Name: 마우스의 결막 장금 격리 및 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 마우스 결막 상재 세균 분리 및 MALDI-TOF 질량분석법을 이용한 동정 방법. 이 기술은 생존 미생물만 선별하여 안구 미생물군 연구와 질병 진단에 활용됩니다.

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P30 DK034854의 자금 지원VY, LB 및 매사추세츠 호스트-미생물군유전체 센터의 연구 및 NIH/NEI R01 EY022054의 자금 지원 MG.

마우스와 관련된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침을 따릅니다. 미생물 및 잠재적으로 오염된 물질로 작업할 때 실험실 안전 지침(기관 환경 보건 및 안전 부서의 지시)을 따르십시오. 잠재적으로 생물학적 오염 물질을 폐기하기 전에 적절한 폐기물 리셉터클 및 오염 제거 절차를 사용합니다.
1. 눈 면봉 준비, 작업 장 설정, 마우스 눈 면봉 및 샘플 농축
<ol><li>멸균 눈 면봉 준비 참고: 멸균 눈 면봉은 얇게 코팅 된 나무 이쑤시개와 면 의 섬유 얇은 층이 있는 집에서 만들어집니다.<ol>
<li>면봉을 할 수 있는 마우스 수에 대해 적절한 양의 면 타격과 이쑤시개를 자동 클랩합니다.</li>
		<li>엄지와 집게 손가락으로 면 타격의 반 센티미터 길이조각을 꼬집습니다. 엄지와 앞손가락으로 가장자리를 당겨 평평한 단일 다공성 층을 형성하여 타격을 애타게하고, 타격이 무너지기 직전에 멈춥니다 (늘어난 타격에 분산 된 면의 작은 비트는 허용됩니다).</li>
		<li>이쑤시개 끝에 늘어진 조각을 가볍게 잡고 이쑤시개 끝의 날카로운 끝 중 하나 주위의 타격을 소용돌이치며 그림 1을참조하십시오. "완성된" 눈 면봉은 팁 위에 뻗어 있는 매우 얇은 면층을 가지며, 팁에서 약 1cm 에서 1센티미터 정도 연장됩니다.</li>
		<li>"완성된" 면봉을 작은 비커에 넣고, 측면을 아래로 휘청이고 덮습니다. 오토 클레이 브.</li>
	</ol></li>
	<li>작업 공간 설정
	<ol>
<li>케타민 2mL(100 mg/mL), 자일라진 400 μL(100 mg/ml) 및 멸균식 식염수(dH2O에서0.9% NaCl)를 함유한 마취를 멸균 50mL 멸균 원심분리튜브에 준비한다. 즉시 사용하기 위해 필터 살균 및 알리쿼트 마취 (1 개월 동안 4 °C로 저장 될 수 있습니다. 항상 사용하기 전에 실온에 평형화 할 수 있습니다).</li>
		<li>오염을 최소화하기 위해 소독제로 작업 영역을 투명하고 청소합니다.</li>
		<li>알리쿼트 0.5mL의 멸균 뇌 심장 주입 매체(BHI)를 라벨으로 1.5mL 멸균 마이크로센심분리기 튜브(마우스 당 1튜브 및 제어); 미세 원심 분리기 랙에 배열하십시오. 얼음 위에 랙을 설정합니다.</li>
		<li>마우스 마취스테이션(왼쪽에서 오른쪽)과 같은 작업 흐름을 설정함: 마우스 마취스테이션(실험마우스, 빈멸균 케이지, 실온 마취, 25G 바늘 및 1mL 주사기), 눈 면봉 스테이션(얼음에 대한 알리인용 BHI, 멸균 눈 면봉, 깨끗한 종이 타월, 70% 이소프로판스프레이) 및 플라고 플레이트(실용체)와 플라게팅 플레이트(실용1)와 플라고(실)를 , 10 μL 멸균 일회용 팁, 생물 위험 폐기물 용기).</li>
	</ol></li>
	<li>눈 면봉
	<ol>
<li>각 성인 마우스에 각각 케타민과 자일라진의 마우스 중량 투여량 1g당 10μL의 마취를 투여하고 오토클레이브 케이지에 넣습니다. 뒷발 패드를 압박하여 마취를 테스트; 움직임이 적절한 마취를 나타내지 않습니다.</li>
		<li>마취된 마우스만 처리하고 다른 한편으로는 눈 면봉과 배양만 처리하기 위해 한 손을 할당합니다. 스와빙의 경우 케이지에서 완전히 마취된 마우스를 제거합니다. 왼쪽 눈이 노출된 깨끗한 작업 표면 위에 놓입니다. 장갑을 낀 손을 이소프로판올로 스프레이하고 깨끗한 종이 타월로 말리십시오.</li>
		<li>언캡은 특별히 전용 미디어 핸들링 핸드와 BHI 마이크로 원심 분리 튜브를 표시. 튜브를 얼음 위에 미세 원심분리기 랙에 다시 넣습니다.  BHI에 눈 면봉의 면 코팅 된 끝을 찍어, 여분의 액체를 제거하기 위해 내부 튜브에 대한 팁을 2 번 소용돌이 튜브에서 눈 면봉을 철회.</li>
		<li>마우스 핸들링 핸드로 마우스를 목 덜미로 부드럽게 잡습니다. 한편, 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 눈면봉끝을 놓고 도 2A를참조하십시오. 가볍게 안구를 우울하게 하고 창 세척동작(그림 2B)에서면봉을 앞뒤로, 아래 눈꺼풀과 눈 사이, 10회 이동합니다. 일정한 압력을 유지합니다.</li>
		<li>모피를 건드리지 않고 면봉 끝을 부드럽게 제거하고, 삽입된 위치에 수직으로 면봉면을 직접 내려 놓고 BHI 미디어가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브에 직접 놓습니다. 윤활안 방울을 헤딩한 눈에 바레고 발라주세요.</li>
		<li>마우스를 케이지로 반환합니다.</li>
		<li>면봉이 얼음 위에 10-15분 동안 서서 10회 회전을 위해 미디어에 팁을 혼합하여 멸균 장갑손으로 눈 면봉을 제거하십시오. 마이크로 원심분리관의 내벽에 대해 5회 회전하여 회전팁으로 면봉을 철회한다. 생물 위험 용기에 면봉을 폐기하십시오.</li>
		<li>각 마우스와 제어 샘플(피부 또는 모피 면봉)에 대해 1.3.2 ~ 1.3.7 단계를 반복합니다. 각 면봉 사이에 장갑을 적절히 살균합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>농축
	<ol>
<li>37°C에서 1시간 동안 튜브를 정적으로 배양하여 샘플을 풍부하게 합니다.</li>
		<li>인큐베이션 하는 동안, 마우스 당 5% 양의 혈액 한천 판 (TSA 플레이트)와 함께 한 실온 Trypticase 콩을 표시 하 고 절반으로 나눕니다.</li>
		<li>눈 면봉 배양 배양 후 인큐베이터에서 농축 된 샘플을 제거하고 얼음 위에 놓습니다.</li>
		<li>도 3A의회로도에 따라 짧게 소용돌이 샘플을 혼합하고 플레이트한다. 시료의 Aliquot 10 μL을 TSA 플레이트에 기울이고 접시를 기울여 스트립을 형성하고 2회 반복합니다.</li>
		<li>플레이트 의 분할 선의 반대편에, 점 10 점 10 표본의 천에 샘플, 반복 9 번.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 18시간, 2일 및 4일 동안 배양합니다(한천판이 건조되는 것을 방지하는 깨끗한 챔버에서). 스트립에서 식민지를 계산하고, 형태학을 기록하고, 형태학적으로 유사한 격리를 위해 면봉 당 콜로니 형성 단위 (CfU)를 계산합니다. 스트립에 캡처되지 않은 독특한 유기체에 대한 점을 보십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 마스터 플레이트, 특성화 및 안구 미생물의 식별
<ol><li>
마스터 플레이트
	<ol>
<li>TSA 플레이트 뒷면에 그리드를그립니다(그림 3B). 각 마우스 눈 면봉 플레이트에서 멸균 이쑤시개를 가진 식민지를 선택하고 마스터 플레이트 사각형 (그리드), 식민지 번호 와 마우스 정보가있는 라벨 그리드를 줄입니다. 각 형태학적으로 뚜렷한 식민지에 대해 세 개의 다른 식민지를 선택하고 접시.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 96시간 동안 배양을 계속하여 매일 새로운 격리의 모양을 확인합니다. 참고: 교만 인구는 마우스 연령, 영양, 질병 상태 및 caging 관행에 따라 달라집니다. 분리 특성은 우리의 실험실에서 발견 하는 주요 호기성 및 육성 혐 기성 박테리아에 기초.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
특징을 나타냄
	<ol>
<li>매니톨 솔트 아가(MSA) 및 맥콩키(MAC) 플레이트에13개의 플레이트 미생물을 복제하여 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 각 분리 및 MSA에 후광과 왁시 식민지 또는 노란색 식민지의 존재에 대한 성장주의.</li>
		<li>그램 양성 코치의 경우, 카탈라제테스트(13,14)로테스트한다. 깨끗한 유리 슬라이드에 과산화수소 3% 방울을 놓습니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 눈 면봉 판에서 해당 미생물을 선택합니다. 어떤 기포 형성은 연쇄상 구균 spp를 나타내지 않습니다.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
식별: MALDI-TOF MS 분석 참고: 세균 성 식별은 MALDI-TOF 및 소프트웨어 데이터베이스를 사용하여 수행됩니다. 이 시스템은 식별을 위해 알려진 세균 스펙트럼과 비교하여 스펙트럼 프로파일을 개발하기 위해 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 시간 비행 질량 분석법(MALDI-TOF MS)을 사용합니다. 대장균,ATCC 8739는 시스템 교정에 사용됩니다.<ol>
<li>플레이트 세균은 5%의 양 혈액을 함유한 TSA 플레이트에 분리하고 37°C에서 5%의 이산화탄소로 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>1 μL 루프를 사용하여, MALDI-TOF 표적 슬라이드에 순수 박테리아의 얇은 층을 적용; MALDI-TOF MS CHCA 매트릭스 용액(알파-시아노-4-하이드록시신나마이산)의 1μL은 오버레이되어 MALDI-TOF 계측기로 슬라이드를 적재하기 전에 완전히 건조할 수 있습니다.</li>
		<li>각 격리는 중복으로 발견됩니다.</li>
		<li>확률 점수가 80% 이상인 보고서는 차별 가치가 높음을 나타내며 신뢰할 수 있는 결과로 받아들여지고 세균 식별이 허용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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안구 표면의 파시균 상태로 인해 많은 실험실에서 안구 공생을 분리하는 데어려움이 있어7,20의성장, 낮은 풍부및 낮은 다양성8을가진 시료수가 적어집니다. 이 방법은 MALDI-TOF MS에 의한 재설계된 눈 면봉 및 식별뿐만 아니라 농축 단계의 첨가에 의해 표준 배양 관행4,21에 크게 향상됩니다. 농축 단계는 세균 부하를 증폭시켜 낮은 회수율을 해결합니다. 야생형 남성 마우스에 대한 눈당 2,500CFU의 상대적 풍부에 100 CFU 미만에서 회복 가능한 박테리아의 현저한 증가는 영양이 풍부한 매체의 배양이 실행 가능하지만 비 재배성박테리아(22,23)를재활성화시켜 휴면 미...

이 프로토콜의 목적은 안구 내막 에서 실행 가능하고 희귀 한 호기성 및 학부 성 혐기성 미생물의 특정 절연을 강화하여 안구 미생물군유전체를 특성화하는 것입니다. 광범위한 연구는 피부, 창자, 호흡기 및 생식기에 대한 막수 점막 커뮤니티를 프로파일드하고 이러한 지역 사회가 면역 체계의 발달과 반응1,2,3에영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 안구 내문 공동체는 안구건조증4,쇼그렌 증후군5 및 당뇨병6과같은 특정 질환 병리학 중에 변화하는 것으로 나타났다. 그러나, 전형적인 안구 표면 발생 공동체를 정의하는 능력은 다른 점막부위에비해 상대적으로 낮은 풍요로움에 의해 방해된다6,7,8. 이것은 상주 안구 미생물군유전체가 있는지, 그리고 존재하는 경우에, 피부 microbiome와 다른지, 결과적으로, 타고난 면역 계통 발달 및 반응에 그것의 현지 효력이 있는지를 통해 논쟁을 자극합니다. 이 프로토콜은 이 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
일반적으로, 안구 공생 틈새 시장을 정의하는 접근법은 시퀀싱 및 문화 기반 기술4,7,9에기초한다. 16 S rDNA 염기서열 분석 및 BRISK 분석7은 배양 기반 기술보다 더 넓은 다양성을 나타내지만 살아있는 미생물과 죽은 미생물을 구별할 수는 없습니다. 안구 표면은 눈물 필름의 항균 특성4로 인해 많은 미생물에 적대적이기 때문에 많은 DNA 단편을 생성하며, DNA 기반 접근법은 오염물질이 아닌 상주 교향곡으로 죽은 박테리아의 식별으로 데이터를 왜곡할 수 있는 이러한 유물을 검출할 것이다. 이로 인해 미생물의 풍부와다양성(10)에서더 높은 것으로 안구 공간의 비정상적인 장신 식별 및 특성화가 발생한다. 이것은 DNA 기지를 둔 방법을 통해 상주 안구 미생물군유전체를 정의하는 것을 어렵게 합니다. 반면, 표준 배양 기반 기술은 하중이 너무 낮기 때문에11을감지할 수 없습니다. 우리의 방법은 결막을 표적으로 할 수 있는 얇은 면봉을 사용하여 표준 관행을 향상시키고, 따라서 이웃 피부에서 오염을 피하고, 실행 가능한 유기체가 가능한 그러나 비 culturable를 소생하는 것을 목표로 영양 조밀한 매체에 있는 짧은 문화에 의해 풍부해질 수 있다는 개념뿐만 아니라, 희귀 한 생존 가능한 미생물을 위해 풍부하게 합니다.
결과, 눈 면봉 당 안구 공자의 상대적인 풍부, 결막 상주 미생물군유전체를 특성화 하 고 비교 목적을 위해 중요 하다. 우리의 데이터는 피부와 결막 미생물의 차이뿐만 아니라 증가 된 나이와 풍부한 성별 특정 차이와 더 큰 다양성이 있음을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 접근법은 녹아웃마우스(12)에서의기생 차이를 재현적으로 발견했다. 이 프로토콜은 caging 관행, 지리, 또는 질병 상태뿐만 아니라 면역 계통 발달 및 반응에 대한 교만 대사 산물 및 제품의 국소 효과로 인해 달라질 수 있는 안구 미생물군유전체를 설명하기 위해 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.1 내지 10 &마이크로; l 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1110-300</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>0.5 to 10 &micro; l Eppendorf 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-690-026</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>BD309623</td><td>각 눈 면봉 그룹당 1 주사기</td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>1000 &마이크로; ml 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2021</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>200 to 1000&micro; l Gilson 피펫맨 (P1000)</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>25G 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>눈당 바늘 1개 면봉 그룹</td></tr><tr><td>3% 과산화수소</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25359</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 인큐베이터</td><td>실험실 장비</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % 이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>PX1840-4</td><td></td></tr><tr><td>Ana-Sed 주사 (자일라진 100 mg / ml)</td> <td>Santa Cruz Animal Health</td><td>SC-362949Rx</td><td></td></tr><tr><td>BD BBL 그램 얼룩 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>B12539</td><td></td></tr><tr><td>분젠 버너</td><td>실험실 장비</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클린 종이 타월</td><td>실험실 장비</td><td></td><td></td></tr><tr><td>코튼 안솜/멸균 압연 코튼</td><td>CVS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 1ml 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>그램 염색 및 카탈라아제 테스트<</td></tr><tr><td>em>E.coli</td><td>ATTC</td><td>ATCC 8739</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>그램 염색 및 카탈라아제 테스트</td></tr><tr><td>케타민( 100mg/ml)</td> <td>Henry Schein</td><td>9950001</td><td></td></tr><tr><td>Mac Conkey 한천 플레이트</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>4321270</td><td>4 &deg에 저장; C 사용할 준비가 될 때까지</td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>784641</td><td>mfr의 지시에 따라 플레이트를 준비하고 4도에서 보관하십시오. C 1 주 동안</td></tr><tr><td>마우스</td><td>Jackson Labs</td><td>C57 / BL6J</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>만니톨 소금 한천 플레이트</td></tr><tr><td>RPI 뇌 심장 주입 미디어</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-488525</td><td>지시 및 오토 클레이브</td></tr><tr><td>SteriFlip (0.22 &micro; m 기공 크기 폴리 에스테르 설폰)</td> <td>EMD / Millipore, Fisher Scientifc</td> 살균 <td>마</td>취 <td>SCGP00525</td></tr><tr><td>멸균 코닝 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>430829</td><td>마취 준비</td></tr><tr><td>멸균 마우스 케이지</td><td>실험실 장비</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이쑤시개 (둥근 대나무)</td><td>Kitchen Essentials</td><td></td><td>사용 전 오토 클레이브 및 면봉 준비</td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>4321261</td><td>4 &deg에 보관; C 사용할 준비가 될 때까지</td></tr><tr><td>Vitek 타겟 슬라이드</td><td>BioMerieux Inc. Durham,NC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitek-MS</td><td>BioMerieux Inc. Durham,NC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitek-MS CHCA 매트릭스 솔루션</td><td>BioMerieux Inc. Durham, NC</td><td>411071</td><td></td></tr><tr><td>일회용 안약</td><td>CVS Pharmacy</td><td></td><td>Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 바이알, 각 0.02 fl oz.</td></tr></tbody></table>

마우스의 결막 장금 격리 및 식별

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

안구 표면은 한 번 면역 특권과 비생물으로 간주되었다, 하지만 최근에는 작지만 지속적인 막연한 막대한 존재가 있는 것으로 보인다. 안구 점막에서 세균 종의 식별 및 모니터링은 그들의 낮은 풍부와 인문 성장 및 식별을위한 적절한 방법론의 제한된 가용성으로 인해 도전하고있다. 문화 기반 또는 DNA 염기서열 분석 방법의 두 가지 표준 접근 법이 있습니다. 첫 번째 방법은 제한된 회수 가능한 박테리아로 인해 문제가 되고 두 번째 접근법은 안구 공간의 비정상적인 표현으로 이어지는 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 모두 식별합니다. 우리는 표준 미생물 배양 기술을 기반으로 세균 격리를 위한 견고하고 민감한 방법을 개발했습니다. 이것은 "실험실"이 낮은 결막을 대상으로 하는 얇은 면봉을 활용한 면봉 기반 기술이며, 그 다음으로 호기성 및 학부 해부학 적 제네라에 대한 증폭 단계가 뒤따릅니다. 이 프로토콜은 우리가 코린 박테리움 spp., Coagulase 네거티브 황색포도상구균 spp., 연쇄상 구균 spp등과 같은 결막 종을 분리하고 식별할 수 있게 했습니다. 접근은 다른 질병 조건의 마우스에 있는 막증을 정의하는 것이 적합합니다.

도금에 대한 다양한 방법을 보여주는 눈 면봉 판에 대한 대표적인 결과는 C57BL/6 마우스로부터 형태학적으로 다양한 분리를 보여주는 도 3A에 그려지고 있다. 각 뚜렷한 격리에 대해, 식민지는 스트립과 상대적 풍부, 눈 면봉 당 독특한 콜로니 형성 단위 (CfU)에 계산하고 비교 목적을 위해 플롯하였다. 미생물 특성화를 위해, 박테리아는 마스터 TSA 플레이트를 생산하기 위해 개별 마우스 눈 면봉 플레이트에서 수확되었다 (각 마우스 눈 면봉 플레이트에서 삼중 분리체에서 형태학적으로 뚜렷한 분리를 따기하여 생성). 마스터 플레이트에서, 후속 날 또는 성장이 나타날 때, 추가 테스트는 미생물을 특성화하거나 식별하기 위해 실행되었다. 마스터 플레이트는 각각의 분리를 확장하기에 충분한 접종을 제공하는 데 사용되었습니다.
종은 미생물학적 기술을 사용하여 특징지어졌으며 MALDI-TOF MS 분석에 의해 확인되었습니다. 각 분리판은 카...

여기에 제시된 것은 미생물 기반 방법 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 후속 식별을 통해 독특한 눈 면봉 및 배양 기반 농축 단계를 사용하여 호기성 및 학부성 혐기성 마우스 결막 성 세균의 격리 및 증폭을 위한 프로토콜이다.

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

이 방법은 눈에 적대적인 환경 때문에 도전적인 가능한 안구 결막 미생물을 식별합니다. 안구 미생물군유전체가 존재하는지, 안구 질환의 세균성 존재가 어떻게 변하는지에 대한 답을 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 실행 가능한 미생물과 비실행성 미생물을 모두 식별하는 DNA 염기서열분석과는 달리,이 방법은 가능한 미생물만 식별하여 안구 공생 커뮤니티에 대한 명확한 이해를 합니다.연구에 따르면 비자가면역및자가면역안구건조증과 같은 안구 질환을 진단하기 어려운 것은 독특한 안구 세균성 존재가 있는 것으로 내다볼 수 있다. 이 방법은 특유의 미생물 서명으로 안과 질환을 진단하는 데 사용될 수 있습니다. 먼저 면봉할 마우스 수에 적합한 양의 면 타격과 이쑤시개를 자동화한 다음, 면 타격의 1/2 센티미터 길이조각을 꼬집고 가장자리를 당겨 서 타격을 막기 직전에 멈추는 평평한 단일 다공성 층을 형성하여 애타게 합니다.이쑤시개 끝에 늘어진 조각을 가볍게 잡고 이쑤시개 끝의 날카로운 끝 중 하나 주위에 타격을 소용돌이치십시오. 완성 된 눈 면봉은 팁에서 약 1/2 ~ 1 센티미터 까지 뻗어 있는 팁 위에 뻗어있는 면의 매우 얇은 층을 갖게됩니다. 면봉을 작은 비커에 넣고 옆으로 면봉한 다음 덮고 오토클레이브합니다.오염을 최소화하기 위해 소독제로 작업 영역을 청소하고 멸균 뇌 심장 주입의 알리쿼트 0.5 밀리리터, 또는 BHI 미디어를 라벨1.5 밀리리터 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 분류합니다. 랙에 튜브를 캡하고 얼음에 랙을 설정합니다. 실험 마우스, 빈 멸균 케이지, 실온 마취, 25 게이지 바늘 및 1 밀리리터 주사기가있는 케이지를 포함하는 마우스 마취 스테이션으로 시작하여 왼쪽에서 오른쪽으로 워크플로우를 설정합니다.다음으로, 얼음에 알리인용 BHI, 멸균 된 눈 면봉, 윤활 점안액, 생체 위험 용기, 깨끗한 종이 타월 및 70 %의 이소프로판올 스프레이가 들어있는 눈 면봉 스테이션을 준비하십시오. 마지막으로 실온 혈액 화천 플레이트, 10 마이크로리터 파이펫, 10 마이크로리터 멸균 일회용 팁 및 생체 위험 폐기물 용기가있는 도금 스테이션을 설치합니다. 뒷발 패드를 짜서 마우스가 제대로 마취되었는지 확인하십시오.움직임이 없는 경우에만 진행합니다. 마취 된 마우스와 다른 손을 처리하여 눈 면봉과 문화를 처리하기 위해 한 손을 할당합니다. 케이지에서 마우스를 제거하고 왼쪽 눈이 노출된 측면에 위치하는 작업 표면 위에 놓습니다.장갑을 낀 손을 이소프로파놀로 스프레이하고 종이 타월로 말리십시오. 전용 미디어 핸들링 핸드로 표시된 BHI 마이크로 원심분리기 튜브를 언캡하고 두 개의 튜브를 랙에 다시 배치합니다. BHI에 면봉의 면 코팅 된 끝을 찍어, 다음 여분의 액체를 제거하고 제거하기 위해 내부 튜브에 대해 두 번 팁을 소용돌이동안 튜브에서 면봉을 철회.마우스 핸들링 핸드로 마우스를 목 덜미로 부드럽게 잡습니다. 반면에, 눈의 끝을 왼쪽 눈의 내측 결막 부위에 대고 놓습니다. 눈알을 가볍게 누르고, 낮은 눈꺼풀과 눈 사이의 세안 동작으로 면봉을 10번 움직이며 일정한 압력을 유지합니다.모피를 만지지 않고 면봉 끝을 삽입한 위치에 수직으로 부드럽게 제거합니다. 면봉 면면을 BHI 미디어로 라벨이 붙은 마이크로 원심분리기 튜브에 직접 놓습니다. 면봉된 눈에 눈방울을 바르는 다.원하는 경우 제어 시료를 위해 피부 또는 모피 면봉을 획득하여 각 면봉 사이에 적절하게 장갑을 살균합니다. 완료되면 마우스를 케이지로 반환합니다. 면봉이 얼음 위에 10-15분 동안 서게 한 다음 장갑을 낀 손을 살균하고 10회 회전을 위해 미디어에 팁을 혼합하면서 면봉을 제거합니다.튜브의 내벽에 대한 팁을 5회 회전하여 회전하여 면봉을 철회하고 생체 위험 용기에 폐기하십시오. 각 마우스에 대한 프로세스를 반복합니다. 37°C에서 1시간 동안 튜브를 정적으로 배양하여 샘플을 풍부하게 합니다.인큐베이션 하는 동안, 마우스 눈 면봉 또는 제어 면봉 당 하나의 실온 TSA 플레이트를 표시 하 고 반으로 분할. 인큐베이터에서 농축 된 샘플을 제거하고 얼음위에 놓습니다. 샘플을 짧게 소용돌이에 섞은 다음 샘플의 10 마이크로리터를 TSA 플레이트에 알리쿼트하고 플레이트를 기울여 스트립을 형성합니다.이 것을 두 번 반복합니다. 플레이트 분할 선의 반대편에는 각각 10개의 마이크로리터샘플이 있는 10개의 점을 만듭니다. 100접시가 건조되는 것을 방지하는 깨끗한 챔버에서 18시간, 2일, 4일 동안 37°C의 플레이트를 배양합니다.스트립의 식민지를 계산합니다. 형태학적으로 유사한 격리를 위해 면봉당 식민지 형성 단위를 계산합니다. 독특한 유기체가 스트립에 포착되지 않는 점을 살펴보십시오.시각화를 용이하게 하기 위해 중간 및 오른쪽 플레이트에서 박테리아를 조밀하게 도금했습니다. 전형적으로, 우리는 눈 면봉 판에 있는 훨씬 더 적은 박테리아를 관찰했습니다. 경우에 따라 눈 면봉이 회수 가능한 박테리아를 생성하지 못할 수 있습니다.C57 블랙 6 마우스에서 형태학적으로 다양한 분리가 있는 대표적인 눈 면봉판이 여기에 나와 있다. 각 고유의 격리에 대해, 식민지는 스트립에 계산되었고 상대적 풍요로움이 계산되고 플롯되었습니다. 미생물 특성화를 위해, 박테리아는 마스터 TSA 플레이트를 생성하기 위해 개별 마우스 눈 면봉 플레이트에서 수확되었다.성장이 나타났을 때, 추가 시험은 미생물을 특성화하거나 확인하기 위하여 실행되었습니다. 마스터 플레이트는 각각의 분리를 확장하기에 충분한 접종을 제공하는 데 사용되었습니다. 격리를 식별하기 위해 TSA 플레이트가 하룻밤 사이에 줄무늬와 배양되었고 MALDI-TOF MS가 수행되었습니다.여기에 표시된 분리물의 예는 연쇄상 구균 산산성소미니무스 및 에어로코커스 비리단으로 확인되었다. 기만 유기체의 상당히 다른 수준은 남성과 여성 C57 블랙 6 마우스에서 회복되었다. 연쇄상 구균 산성미니무스, 에어로코커스 비리단은 부정적인 황색 포도상 구균및 E.coli는 C57 블랙 6 N 마우스로부터 분리되었다.이 프로토콜을 시도할 때 면봉을 얇게 코팅하고 눈 면봉 단계에서 시간을 내어 최상의 결과를 얻을 수 있음을 명심하십시오. MALDI-TOF MS에 대한 접근이 제한되는 경우, 격리는 미생물 및 생화학적 테스트에 의해 확인될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

포진 성 각막 질환의 대부분의 연구는 주요 감염 모델을 사용합니다. 그러나, HSV-1 기본 감염은 일반적으로 인간의 질병으로 이어질하지 않습니다. 여기보다 밀접하게 인간의 질병을 모방 포진 성 각막 질환의 재발 모델을 설명합니다.

마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

이 비디오는 안구 결막에서 생존 가능한 공생 박테리아를 분리하는 면봉 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 병원체에 대한 방어 역할을 하는 결막의 공생 박테리아 마이크로바이옴을 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다.

면봉 기반 결막 공생 박테리아 분리: 쥐 모델의 결막에서 공생 박테리아를 분리하는 기술

이 비디오는 Bacillus cereus에 의해 유발된 세균성 안구내염의 쥐 모델에서 얻은 눈 균질화에서 세균 감염을 정량화하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 쥐 모델에서 숙주 면역 반응과 숙주 및 안구 박테리아 유전자 발현에 대한 의존성을 연구하는 데 도움이 됩니다.

Bacterial Infection Quantitation Assay: A Method to Quantify intraocular Bacterial load in Mouse Model of Bacterial Endophthalmitis(세균성 안구내염의 마우스 모델에서 안구 내 세균 부하를 정량화하는 방법)

노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

이 프로토콜은 상대적으로 손상되지 않은 위치에서 눈꺼풀, 안구 표면, 전방 및 후방 세그먼트로 마우스 안구를 분리하는 방법을 설명합니다.

조직학적 검사 및 면역 조직화학을 위한 통합 안구 표면 조직을 얻기 위한 손상되지 않은 안구의 분리

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

우리는 여기에서 세균성 내과염의 마우스 모형에 있는 intravitreal 주입 및 후속 세균량의 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 숙주 면역 반응 및 세균 및 숙주 유전자 발현을 측정하기 위해 확장될 수 있다.

세균 성 내분염의 마우스 모형에 있는 감염 매개변수의 인트라비탈 주입 및 양

안구 표면 염증은 안구 표면 조직에 해를 끼치고 눈의 중요한 기능을 손상시킵니다. 본 프로토콜은 마이보미안 샘 기능장애(MGD)의 마우스 모델에서 안구 염증을 유도하고 손상된 조직을 수집하는 방법을 기술한다.

안구 표면 염증의 유도 및 관련 조직의 수집

망막 색소 상피(RPE)는 맥락막과 망막 사이의 중요한 장벽 역할을 하여 광수용체와 같은 망막 세포 유형의 건강과 기능을 촉진합니다. 여기에서, 우리는 성인 쥐 RPE를 분리하고 배양하기 위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 설명합니다.

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

이 기사에서는 안구건조증의 진단 및 치료에서 생체 내 공초점 현미경의 작동 및 효과를 보여주고 향후 연구의 기초를 제공하기 위해 생체 내 공초점 현미경의 적용 및 결과를 조사합니다.

생체 내 안구건조증의 진단 및 관리에서 공초점 현미경: 이미징 프로토콜 및 해석에 중점을 둡니다.

배우세요 마우스 결막 상재 세균 분리 및 MALDI-TOF 질량분석법을 이용한 동정 방법. 이 기술은 생존 미생물만 선별하여 안구 미생물군 연구와 질병 진단에 활용됩니다.

마우스의 결막 장금 격리 및 식별

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