Name: 스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: 배우세요 스플릿 루시퍼라아제 보체법을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질 간 이종 상호작용을 분석하는 방법입니다. HEK293 T세포에서 저발현 수준으로 생체 내 단백질 결합을 정밀하게 검출할 수 있습니다.

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이 연구는 폴란드 크라쿠프의 국립 과학 센터 (NCN)의 보조금 번호 2016 / 23 / D / NZ3 / 01314에 의해 지원되었습니다.

1. 발현 플라스미드의 생성
<ol><li>토폴로지 예측 도구를 사용하여 관심 있는 단백질의 막 토폴로지를 검사합니다.</li>
	<li>융합 단백질이 골지 막에 삽입되면 더 크고 작은 단편이 세포질에 직면하도록 복제 전략을 설계하십시오. 여기에 제시된 경우와 같이, 관심있는 단백질의 N- 및 C-테르미니가 모두 세포질 지향적이라면, 여덟 가지 가능한 방법으로 단백질을 태그한다( 도 1B 참조). 관심있는 하나 또는 두 단백질 모두의 N- 또는 C 말단이 발광 지향적 인 경우, 태깅에서 제외하십시오.</li>
	<li>관심있는 유전자를 표준 클로닝 프로토콜에 따라 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝한다 ( 물질의 표 참조). 참고: 일부 태그 지정 옵션은 불충분한 근접성, 차선의 방향 또는 공간 제약으로 인해 작동하지 않을 수 있으므로 가능한 모든 방향을 테스트하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. 발현 플라스미드를 세포내로의 일시적 형질감염
<ol><li>트립신화에 의해 부착성 HEK293T 세포 배양물을 수확하고, 세포를 전용 완전 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포(2 x 104/100 μL/웰)를 투명한 바닥, 흰색 측면 96웰 플레이트에 플레이트에 플레이트합니다. 반복실험을 포함하여 테스트된 모든 조합 및 컨트롤을 수용할 수 있도록 웰의 총 수를 조정합니다. 참고: 열적 이동을 최소화하고 하룻밤 사이에 증발을 피하기 위해 플레이트의 내부 60개 웰만 사용하십시오. 폴리-D-라이신 코팅 플레이트를 사용하는 것은 물질 표에 표시된 것과 같이 매우 권장되며, 그렇지 않으면 후속 세척 단계 동안 세포가 분리될 수 있습니다.</li>
	<li>세포를 표준 조건(37°C, 5% CO2)에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>다음날 세포를 점 1.1에서 수득된 발현 플라스미드의 원하는 조합물로 형질감염시킨다.<ol>
<li>발현 플라스미드를 무혈청 배지 ( 표 참조)에서 각 구축물에 대해 6.25 ng/μL로 희석한다.</li>
		<li>지질계 형질감염 시약을 적절한 지질-DNA 비율로 첨가하고, 제조자의 지시에 따라 인큐베이션한다.</li>
		<li>8 μL의 지질:DNA 혼합물을 지정된 웰에 첨가한다. 부드러운 회전으로 접시의 내용물을 혼합하십시오. 이것은 50 ng/well에서 두 발현 작제물의 형질감염을 초래한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포를 표준 조건(37°C, 5% CO2)에서 20-24시간 동안 배양하였다. 참고: 세포를 더 오랜 시간 동안 배양하면 더 높은 수준의 융합 단백질 발현이 발생할 수 있으며, 이는 단편 간의 비특이적 연관성을 촉진시킬 수 있다.</li>
</ol>3. 중간 교환
<ol><li>다음날, 컨디셔닝 배지를 각 웰에 무혈청 배지 100 μL로 교체한다. 배지 교환 시 세포가 분리되지 않았는지 확인하십시오. 참고 :이 단계는 furimazine 작업 용액을 첨가하기 전에 2-3 시간 전에 수행해야합니다. 혈청 철수는 furimazine의 자기 발광으로 인한 배경을 최소화합니다.</li>
</ol>4. 후리마진 작업액의 제조
<ol><li>측정 직전에 1 부피의 furimazine을 19 부피의 희석 완충액 (20 배 희석)과 혼합하십시오. 참고: 준비될 furimazine 작업 용액의 총 부피는 분석될 개별 웰의 수에 따라 달라집니다(furimazine 작업 용액은 1:5 비율로 세포 배양 배지에 첨가되므로, 이전에 100 μL의 무혈청 배지로 채워진 각 웰에 25 μL의 furimazine 작업 용액을 첨가해야 함).</li>
	<li>furimazine 작업 용액을 지정된 웰 (25 μL / 웰)에 추가하십시오. 플레이트를 손으로 또는 오비탈 셰이커를 사용하여 부드럽게 혼합한다(예를 들어, 300-500 rpm에서 15초).</li>
</ol>5. 발광 측정
<ol><li>플레이트를 발광 마이크로플레이트 판독기에 삽입합니다.<ol>
<li>37°C에서 수행되어야 하는 실험을 위해 플레이트를 지시된 온도에서 10-15분 동안 평형화시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석할 웰을 선택합니다.</li>
	<li>통합 시간이 0.3초인 발광을 읽습니다. 필요한 경우 최대 2시간 동안 발광을 계속 모니터링합니다.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>모든 테스트 및 제어 조합에 대한 평균값과 표준 편차를 계산합니다.</li>
	<li>여러 비교를 통해 단방향 ANOVA를 사용하여 데이터를 분석합니다.</li>
	<li>관심 조합에 대해 얻어진 평균 발광을 상응하는 음성 대조군에 대해 얻어진 평균 발광으로 나눔으로써 폴드 변화 값을 계산한다. 결과를 평가합니다. 참고: 여기에 제안된 데이터 분석에 대한 접근 방식은 테스트된 조합에 대해 얻어진 발광이 해당 제어 조합에 대해 얻어진 발광보다 통계적으로 유의하게 높고, 동시에 이들 두 값의 비율이 10을 초과하는 경우 상호작용이 주장될 수 있다고 가정한다.</li>
</ol>

<ol><li>Hadley, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+nucleotide+sugar+transporters%3A+Current+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).</li>
<li>Puglielli, L., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution%2C+identification%2C+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+GDP-fucose+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).</li>
<li>Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+the+rat+liver+Golgi+membrane+UDP-N-acetylgalactosamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).</li>
<li>Gao, X., Dean, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protein+domains+of+the+yeast+Golgi+GDP-mannose+transporter+mediate+oligomer+assembly+and+export+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).</li>
<li>Olczak, M., Guillen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mutation+and+an+alternative+splicing+of+UDP-galactose+transporter+in+MDCK-RCAr+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-N-acetylglucosamine+transporter+and+UDP-galactose+transporter+form+heterologous+complexes+in+the+Golgi+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane.</a> FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).</li>
<li>Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+delivery+of+activated+sialic+acid+into+Golgi+for+sialyation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).</li>
<li>Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+substrate+specificity+and+regulation+of+nucleotide+sugar+transporters+in+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer.</a> Nature Communications. 10 (1), 4657(2019).</li>
<li>Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+homologous+and+heterologous+interactions+between+UDP-galactose+transporter+and+beta-1%2C4-galactosyltransferase+1+using+NanoBiT%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT.</a> Analytical Biochemistry. 593, 113599(2020).</li>
<li>Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Leishmania+GDP-mannose+transporter+is+an+autonomous%2C+multi-specific%2C+hexameric+complex+of+LPG2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits.</a> Biochemistry. 39 (8), 2013-2022 (2000).</li>
<li>Sosicka, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+orphan+nucleotide+sugar+transporter+SLC35A4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).</li>
<li>Sprong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Golgi+UDP-galactose+transporter+with+UDP-galactose%3Aceramide+galactosyltransferase+allows+UDP-galactose+import+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).</li>
<li>Maszczak-Seneczko, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+%28SLC35A2%29+and+UDP-N-acetylglucosamine+%28SLC35A3%29+Transporters+Form+Glycosylation-related+Complexes+with+Mannoside+Acetylglucosaminyltransferases+%28Mgats%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats).</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).</li>
<li>Khoder-Agha, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylglucosaminyltransferases+and+nucleotide+sugar+transporters+form+multi-enzyme-multi-transporter+assemblies+in+golgi+membranes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).</li>
<li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
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<li>Akinjiyan, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Luminescence-Based+High-Throuput+Approach+for+Cellular+Resolution+of+Protein+Ubiquitination+using+Tandem+Ubiquitin+Binding+Entities+%28TUBEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs).</a> SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).</li>
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<li>Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+in+the+ATG5-ATG16L1+complex+following+nutrient+deprivation+measured+using+NanoLuc+Binary+Technlology+%28NanoBiT%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT).</a> FEBS Journal. , 15275(2020).</li>
<li>Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+NanoBiT-based+assay+monitors+the+interaction+between+lipoprotein+lipase+and+GPIHBP1+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time.</a> Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).</li>
</ol>

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여기서 우리는 분할 루시퍼라제 보체 검정을 사용하여 NSTs와 같은 골지-상주 유형 III 막 단백질 사이에 형성된 이종 복합체의 시연을 가능하게 하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 데이터 분석 및 해석에 대한 제안된 접근법은 관심있는 단백질 조합에 대해 수득된 발광을 상응하는 대조 조합에 대해 수득된 발광과 관련시키는 것을 포함하며, 이는 더 작은 단편과 융합된 박테리아 기원의 더 큰 단편 및 대조 단백질과 융합된 관심있는 단백질 중 하나로 구성된다. 후자는 포유동물 세포의 세포질에서 발현되고; 따라서, 이를 참고문헌으로 사용하려면 상호작용을 분석해야 하는 단백질의 N- 및/또는 C-테르미니가 골지막의 세포질 측면에 있어야 한다.
프로토콜의 중요한 단계는 플라스미드 설계, 형질감염 될 세포 도금, 자체 형질감염, 배지 교환, furimazine 작업 용액의 준비 및 세포에 첨가하는 것입니다. 플라스미드 설계는 루시퍼라제 단편이 모두 세포질에 직면하는 방식으로 이루어져야하며, 그렇...

이 원고는 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 일시적으로 형질감염된 인간 세포에서 골지-레지던트 타입 III 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 존재를 확인하기 위한 단계별 프로토콜을 기술한다. 이 절차는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 대해 가장 광범위하게 테스트되었지만 N- 및 / 또는 C- 테르미니가 세포질에 직면하고있는 다른 골지 상주 유형 III 막 단백질에 대해서도 긍정적 인 결과를 얻을 수있었습니다.
우리의 연구 그룹은 거대 분자의 글리코실화에서 NST의 역할을 탐구합니다. NSTs는 골지- 및/또는 ER-상주형 III 막 단백질이며, N- 및 C-테르미니는 오르가넬라 막의 세포질 측에 직면한다1. NST는 뉴클레오티드 활성화 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 글리코실트랜스퍼라제를 기질과 함께 공급하는 것으로 생각된다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머2,3,4,5,6,7,8,9,10을 형성한다. 더욱이, 상이한 NST들 사이의 이종성 상호작용도 또한 보고되었다6,11. NSTs는 또한 기능적으로 관련된 글리코실화 효소12,13,14와 복합체를 형성하는 것으로 입증되었다. 우리는 NST와 기능적으로 관련된 골지 상주 단백질의 상호 작용을 연구하기 위해 현재 사용되는 기술인 형광 수명 이미징 (FLIM) 기반 FRET 접근법에 대한 대안을 모색하여 분할 루시퍼라제 보완 분석을 테스트하기로 결정했습니다. 이를 통해 NST와 기능적으로 관련된 글리코실화 효소9 사이의 새로운 상호작용을 확인할 수 있었습니다.
분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변형, NanoBiT가 여기에 제시된 프로토콜15에 사용된다. 그것은 두 단편으로부터 루시퍼라제 효소 (예를 들어, NanoLuc)의 재구성에 의존합니다 - 큰 BiT 또는 LgBiT로 불리는 큰 단백질, 17.6 kDa 단백질, 그리고 작은 BiT 또는 SmBiT로 불리는 11 개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질. 관심있는 두 단백질은 상보적 단편과 융합되고 인간 세포주에서 일시적으로 발현된다. 두 융합 단백질이 상호작용하는 경우, 세포 투과성 기질의 첨가시 계내에서 발광이 생성된다. 이 두 단편은 그들이 융합된 관심있는 단백질 사이의 상호작용에 의해 함께 모이지 않는 한 최소 친화력과 연관되도록 최적화되었다.
일반적으로, 생체발광-기반 방법은 형광에 기초한 것들보다 몇 가지 장점이 있다. 생체 발광 신호는 루시페라아제 유래 신호16에 비해 배경 발광이 무시할 수 있기 때문에 더 높은 신호 대 잡음비를 갖는다. 대조적으로, 형광-기반 접근법은 일반적으로 자가형광의 현상에 의해 야기되는 비교적 높은 배경으로부터 고통받는다. 게다가, 생체 발광은 형광보다 분석 된 세포에 덜 해롭고, 전자의 경우와 마찬가지로 샘플을 여기시킬 필요가 없습니다. 이러한 이유로 생체 내에서 PPI를 연구하는 생체 발광 접근법은 Förster 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 Bi분자 형광 보체 (BiFC)와 같이 일반적으로 사용되는 형광 방법보다 우수합니다.
우리의 프로토콜은 관심있는 단백질 조합에 대해 얻어진 발광을 대조군 조합에 대해 수득된 발광에 대해 언급하는 것에 의존한다. 후자는 더 큰 단편 및 대조군 단백질 (예를 들어, HaloTag)과 융합되고, 더 작은 단편과 융합되는 시험된 단백질 중 하나를 포함한다. 후자는 포유류 단백질과 상호 작용할 것으로 기대되지 않는 박테리아 기원의 단백질입니다. 이 단백질을 대조군으로 사용하는 것은 분석하고자 하는 단백질의 골지-상주 쌍의 토폴로지에 한계를 제기한다. 포유동물 세포에서 이 단백질은 세포질에서 합성되기 때문에, 관심있는 두 단백질 모두 적어도 하나의 세포질 꼬리를 가져야 한다.
이러한 접근법은 PPI의 초기 스크리닝에 특히 유용할 수 있다. 관심있는 융합 단백질이 단순히 다른 접근법이 적용되기에 불충분 한 수준으로 발현 될 때 선택되는 방법이 될 수 있습니다. 유사하게, 분할 루시퍼라제 보체 분석은 관심있는 단백질이 높은 수준으로 발현되는 경우에 최선의 선택이 될 수 있지만, 이것은 그들의 아세포 국소화에 악영향을 미치거나 비특이적 상호작용을 강제하는 것으로 알려져 있다. 더 작은 단편은 단지 11개의 아미노산만을 갖기 때문에, 분할 루시퍼라제 상보화 분석은 더 큰 태그를 사용할 때 적용될 수 있는 것은 불가능하다. 마지막으로, 여기에 제시된 경우와 같이 다른 기술을 사용하여 획득한 데이터를 추가로 확인하기 위해 사용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.25% 트립신-EDTA 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>부착 포유류 세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC 처리 마이크로플레이트, 뚜껑</td><td>포함 Corning</td><td>356651</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 보조제(열 비활성화 소 태아 혈청, L-글루타민, 페니실린, streptamycin)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT 단편</td><td></td><td></td><td></td>으로 태그가 지정되지 않은 관심 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드</tr><tr><td>FuGENE HD Transfection 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover Microplate Reader(또는 다른 발광 마이크로플레이트 리더)</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>표준 분자 복제를 위한 재료 및 시약(박테리아, 내열성 중합효소, 제한 효소, DNA 리가제, 핵산 정제를 위한 재료 및 시약)</td><td></td><td></td><td></td></tr>을 <tr><td>사용하는</td><td></td><td></td><td></td>세포주 전용 성장 배지</tr><tr><td>NanoBiT MCS 스타터 시스템</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>이 키트에는 SmBiT 및 양성 대조군 플라스미드 쌍과 융합된 HaloTag 단백질을 인코딩하는 대조 플라스미드뿐만 아니라 다양한 방향에서 NanoBiT 단편으로 관심 단백질을 태깅할 수 있는 벡터가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Nano-Glo Live Cell Assay System</td><td>Promega</td><td>N2011</td><td>이 키트에는 살아있는 세포에서 NanoLuc 활성을 검출할 수 있는 기질인 furimazine과 전용 희석 버퍼가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 저감 혈청 매체, 페놀 레드</td><td>없음 Gibco</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Oribital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석용 소프트웨어(예: GraphPad Prism)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 iii 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

Demonstration of Heterologous Complexes formed by Golgi-Resident Type III Membrane Proteins using Split Luciferase Complementation Assay

이 프로토콜의 목표는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 의해 형성된 이종 복합체를 입증하기 위한 분할 루시퍼라제 상보의 가장 최근의 변이체의 적용 가능성을 탐구하는 것이다. 이러한 ER- 및 골지-상주 다막횡단 단백질은 세포질적으로 합성된 뉴클레오티드 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 그들의 기질과 함께 글리코실화를 매개하는 효소를 공급한다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머로서 존재한다. 서로 다른 NST 간의 이종 상호 작용도보고되었습니다. 이 기술이 NST 이량체화 현상을 연구하는 데 적합한지 여부를 확인하기 위해, 우리는 이전에 여러 가지 다른 방법으로 연관되는 것으로 밝혀진 두 골지 거주 NST의 조합에 대해 테스트했습니다. 루시퍼라아제 보체 분석은 높은 발현 수준을 요구하지 않기 때문에 골지-상주막 단백질 간의 상호작용을 연구하는 데 특히 적합한 것으로 보이며, 이는 종종 단백질 오국소화를 유발하고 위양성의 위험을 증가시킨다.

이 방법에서 가장 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 가능한 모든 조합을 테스트해야 합니다( 그림 1 참조). 동시에 양성 및 음성 대조군이 포함되어야합니다. 양성 대조군은 상호 작용하는 것으로 알려진 두 개의 단백질로 구성되어야하며, 그 중 하나는 더 큰 단편과 융합되고 다른 하나는 더 작은 단편과 융합됩니다. 이상적으로 음성 대조군은 유사하게 태그된 두 개의 상호작용하지 않는 유형 III 막 단백질로 구성되어야 한다. 그러나, 이러한 조절을 확립하는 것은 어려울 수 있는데, 이는 두 대조군 단백질의 상호작용의 결여가 몇 가지 대안적인 접근법을 사용하여 철저하게 확인되어야 하기 때문이다. 따라서, 임의의 인간 단백질(예를 들어, HaloTag)과 상호작용할 것으로 예상되지 않는 비인간 기원의 세포질 단백질을 음성 대조군으로 사용할 수 있는데, 만약 상호작용이 결정될 단백질의 N- 및/또는 C-테르미니가 여기에 제시된 경우와 같이 세포질적으로 노출된다면. 우리는 상응하는 플라스...

여기에 제시된 프로토콜은 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 살아있는 포유동물 세포에서 세포질적으로 노출된 N- 및/또는 C-테르미니와 골지-상주 III형 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 발생을 입증하기 위한 것이다.

스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

The goal of this protocol is to explore the applicability of the most recent variant of split luciferase complementation for demonstrating heterologous ...

당사의 프로토콜은 낮은 발현 수준에서 살아있는 세포의 소포체와 골지 복합체의 다중 막관통 단백질 간의 상호 작용을 식별하고 분석할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 종종 세포 건강에 해롭고 단백질 세포 내 국소화를 방해할 수 있는 높은 과발현 수준을 피할 수 있는 특별한 민감도에 있다는 것입니다. 트립신화(trypsinization)를 통해 부착성 HEK293 T 세포 배양을 수확하고 전용 완전 성장 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다.세포를 투명한 바닥, 흰색 면의 96웰 플레이트에 플레이트합니다. 반복실험을 포함하여 테스트된 모든 조합 및 대조군을 수용할 수 있도록 총 웰 수를 조정합니다. 그런 다음 표준 조건에서 밤새 세포를 배양합니다.다음 날, 원하는 발현 플라스미드 조합으로 세포를 transfection합니다. 각 구조체에 대해 마이크로리터당 6.25나노그램의 무혈청 배지에서 플라스미드를 희석하고 지질 기반 형질 주입 시약을 추가합니다. 적절한 지질 대 DNA 비율을 추가합니다.제조업체의 지시에 따라 플라스미드를 배양합니다. 그런 다음 8마이크로리터의 지질 DNA 혼합물을 지정된 웰에 추가합니다. 플레이트의 내용물을 부드러운 회전으로 혼합하고 표준 조건에서 20-24시간 동안 세포를 배양합니다.다음 날, 각 웰의 컨디셔닝된 배지를 100마이크로리터의 무혈청 배지로 교체하여 배지 교환 시 세포가 분리되지 않도록 합니다. 발광을 측정하기 직전에 19부피의 희석 완충액과 19부피의 furimazine을 혼합합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 furimazine 작업 용액을 추가하고 손으로 또는 궤도 셰이커로 플레이트를 부드럽게 혼합합니다.플레이트를 발광 마이크로 플레이트 리더에 삽입하고 플레이트를 섭씨 37도에서 10 15분 동안 평형을 이룹니다. 분석할 웰을 선택하고 0.3초의 적분 시간으로 발광을 읽습니다. 필요한 경우 최대 2시간 동안 발광을 계속 모니터링합니다.이 프로토콜은 두 개의 뉴클레오티드 당 수송체인 SLC35A2 및 SLC35A3에서 테스트되었으며, 이는 N과 C 말단이 세포질을 향하고 있는 골기 상주 3형 막 단백질입니다. 8가지 가능한 태깅 옵션이 있었고 그 결과로 생성된 융합 단백질은 8가지 가능한 방법으로 함께 설정될 수 있었습니다. 테스트된 모든 조합과 대조군 조합에 해당하는 평균 상대 발광 단위 또는 RLU 값이 여기에 나와 있습니다.세 가지 조합에 대해 얻은 RLU 값은 해당 대조군 조합에 대해 얻은 값보다 훨씬 높았습니다. 관심 조합에 대한 비율 값을 얻기 위해 RLU 값을 각 대조군에 대해 얻은 RLU 값으로 나눴습니다. 10에서 1000 사이의 비율은 특정 상호 작용을 나타내는 매우 큰 지표입니다.SLC35A2과 SLC35A3 상호 작용한다는 아이디어를 뒷받침하는 두 가지 조합이 있습니다. 이 데이터를 확인하기 위해 HA 태그가 지정된 SLC35A2 또는 SLC35A3 가장 높은 상대 발광을 초래하는 조합과 함께 발현되었습니다. 다양한 양의 플라스미드와 코딩 HA 태그가 지정된 NST 변이체를 co-transfection에 사용했으며, 그 결과 RLU 값에서 통계적으로 유의미한 용량 의존적 감소가 나타났습니다.가장 중요한 것은 가능한 모든 방법으로 단백질 자기 관심을 해결하고 일부 태그 방향이 위음성 결과를 생성할 수 있으므로 가능한 모든 조합을 분석하는 것입니다. 가장 성능이 좋은 조합이 선택되면 해당 상호 작용의 역학을 모니터링하여 예를 들어 시간이 지남에 따라 관심 복합체를 방해하는 에이전트 또는 조건을 식별할 수 있습니다.

demonstration-heterologous-complexes-formed-golgi-resident-type-iii

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

단백질의 subcellular 지방화는 세포 신호의 spatio - 시간적 규정을 결정 중요합니다. 여기, 우리는 세포에있는 단백질의 공간적 상호 작용을 모니터링을위한 간단한 방법으로 bimolecular 형광 complementation (BiFC)를 설명합니다.

Bimolecular 형광 Complementation

단일 패스 transmembrane 도메인의 oligomerization의 성향 (TMDS)을 평가하는 효율적인 절차를 설명합니다. ToxR에 융합 TMD 구성된 키메라 단백질은 E. 대장균 기자 스트레인에 표현됩니다. TMD 유도 oligomerization는 ToxR, 해독 및 기자 단백질의 생산, - galactosidase의 활성의 dimerization이 발생합니다.

ToxR 분석에 의해 결정 Transmembrane 도메인 Oligomerization의 성향

우리는 β-갈 락토의 활성화 표현으로 올무로 인한 막 퓨전 이벤트를 단정 지을 세포 융합 분석을 개발했습니다.

효소 세포 융합 분석을 사용하여 올가미로 인한 막 퓨전 분석

이 동영상은 단백질-단백질 상호 작용을 검출하기 위한 분할 루시페라제 보체 분석을 보여줍니다. 이 분석법에서 관심 단백질은 루시페라아제 효소의 작은 단편과 큰 단편에 태그가 지정됩니다. 단백질이 상호 작용할 때 큰 조각과 작은 조각이 결합하여 활성 효소 복합체를 형성하며, 특정 기질이 존재할 때 측정할 수 있는 밝은 발광을 방출합니다.

특정 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 Split Luciferase Complementation Assay

골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

여기에 우리가 현재 큰 종양 억제기 (라트)의 키 니 아 제 활동을 계량 luciferase 기반 바이오 센서-Hippo 신호 전달 경로에 중앙 니. 이 바이오 센서는 다양 한 응용 프로그램 기본 및 변환 연구 마 통로 레 귤 레이 터에서 생체 외에서 그리고 vivo에서조사 목적에 있다.

Hippo 신호 Luciferase 기반 큰 종양 억제기 (라트) 바이오 센서를 사용 하 여 경로 활동 모니터링

여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

이 프로토콜은 C. elegans 생식선에서 의한 체르메게에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 근접 결찰 분석법의 사용을 입증한다.

근접 결찰 분석술을 사용하여 C. 예쁜꼬마선에서 리보뉴클레오 단백질 복합어셈블리의 시투 검출

당사는 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 모니터링하기 위해 split-luciferase reassembly assay를 확립했습니다. 이 분석을 사용하여 화학적 처리 조건에서 HEK293T 세포에서 이러한 세포 간 결합의 수준을 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다.

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

배우세요 스플릿 루시퍼라아제 보체법을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질 간 이종 상호작용을 분석하는 방법입니다. HEK293 T세포에서 저발현 수준으로 생체 내 단백질 결합을 정밀하게 검출할 수 있습니다.

스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연

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