안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석
2020년 8월 6일
이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
이 맥락막 분석은 재현성이 높고 맥락막 혈관 형성 연구 및 연령 관련 황반 변성과 관련이 있으며, AMD는 미세 혈관 거동에 대한 생체 내 연구를 보완할 수 있습니다. 이 분석법은 신생혈관 AMD에 대한 잠재적 치료법으로 화합물을 스크리닝하거나 야생형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 맥락막 신생혈관형성과 관련된 경로를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 500ml의 혈청이 함유된 완전한 클래식 배지에 500ml의 페니실린, 스트렙토마이신, 10-5mL의 시판 보충제를 첨가한 다음 50ml의 배지를 분취하여 기저막 추출물 또는 BME를 섭씨 2도에서 8도의 냉장고에서 밤새 해동합니다.
완전한 클래식 미디엄의 부분 표본을 얼음 위에 놓습니다. 해부 현미경, 집게 및 가위를 70% 에탄올로 청소합니다. 세포 배양 접시를 준비하고 하나는 해부 현미경에, 다른 하나는 얼음에 놓습니다.
그런 다음 각 요리에 10ml의 완전한 클래식 미디엄을 추가합니다. 해부하기 전에 얼음 위에서 눈을 완전히 고전적인 매체에 보관하십시오. 결합 조직과 시신경을 제거한 다음 마이크로 가위를 사용하여 각막 가장자리에서 0.5mm 후방으로 원주 방향으로 자릅니다.
각막, 홍채 복합체, 유리체 및 수정체를 제거합니다. 절단된 가장자리에서 시신경을 향해 수직으로 1mm를 절개하고 둘레 1mm 너비의 띠를 자른 다음 복합체의 중앙 영역과 주변 영역을 분리합니다. 집게를 사용하여 RPE 맥락막 공막 복합체에서 망막을 벗겨냅니다.
주변 맥락막 밴드를 얼음 위의 완전한 클래식 매체로 유지하십시오. 다른 쪽 눈을 분리하고 이 과정을 반복하여 두 번째 밴드를 자릅니다. 원형 밴드를 거의 동일한 정사각형 조각으로 5-6 개로 자릅니다.
30마이크로리터의 해동된 BME를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰 중앙에 추가합니다. BME의 물방울이 가장자리를 건드리지 않고 플레이트 바닥에 볼록한 돔을 형성하는지 확인하십시오. 조직을 BME의 중앙에 놓습니다.
맥락막 X 식물을 평평하게 만들지 마십시오. 조직이 BME 내에서 확장되도록 합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 젤이 굳어지도록 한 다음 각 웰에 500마이크로리터의 완전한 클래식 배지를 추가합니다.
클래식 매체를 격일로 바꾸십시오. 맥락막 발아는 현미경으로 3일 후에 관찰할 수 있습니다. 이미지 J가 있는 맥락막 발아 이미지를 열고 그레이 스케일로 이미지, 유형 및 8비트를 확인합니다.
그런 다음 이미지를 선택하고, 조정하고, 밝기 대비를 조정하고, 조정하여 대비를 최적화합니다. 마술 지팡이 기능을 사용하여 새싹 중앙에 있는 맥락막 조직의 윤곽을 잡고 제거합니다. 무료 선택 도구를 사용하여 이미지의 배경을 제거합니다.
다음으로, image(이미지)로 이동하여 threshold를 조정하고 threshold 함수를 사용하여 주변부의 배경에 대한 미세혈관 새싹을 정의합니다. F2를 클릭하면 요약이 나타납니다. 저장을 클릭하여 나중에 참조할 수 있도록 원본 이미지와 동일한 폴더에 선택한 영역의 이미지를 저장합니다.
샘플 그룹을 측정한 후 분석을 위해 기록된 데이터를 복사합니다. 이 프로토콜은 3일째부터 6일째까지 C 57, 검은색 6J 마우스에서 발아하는 맥락막을 검사하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 대표적인 사례로, 맥락막 발아 면적은 3일, 4일, 5일, 6일에 각각 0.38, 1.47, 5.62 및 10.09mm였습니다.
맥락막 혈관 발아에 대한 FFAR4 손실의 영향은 FFAR4 4 녹아웃 및 FFAR4 야생형 마우스에서 맥락막 발아 분석을 사용하여 평가되었습니다. FFAR4 녹아웃 마우스의 발아 영역은 6일째에 FFAR4 야생형에 비해 맥락막 혈관 성장을 증가시켰습니다. 또한, 1개의 마이크로몰 FFAR4 작용제로 치료한 결과, 6일째에 치료되지 않은 마우스에 비해 맥락막 발아 영역이 감소했습니다.
이 분석을 통해 약리학적 화합물의 항 혈관신생 가능성과 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 맥락막 신생혈관형성에서 특정 경로의 역할 변화를 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.
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개요
본 프로토콜은 미세혈관 증식, 특히 맥락막 혈관 신생 및 신생혈관성 연령 관련 황반변성(AMD)과 관련된 연구를 위한 ex vivo 모델로서의 맥락막 발아 분석법을 제시합니다. 이 분석법을 통해 맥락막 미세혈관 증식에 관여하는 경로를 평가하고, 야생형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료 효과를 평가할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
연구 분야
- 맥락막 신생혈관 형성
- 연령 관련 황반변성 (AMD)
- 미세혈관 거동
배경
- 안과 질환에서 맥락막 혈관신생의 중요성
- in vivo 연구를 보완하는 ex vivo 모델
- 심층적 이해를 위한 유전자 변형 마우스 모델
사용된 방법
- 맥락막 발아 분석법(Choroid sprouting assay)
- 야생형 및 유전자 변형 계통 유래 마우스 조직의 활용
- 맥락막 발아 관찰을 위한 현미경 검사
주요 결과
- 이 분석법을 통해 며칠에 걸쳐 맥락막 발아(choroidal sprouting)를 재현성 있게 측정할 수 있습니다
- 결핍 마우스(knockout mice)에서 FFAR4의 소실은 야생형(wild type)에 비해 맥락막 혈관 성장을 증가시켰습니다
- FFAR4 작용제(agonist) 처리는 결핍 마우스의 맥락막 발아 면적을 감소시켰습니다
결론
- 본 연구는 약물 화합물의 항혈관신생 잠재력을 평가하는 해당 분석법의 효능을 입증합니다
- 맥락막 신생혈관 형성에서 특정 신호 전달 경로의 역할을 강조합니다
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
ex vivo 맥락막 발아 분석법(choroid sprouting assay)은 신생혈관성 연령 관련 황반변성(AMD) 약물 발견과 직접적으로 관련된 맥락막 미세혈관 증식을 평가할 수 있는 재현 가능한 모델을 제공합니다. 이 분석법은 야생형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 혈관 형성 경로의 기전적 위험을 제거함으로써, 안과학 파이프라인에서의 타겟 검증 및 리드 물질 발굴을 지원합니다. 또한, 생리학적으로 유의미한 조직 외편 시스템 내에서 발아 역학을 정량화함으로써 발견 생물학(discovery biology)과 전임상 평가 사이의 가교 역할을 합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 혈관 신생 경로의 유전적 또는 약리학적 조절에 반응하여 맥락막의 발아를 측정함으로써 치료 가설을 검증합니다.
- 운영적 가치: 내피세포, 대식세포, 주변세포 및 RPE를 포함하는 다세포 조직 환경에서 FFAR4와 같은 표적의 기능적 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 시간에 따른 화합물의 미세혈관 발아에 대한 용량 의존적 효과를 정량화하여 포트폴리오 우선순위 결정을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 제어된 조건 하에서 미세혈관 네트워크 형성을 반영하는 발아 면적의 정량적 이미지 기반 판독값을 생성합니다.
- 운영적 가치: 실험 간 재현성을 보장하기 위해 성장 인자가 감소된 BME 내의 표준화된 외식편 도말법과 정해진 배지 교체 일정을 사용합니다.
- 확장성: 24-well 플레이트 형식 및 반자동 ImageJ 분석과 호환되어 중고처리량 화합물 스크리닝이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 고유의 맥락막-망막색소상피-공막 구조를 유지하여, 병리생리학적 혈관 신생 모델링에 중요한 세포 간 상호작용을 보존합니다.
- 운용적 가치: 야생형과 녹아웃 조직(예: FFAR4)을 직접 비교할 수 있어, 발아 표현형에 대한 유전적 기여도를 분리하여 분석할 수 있습니다.
- 예측적 가치: 혈관 발아에 대한 작용제/길항제의 효과 평가가 가능하여, 경로 조절에 대한 전임상 근거를 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 타겟 검증부터 리드 최적화, 그리고 전임상 효능 시험에 이르기까지 안과학 연구의 연속적인 과정에 부합하며, 특히 AMD의 항혈관생성 전략에 유용합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 경로 억제 또는 활성화에 따른 발아 변화를 정량화함으로써 혈관 신생 조절 인자의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 조직 기반 포맷에서 화합물 효과의 순위 결정을 가능하게 하는 재현 가능하고 정량적인 발아 지표를 제공합니다.
- 분석(Analytics): 미세혈관 반응의 역학 분석을 지원하는 시간 분해능의 면적 기반 측정(예: 3일 차에서 6일 차까지)을 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 질환 관련 이식편을 사용하여 맥락막 신생혈관을 모델링하며, 이를 통해 in vivo AMD 모델로의 외삽을 용이하게 합니다.
- 기업적 재사용(Enterprise Reuse): 여러 프로젝트에 걸쳐 다양한 화합물이나 유전적 모델을 평가할 수 있는 표준화된 재사용 가능 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 유전적 또는 약리학적 섭동을 실제 조직 환경 내의 정량 가능한 발아 결과와 연결함으로써 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 조직 분리, BME 플레이팅, 배지 교체 및 이미지 분석 프로토콜을 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: in vivo 테스트 전, 조직 기반의 항혈관 형성 활성에 대한 조기 근거를 제공하여 go/no-go 결정 능력을 향상시킵니다.
- 포트폴리오 영향: 용량 반응 및 유전적 검증 데이터를 바탕으로 화합물의 위험 조정 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 멸균 상태에서 마우스 조직 해부 및 외식편(explant) 분리에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 성장 인자가 감소된 기저막 추출물(BME) 및 위상차 현미경 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 일관된 발아(sprouting) 정량을 위해 표준화된 이미지 분석 워크플로우(예: ImageJ 매크로)가 필요합니다.
- 발아 지표를 해석할 때 외식편의 크기와 조직 생존율의 가변성을 고려해야 합니다.
- 마우스 조직으로 제한되며, 종 간 차이로 인해 인간 맥락막 생물학으로의 전이 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
