의 우수한 수단을 제공 할 수있는 수정 된 Agrobacterium-매개 쌀 변환 방법을 사용했다. 형질전환 식물은 2-3개월 이내에 얻을 수 있으며, 동종변성 변압제는 PCR 증폭 및 Sanger 시퀀싱을 사용하여 유전자를 사용하여 스크리닝하여 스크리닝하였다. 남성 멸균 균성 라인의 기본 피노티픽 특성화는 쌀 남성 생식 기관의 현미경 관찰에 의해 수행되었으며, 요오드 칼륨 요오드 (I2-KI)에 의한 꽃가루 생존 가능성 분석에 의해 개발 중인 멸균의 반 박형 단면화를 염색하였다.

여기에 입증 된 유전자 편집 기술은 쌀에 있는 Agrobacterium-매개 유전 변환에 의하여 미래 연구를 위한 남성 멸균 선을 만드는 것입니다. osabcg15의남성 멸균 라인을 생성하기 위해 CRISPR-CAS9 매개 돌연변이 발생은 이진 벡터 구조에 사용되었다. sgRNA는 OsU3 프로모터에 의해 구동된 반면, hSpCas9의 발현 카세트는 이중 35S 프로모터에 의해 구동되었고, 중간 벡터는 아그로박테리움을위해 설계된 단일 바이너리 벡터 pCAMBIA1300으로 조립되었다-쌀의 안정적인 변형을 중재하였다. 쌀의 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 발생에 사용되었던 구조의 그래픽 표현이 도 1A에제공됩니다.
도 2 및 도 3은 쌀 유전자 생산의 전체...

이 작품은 CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술을 사용하여 내인성 유전자 OsABCG15를 녹아웃한 다음 수정된 Agrobacterium-매개변환 프로토콜을 사용하여 쌀에서 안정적인 남성 멸균 라인을 생성합니다.

Agrobacterium-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

콜러스 생산을 위한 절제로서의 젊은 꽃피는 신속하고 효율적인 유전자 변환및 유전자 기능을 드러내는 재생 방법과 작물 개선을 위한 재생 방법을 확립하는 데 중요합니다. 콜러스 생산을 위한 절제로서 젊은 꽃피는 신속하고 효율적인 유전자 변환 및 유전자 기능을 드러내기 위한 재생 방법을 확립하는 데 중요합니다. 이 기술의 비디오 데모는 시청자가 시간과 노력을 낭비하지 않고 원하는 형질 전환기를 생성하는 재료를 유지하는 과정을 이해하는 데 도움이됩니다.논에서 어린 쌀 꽃집이나 메이오시스 단계에서 온실을 수집하여 잎 칼집으로 덮여 있는지 확인하십시오. 70%의 알코올 면봉으로 각 꽃집을 닦고 절단하기 전에 건조시키십시오. 멸균 실험실 벤치에 꽃집을 가져와 멸균 된 가위로 잘라낸 다음 절단을 NBD2 배지가 들어있는 페트리 플레이트로 옮길 수 있습니다.10~14일 동안 26°C에서 어둠 속에서 접시를 배양하여 콜러스를 유도합니다. 변환을 수행하기 위해, 50 밀리리터 원추형 멸균 시험관에서 동일한 항생제를 함유하는 액체 YEB 배지의 5밀리리터로 선택적 항생제를 가진 백색 EB 플레이트에서 단일 콜로니를 이송한다. 박테리아가 0.5의 OD 600로 성장할 때까지 250 배 g와 25 ~ 28섭씨에서 궤도 셰이커에 튜브를 흔들어.250 밀리리터 원뿔형 플라스크에 동일한 선택적 항생제를 가진 YEB 배지 의 100 밀리리터에 세균 현탁액 1 밀리리터를 추가하고 4 시간 동안 250 배 g및 28 섭씨에서 궤도 셰이커에 플라스크를 흔들어 줍니다. 원심분리기는 박테리아를 수집하기 위해 실온에서 10분 동안 4, 000g에서 배양한다. 상체를 버리고 AAM AS 매체로 펠릿을 다시 중단한 다음 서스펜션을 0.4의 OD 600으로 희석시 보디울 수 있습니다.인큐베이션 후, 약 150밀리리터 멸균 플라스크로 약 150개의 건강한 밝은 황색 배아 원내 캘리를 수집합니다. 플라스크에 세균세포 현탁액50~75밀리리터를 추가한 다음 신선한 AAM AS 배지 10~25밀리리터를 추가하여 10~20분 동안 칼리를 담그고 가끔 씩 씩씩하게 흔들어줍니다. 플라스크에서 세균 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 필터 용지로 칼리를 말린 다음 NBD AS 매체로 페트리 접시에 놓고 필터 용지로 덮습니다.3 일 동안 어둠 속에서 25 ~ 28도의 칼리를 배양하여 세균 성 과성장을 확인합니다. 3일간의 공동 재배 후, 필터 용지를 사용하여 멸균 페트리 접시에 칼리를 옮은 다음 깨끗한 벤치에서 2 시간 동안 공기를 건조시하십시오. calli가 필터 용지에 부착되지 않았는지 확인하고 기본 선택 매체 NBD2로 전송합니다.2 주 후, 신선한 선택 매체를 포함하는 새로운 플레이트에 캘리를 균등하게 전송한 다음, 분화를 위해 신선한 MS 매체로 칼리를 이동하고 촬영 싹을 1리터 히그로마이신 당 10 밀리그램으로 MS 매체로 이동하여 더 많은 촬영을 증식합니다. 새로운 싹을 반 MS 매체로 옮겨 뿌리 유도를 위해 25~28도의 빛 아래에서 배양합니다. 변형 된 식물은 2 주 이내에 뿌리를 생산해야합니다.생식 표현형 관찰을 수행하려면, 플로리다에서 팔레아와 lemma를 제거하고 스테레오 현미경으로 전체 anthers를 이미지. 꽃가루 생존가능성을 관찰하려면 꽃무늬 가무늬 가루 전에 성숙한 쌀 스파이크를 선택하고 창백한 과 뢰마를 제거하여 마취기를 방출합니다. 여섯 개의 anther를 가지고 유리 슬라이드에 놓습니다.증류수 한 방울을 넣고 핀셋으로 앤터를 분쇄하여 꽃가루 곡물을 풀어주린 다음, 2~3방울의 요오드 용액을 넣고 커버슬립으로 덮습니다. 낮은 배율 현미경에서 슬라이드를 관찰하십시오. 검은 색으로 염색 된 꽃가루 곡물은 더 활발한 생존력을 나타내며 색상이 없거나 염색 된 노란색 갈색이 있는 곡물은 기절하거나 퇴화됩니다.횡단 면방향 현미경 검사를 수행하려면 0.5%의 toluidine 블루 용액을 사용하여 슬라이드를 30 분 동안 묻은 다음 물로 헹구고 연기 후드에서 건조하십시오. 일단 건조되면, 중립 나무 접착제로 슬라이드를 밀봉 부드럽게 슬라이드에 커버 슬립을 배치하고 연기 후드에 건조, 다음 현미경에서 샘플을 이미지. 이 프로토콜은 쌀에 있는 Agrobacterium 매개 유전 변환에 의해 남성 멸균 선을 만드는 데 사용되었다.배아원 캘리는 추가 감염을 위해 더 많은 calli를 얻기 위하여 증식을 위한 변환 또는 하위 배양을 위해 직접 이용되었습니다. 48시간 동안 공동 육성한 후, 칼리는 2라운드 선발 매체로 이동했다. 10~14일 후, 변형된 칼리는 새롭게 형성된 마이크로칼리를 보였고, 트랜스포메이션되지 않은 칼리는 갈색으로 변해 죽었다.나중에, 건강하고 크리미한 색깔의 칼리는 재생 매체로 옮겨졌습니다. 변형된 칼리는 점차 녹색 반점을 보였다. 이러한 녹색 반점은 재생 매체에서 배양되어 촬영 성장을 허용한 다음 뿌리를 유도하기 위해 절반 MS 매체로 이동하였다.나중에, 잘 발달 된 뿌리와 건강하고 활발한 성장 싹을 수확했다. 총 21마리의 재생된 묘목을 얻었다. Hygromycin 영역에 대한 PCR 증폭은 변환 주파수가 약 85.71%였으며 변압제는 sgRNA 표적 부위에서 돌연변이를 식별하기 위해 유전자형이 되었다.18개의 형질화 식물 중 8개의 이종수구와 3개의 동질성 라인은 CRISPR CAS9 양성이었다. 동종 구스 녹아웃 돌연변이는 기본적인 남성 생식 기관 관찰에 의해 검증되었다. osabcg15의 anthers는 야생 유형의 것보다 작고 창백했으며 성숙한 꽃가루 곡물이 부족했습니다.횡단 단면 현미경 검사는 osabcg15에서 개미 형태 학적 결함을 조사하기 위해 수행되었다. 10단계에서 야생형 마이크로포기는 둥근 모양으로 되어 진한 파란색 의 색소로 얼룩진 엑신으로 비우게 되었습니다. 대조적으로, osabcg15 마이크로포자는 붕괴되고 저하되었습니다.이 프로토콜을 시도할 때 수집된 물질이 음오사증 단계에 있는지 확인하고 칼리의 공기 건조 시간을 제어하는 것이 중요합니다.

agrobacterium-mediated-genetic-transformation-transgenic-production

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Beernink, B. M. 외 재조합 여우꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염성 클론을 주입하여 옥수수 묘목을 직접 농연균화합니다. J. Vis. 경험 (2021)이 영상은 아그로박테리움 매개 재조합 바이러스 클론을 옥수수 묘목에 전달하여 유전자 침묵을 시연합니다. 이 연구는 아그로박테리움 감염, 전신 바이러스 확산, RNA 간섭에 의한 표현형 변화 과정을 개괄합니다.

아그로박테리움 매개 재조합 바이러스 클론을 옥수수 묘목에 전달하여 유전자 침묵을 위한 방법

이 비디오에서는 Agrobacterium tumefaciens 이진 벡터를 사용하여 쌀 게놈의 유전적 변형을 보여줍니다. 이 박테리아는 아그로박테리움(Agrobacterium) 독성 단백질을 사용하여 외부 DNA 플라스미드의 전달을 촉진합니다.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation: 유전자 조작 Agrobacterium tumefaciens를 통해 쌀 게놈을 유전적으로 변형시키는 방법

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

Agrobacterium tumefaciens 및 Agrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

식물 형태 유전자는 반발성 유전자형의 유전적 변형을 개선하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 것은 3개의 중요한 공공 옥수수 근친선에 대한 아그로박테리움-매개유전형형(QuickCorn) 프로토콜이다.

아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

다양한 연구 분야에서 모델 종으로 다용도로 적용되기 때문에 좁은 잎 질경이 (Plantago lanceolata)의 유전자 변형 툴킷이 필요합니다.  여기에서 Agrobacterium tumefaciens 매개 형질전환을 사용하여 형질전환 효율이 20%인 안정적인 형질전환 계통을 생성하는 프로토콜이 제시됩니다.

Agrobacterium tumefaciens - 좁은 잎 질경이의 매개 유전자 변형

이 프로토콜은 녹색 미세조류 클로렐라 심가리스(Chlorella vulgaris)의 핵 게놈에 관심 유전자를 통합하기 위한 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(AMT)의 활용을 간략하게 설명하여 안정적인 형질전환체를 생산합니다.

Agrobacterium tumefaciens-Medited Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris (녹색 미세 조류, 클로렐라 심가리스의 Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris)

여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

이 프로토콜은 유전체 편집 기술을 사용하여 정확하고 효율적이며 기술적으로 간단한 방식으로 설계에 따라 저항성 전분 쌀 품종을 육종하는 것을 설명합니다.

게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

우리는 자원 집약적 멸균 조직 배양 절차 없이 무성 양서류 배두과(Brassicaceae) 종인 Rorippa aquatica의 아그로박테리움 매개 변환을 위한 효율적이고 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 시각적 변형 마커와 새싹 재생 파이프라인을 활용해 거의 클론 변환체에 가까운 변환체를 성공적으로 생성하여 식물의 수중 환경에 적응하는 미래 연구를 진전시켰습니다.

무성 양서류 배아과(Rorippa aquatica)의 재생 기반 아그로박테리움 매개 효율적인 변형

임의의 점 kinematograms과 컴퓨터 - 생성 무척추 동물의 비디오 재생을 고용 op​​erant 조절 패러다임을 사용하는 도마뱀의 시각적 감도를 테스트.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

학습하세요 CRISPR-Cas9 유전자 편집을 이용한 벼 남성 불임 계통 생성 방법을 Agrobacterium 매개 변환으로 수행하는 과정을. 이 기술은 Oryza sativa에서 OsABCG15 유전자 녹아웃을 통해 안정적인 남성 불임 계통을 생산하여 작물 개량과 유전자 기능 연구에 활용됩니다.

Agrobacterium-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램

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