Name: 안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 학습하세요 안구 미세 혈관 신생을 연구하는 코로이드 발아 분석법으로, 쥐 조직을 이용해 황반변성 치료제를 평가하고 혈관증식 경로를 분석하는 방법입니다. 이 기법은 약물 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 만페이 스즈키 당뇨병 재단 (YT), 보스턴 아동 병원 OFD / BTREC / CTREC 교수 진로 개발 보조금, 보스턴 아동 병원 안과 재단, BCH 파일럿 상, BCH 맨튼 센터 펠로우십의 보조금에 의해 지원되었다, 리틀 기린 재단 (ZF), 독일 연구 재단 (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD)

설명된 모든 동물 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (ARCH 프로토콜 번호 19-04-3913R).
1. 준비
<ol><li>페니실린/스트렙토마이신(10000 U/mL)과 5mL 및 10mL의 상용 보충제를 500mL의 완전한 클래식 매체에 추가합니다. Aliquot 50 mL 의 배지 는 처음에. 참고: 오염을 방지하기 위해 배지를 재고로 되돌리지 마십시오.</li>
	<li>얼음에 완전한 클래식 매체의 알리쿼트를 넣습니다.</li>
	<li>70%의 에탄올을 사용하여 해부하는 현미경, 집게 및 가위를 청소하십시오.</li>
	<li>2개의 세포 배양 접시 (10cm), 해부 현미경에 하나, 얼음에 하나 준비; 각 접시에 완전한 클래식 매체 10 mL을 넣습니다.</li>
</ol>2. 실험 단계(그림 1)
<ol><li>산후 (P) 주위에 C57BL/6J 마우스를 희생 (P) 20 75-100 mg/kg 케타민과 7.5-10 mg/kg 자일라진 주입을 사용 하 여. 해부 전에 얼음에 완전한 고전적인 매체에 눈을 유지합니다.</li>
	<li>눈에 결합 조직 (근육과 지방 조직) 및 시신경을 제거합니다.</li>
	<li>마이크로 가위를 사용하여 0.5mm 후방을 각막 limbus로 원주 절단합니다. 각막/홍채 복합체, 유리체 및 렌즈를 제거합니다.</li>
	<li>시신경을 향해 절단 가장자리에 수직으로 1mm 절개를 하고 1mm 너비의 할례 밴드를 자릅니다. 복합체의 중앙 및 주변 영역을 분리합니다. 집게를 사용하여 RPE/choroid/sclera 복합체에서 망막을 벗깁니다.</li>
	<li>주변 초보 밴드를 얼음에 완벽한 클래식 매체로 유지하십시오. 다른 눈을 분리하고 두 번째 밴드를 잘라 과정을 반복합니다.</li>
	<li>원형 밴드를 6 ~동등한 사각형 조각 (~1mm x 1mm)으로 자른다. 참고: 가장자리를 만지지 마십시오.</li>
	<li>제조의 지시에 따라 기저막 추출물(BME)을 해동합니다. 24 개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물의 중심에 30 μL / 웰BME를 추가합니다. BME의 액적가장자리가 가장자리를 건드리지 않고 플레이트 바닥에 볼록돔을 형성해야 합니다. 참고 : 냉장고에서 하룻밤 BME를 해동하십시오. BME는 해동 후 언제든지 얼음위에 있어야 합니다.</li>
	<li>BME의 중간에 조직을 배치합니다. 참고 : 코로이드 축출을 평평하게하지 마십시오; 일반적으로, 조직이 BME 내에서 확장하자. 조직의 방향 (경피측 위 또는 아래) 실험 결과에 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>37°C에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 젤이 고화하게 합니다.</li>
	<li>전체 클래식 중간/웰의 500 μL을 추가합니다.</li>
	<li>격일(500 μL)의 클래식 매체를 변경합니다. 코로이드 발아는 현미경으로 3 일 후에 관찰 될 수있다. 참고: 성장 인자 치료를 위해 4 시간 동안 조직을 굶어. 성장 인자 감소 매체에서 시험 화합물을 희석 (1:200 대신 부스트 1:50).</li>
</ol>3.SWIFT-코로이드 전산화 정량화 방법17 (도 2)
참고: 성장하는 선박이 적용되는 영역을 측정하는 전산화 된 방법이 사용되었습니다. ImageJ 소프트웨어에 대한 매크로 플러그인은 정량화 하기 전에 필요합니다(자세한 내용은 추가 정보 참조).
<ol><li>ImageJ로 코로이드 발아 이미지를 열고"이미지 | 유형| 회색눈금으로 8비트"</li>
	<li>"이미지| 조정 | 밝기/콘트라스트(Ctrl/shift/C)" 및 콘트라스트를 최적화합니다.</li>
	<li>마법 지팡이 기능을 사용하여 새싹 중앙에 존재하는 코로이드 조직을 이미지에서 윤곽을 그리고 제거합니다(바로 가기 키"F1")(그림2A, B). 참고: 마법 지팡이의 허용 오차 속도를 20-30%로 설정합니다.</li>
	<li>무료 선택도구(그림 2C)로이미지의 배경을 제거합니다. "이미지| 조정 | 임계값(Ctrl/shift/T)". 임계값 함수를 사용하여 배경 및 주변부(그림2D)에대해 미세 혈관 새싹을 정의합니다.</li>
	<li>"F2"를클릭하면 요약이 나타납니다. "저장"을 클릭하여 선택한 영역의 이미지를저장합니다. 향후 참조를 위해 원본 이미지와 동일한 폴더에 저장합니다.</li>
	<li>샘플 그룹을 측정한 후 데이터 분석을 위해 기록된 샘플을 복사합니다. 참고:"분석| 스케일 바가 있는 이미지를 사용하여 "배율"을 설정합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+in+the+pathogenesis+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).</li>
<li>Pemp, B., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+blood+flow+in+diabetes+and+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration.</a> Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).</li>
<li>Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+in+retinal+homeostasis+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyslipidemia+in+retinal+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dyslipidemia in retinal metabolic disorders.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).</li>
<li>Daruich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+macular+edema%3A+Beyond+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of macular edema: Beyond the surface.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting+FGF21+Inhibits+Retinal+Vascular+Leakage+in+In+Vivo+and+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).</li>
<li>Maisto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19-derived+VEGF-containing+exosomes+promote+neovascularization+in+HUVEC%3A+the+role+of+the+melanocortin+receptor+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5.</a> Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).</li>
<li>Mazzoni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Apcdd1+Coordinates+Vascular+Remodeling+and+Barrier+Maturation+of+Retinal+Blood+Vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels.</a> Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).</li>
<li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adiponectin+Mediates+Dietary+Omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acid+Protection+Against+Choroidal+Neovascularization+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Oxidase+2C+Inhibition+Adds+to+omega-3+Long-Chain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Protection+Against+Retinal+and+Choroidal+Neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Bellacen, K., Lewis, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Aortic ring assay.</a> Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).</li>
<li>Masson, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Aortic+Ring+Assay%3A+A+New+Approach+of+the+Molecular+Genetics+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis.</a> Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).</li>
<li>Katakia, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+model+for+studying+endothelial+tip+cells%3A+Revisiting+the+classical+aortic-ring+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay.</a> Microvascular Research. 128, 103939(2020).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+retina+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).</li>
<li>Rezzola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ex+vivo+murine+retina+angiogenesis+%28EMRA%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay.</a> Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).</li>
<li>Shao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+sprouting+assay%3A+an+ex+vivo+model+of+microvascular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis.</a> PLoS One. 8 (7), 69552(2013).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acid+receptor+4+activation+protects+against+choroidal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice.</a> Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIST1+promotes+pathological+ocular+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis.</a> Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).</li>
<li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+microRNA-150+is+an+intrinsic+suppressor+of+pathologic+ocular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncEGFL7OS+regulates+human+angiogenesis+by+interacting+with+MAX+at+the+EGFL7%2FmiR-126+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus.</a> Elife. 8, 40470(2019).</li>
<li>Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+angiogenesis+of+cultured+choroidal+tissues+in+streptozotocin-diabetic+Wistar+and+spontaneously+diabetic+GK+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats.</a> Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effects+of+tetrandrine+and+related+synthetic+compounds+on+angiogenesis+in+streptozotocin-diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).</li>
<li>Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine+proliferated+CD34%28%2B%29+cells+from+rat+choroidal+explant+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).</li>
<li>Kobayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction+of+N%28epsilon%29-%28carboxymethyl%29lysine-induced+neovascularization+in+cultured+choroidal+explant+of+streptozotocin-diabetic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+and+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).</li>
<li>Bergers, G., Song, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+pericytes+in+blood-vessel+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance.</a> Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).</li>
<li>Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to%3A+Phenotypic+plasticity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells.</a> British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).</li>
</ol>

저자는 재정 적 공개가 없습니다. 전산화 된 방법은 저자를 통해 교육 기관에 무료로 사용할 수 있습니다.

천로이드 발아 분석체는 NEovascular AMD9,10,18,19,20에서연구를 돕습니다. 초로이드 이질은 쥐뿐만 아니라 쥐와인간(17,21)으로부터분리될 수 있다. choroid 축출에는 EC, 대식세포 및 pericytes17이포함됩니다. 이 분석에서 choroidal IC와 RPE 세포와 같은 인접 한 세포 간의 상호 작용, choroidal 혈관 성장에 관련 된 메커니즘을 해명 하는 데 도움이(17). 또한, 이러한 재현 가능한 반자동 평가 ...

Choroidal 혈관 신생 이소화 조절은 신생 혈관 노화 관련 황반 변성 (AMD)1과관련이 있습니다. choroid는 망막 색소 상피 (RPE) 아래에 존재하는 미세 혈관 침대입니다. 코로이드의 혈류감소는 AMD2의진행과 관련이 있는 것으로 나타났다. 혈관 내피, RPE, 대식세포, 회낭체 및 기타 세포 사이의 복잡한 관계는 조직3,4,5의항상성에 대한 책임이 있다. 따라서, 재현 가능한 분석 모델링 choroidal 마이크로 환경은 neovascular AMD의 연구에 대 한 중요 한.
전 생체 혈관 신생 분석 및 체외 내피 세포 배양은 생체 내 미생물 의 행동, 신약 테스트 및 병인의 연구를 보완 할 수 있습니다. 인간 망막 미생물 내피 세포(HRMEC), 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC), 격리된 원발성 동물 뇌 또는 망막 IC와 같은 내피 세포는 종종 안구 혈관 신생 연구6,7,8을위한 체외 연구에서 사용된다. 특히 HRMEC는 내피증, 이주, 관 형성 및 혈관 누설을 평가하여 체외 외 혈관 신생혈관화(CNV)9의 모델로 널리 사용되어 내정간섭6,10을평가한다. 그러나, 배양에 있는 EC는 choroid에서 찾아낸 그밖 세포 모형과의 상호 작용의 부족 때문에 CNV의 모형으로 제한되고 이 소집에서 이용되는 대부분의 EC는 choroid에서 유래하지 않기 때문에. 마우스 코로이드 EC는 문화권에서 분리하고 유지하기가 어렵습니다.
대동맥 고리 분석은 매크로 혈관 증식의 모델로 널리 사용된다. 대동맥 각출소에서 혈관 새싹은 EC, 백혈구 및대식세포(11)를포함한다. 대동맥 고리 분석모델은 큰 혈관 혈관신생을 잘12,13,14로모델한다. 그러나, 대동맥 고리로서 코로이드 외혈관화의 모델로서 한계가 있어 특징적인 초로이드 미생물 혈관 환경이 결여된 대색조직이며, 큰 혈관으로부터의 새싹은 미생물 병리학에 관여하는 모세관 네트워크로부터 새싹과 다를 수 있다. 최근 그룹은 전 생체 망막 분석15,16을발표했다. 망막 신혈관 질환에 적합하지만 AMD에서 볼 수 있듯이 코로이드 신혈관화에는 적합하지 않습니다.
마우스 RPE, 코로이드 및 경마 성 이식 조직을 이용한 코로이드 발아 분석체는 CNV를 더 잘 모델링하기 위해 개발되었다. 조직은 마우스 (또는 다른 종) 눈(17)로부터쉽게 분리 될 수 있습니다. 이 분석법은 약리학적 화합물의 프로 및 항 혈관 신생 잠재력의 재현 가능한 평가 및 유전자 변형 마우스로부터 조직을 사용하여 코로이드 신생 혈관화에서 특정 경로의 역할의 평가 및 제어18을허용한다. 이 코로이드 발아 분석체는 많은 후속 간행물9,10,18,19,20에서참조되었다. 여기서, 이 분석법의 사용에 관여하는 방법이 입증된다.

<table><tbody><tr><td>AnaSed (Xylazine)</td> <td>AKORN</td><td>59339-110-20</td><td></td></tr><tr><td>기저 막 추출물 (BME) Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>NEST</td><td>704001</td><td>10cm</td></tr><tr><td>혈청 및 CultureBoost 세포 시스템이 포함 된 완전한 클래식 배지</td><td></td><td>4Z0-500</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 200 Proof</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>70 % 사용 </td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>ZEISS</td><td>Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td>10000 U/mL</td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트(24-well)</td><td>Olympus</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>VetaKet CIII(케타민)</td><td>AKORN</td><td>59399-114-10</td><td></td></tr></tbody></table>

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

An Ex Vivo Choroid Sprouting Assay of Ocular Microvascular Angiogenesis

노화와 관련된 황반 변성의 현저한 특징인 병리학적인 천동 혈관신생은 시력 장애와 실명으로 이어집니다. 인체망막 내피 세포(EC) 증식 분석(HRMEC) 또는 분리된 1차 망막 IC를 이용한 증식 분석은 생체외 모델에서 망막 혈관신생을 연구하는 데 널리 사용된다. 그러나, 순수한 뮤린망 내피 세포를 격리하는 것은 기술적으로 도전적이고 망막 EC는 choroidal 내피 세포 및 다른 세포/세포 상호 작용과 다른 증식 반응을 가질 수 있다. 초로이드 미생물 증식의 모델로서 매우 재현 가능한 전 생체 균 발아 분석이 개발되었다. 이 모형은 choroid 혈관분기 (EC, 대식세포, pericytes) 및 망막 안료 상피 (RPE)사이 상호 작용을 포함합니다. 마우스 RPE/choroid/scleral 이병은 성장 인자 감소 기막 추출물(BME)(일 0)에서 분리되고 배양됩니다. 배지는 격일로 변경되고 코로이드 발아는 6일째에 정량화된다. 개별 choroid explant의 이미지는 반전된 상 현미경으로 촬영되고 발아 영역은 이 실험실에서 개발된 ImageJ 소프트웨어에 반자동 매크로 플러그인을 사용하여 정량화됩니다. 이 재현 가능한 ex vivo choroidal 발아 분석은 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 choroidal 마이크로 혈관 증식에 관여하는 경로를 평가하기 위해 잠재적 인 치료 및 마이크로 혈관 질환 연구에 대한 화합물을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

하루에 빛나는 choroid 의 성장의 비교
우리는 BME에 내장 된 sclera로 choroid를 해부하고 6 일 동안 배양(그림 1). 3일부터 6일까지 C57BL/6J 마우스에서 의초로이드 발아는 현미경으로 검사되었고 IMAGEJ에서 반자동 정량화 방법인 SWIFT-Choroid로 정량화되었다. 대표적인 경우, 축출면적(축출자체를 제외한 각성으로부터 연장된 혈관)은 3일째 0.38mm2(그림 3A),4일째 1.47mm2(그림 3B),5.62mm2(그림 3C),6일째 10.09mm2일(그림 3D)이었다.<...

이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

Pathological choroidal angiogenesis, a salient feature of age-related macular degeneration, leads to vision impairment and blindness. Endothelial cell ...

이 맥락막 분석은 재현성이 높고 맥락막 혈관 형성 연구 및 연령 관련 황반 변성과 관련이 있으며, AMD는 미세 혈관 거동에 대한 생체 내 연구를 보완할 수 있습니다. 이 분석법은 신생혈관 AMD에 대한 잠재적 치료법으로 화합물을 스크리닝하거나 야생형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 맥락막 신생혈관형성과 관련된 경로를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 500ml의 혈청이 함유된 완전한 클래식 배지에 500ml의 페니실린, 스트렙토마이신, 10-5mL의 시판 보충제를 첨가한 다음 50ml의 배지를 분취하여 기저막 추출물 또는 BME를 섭씨 2도에서 8도의 냉장고에서 밤새 해동합니다.완전한 클래식 미디엄의 부분 표본을 얼음 위에 놓습니다. 해부 현미경, 집게 및 가위를 70% 에탄올로 청소합니다. 세포 배양 접시를 준비하고 하나는 해부 현미경에, 다른 하나는 얼음에 놓습니다.그런 다음 각 요리에 10ml의 완전한 클래식 미디엄을 추가합니다. 해부하기 전에 얼음 위에서 눈을 완전히 고전적인 매체에 보관하십시오. 결합 조직과 시신경을 제거한 다음 마이크로 가위를 사용하여 각막 가장자리에서 0.5mm 후방으로 원주 방향으로 자릅니다.각막, 홍채 복합체, 유리체 및 수정체를 제거합니다. 절단된 가장자리에서 시신경을 향해 수직으로 1mm를 절개하고 둘레 1mm 너비의 띠를 자른 다음 복합체의 중앙 영역과 주변 영역을 분리합니다. 집게를 사용하여 RPE 맥락막 공막 복합체에서 망막을 벗겨냅니다.주변 맥락막 밴드를 얼음 위의 완전한 클래식 매체로 유지하십시오. 다른 쪽 눈을 분리하고 이 과정을 반복하여 두 번째 밴드를 자릅니다. 원형 밴드를 거의 동일한 정사각형 조각으로 5-6 개로 자릅니다.30마이크로리터의 해동된 BME를 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰 중앙에 추가합니다. BME의 물방울이 가장자리를 건드리지 않고 플레이트 바닥에 볼록한 돔을 형성하는지 확인하십시오. 조직을 BME의 중앙에 놓습니다.맥락막 X 식물을 평평하게 만들지 마십시오. 조직이 BME 내에서 확장되도록 합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양하여 젤이 굳어지도록 한 다음 각 웰에 500마이크로리터의 완전한 클래식 배지를 추가합니다.클래식 매체를 격일로 바꾸십시오. 맥락막 발아는 현미경으로 3일 후에 관찰할 수 있습니다. 이미지 J가 있는 맥락막 발아 이미지를 열고 그레이 스케일로 이미지, 유형 및 8비트를 확인합니다.그런 다음 이미지를 선택하고, 조정하고, 밝기 대비를 조정하고, 조정하여 대비를 최적화합니다. 마술 지팡이 기능을 사용하여 새싹 중앙에 있는 맥락막 조직의 윤곽을 잡고 제거합니다. 무료 선택 도구를 사용하여 이미지의 배경을 제거합니다.다음으로, image(이미지)로 이동하여 threshold를 조정하고 threshold 함수를 사용하여 주변부의 배경에 대한 미세혈관 새싹을 정의합니다. F2를 클릭하면 요약이 나타납니다. 저장을 클릭하여 나중에 참조할 수 있도록 원본 이미지와 동일한 폴더에 선택한 영역의 이미지를 저장합니다.샘플 그룹을 측정한 후 분석을 위해 기록된 데이터를 복사합니다. 이 프로토콜은 3일째부터 6일째까지 C 57, 검은색 6J 마우스에서 발아하는 맥락막을 검사하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 대표적인 사례로, 맥락막 발아 면적은 3일, 4일, 5일, 6일에 각각 0.38, 1.47, 5.62 및 10.09mm였습니다.맥락막 혈관 발아에 대한 FFAR4 손실의 영향은 FFAR4 4 녹아웃 및 FFAR4 야생형 마우스에서 맥락막 발아 분석을 사용하여 평가되었습니다. FFAR4 녹아웃 마우스의 발아 영역은 6일째에 FFAR4 야생형에 비해 맥락막 혈관 성장을 증가시켰습니다. 또한, 1개의 마이크로몰 FFAR4 작용제로 치료한 결과, 6일째에 치료되지 않은 마우스에 비해 맥락막 발아 영역이 감소했습니다.이 분석을 통해 약리학적 화합물의 항 혈관신생 가능성과 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 맥락막 신생혈관형성에서 특정 경로의 역할 변화를 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.

an-ex-vivo-choroid-sprouting-assay-ocular-microvascular

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

각막은 혈관 조직이 부족한다는 점에서 고유합니다. 그러나, 강력한 혈관의 성장과 생존은 강력한 angiogenic 요인에 의해 각막에 유도된 수 있습니다. 따라서 각막이 우리와 함께 angiogenic 연구 가치있는 도구를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 각막 포켓 분석 방법과이 모델을 사용 angiogenic 요인에 의해 유발 angiogenesis을 평가의 마우스 모델을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

이 동영상은 혈관신생 초기 단계에서 내피 발아를 연구하기 위해 주피세포를 통합한 변형된 마이크로캐리어 비드 기반 분석을 보여줍니다. 이 분석은 혈관 신생의 분자 메커니즘과 항 혈관 유전 치료의 효과를 이해하기 위한 체외 실험 모델을 제공합니다.

초기 단계 혈관 형성 평가를 위한 비드 발아 분석: 주피세포가 있는 곳에서 발아하는 내피를 연구하기 위한 체외 비드 기반 모델

이 비디오는 안구 미세혈관 신생을 연구하기 위한 맥락막 발아의 생체 외 모델 개발을 보여줍니다. 이 분석은 맥락막 미세혈관 발아를 촉진하는 특정 조건에서 공막과 망막 색소 상피에 부착된 맥락막 조직을 포함하는 쥐 눈 외식물을 배양하는 것을 포함합니다.

생체 외 안구 미세혈관 증식을 연구하기 위한 맥락막 발아 분석

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

이 프로토콜은 생쥐에서 개발로 각막 micropocket 분석에 대해 설명합니다.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

혈관 형성은 생리학적으로 관련된 환경에서 조사해야 하는 다세포, 다중 시스템 상호 작용을 포함합니다. 이 연구의 목적은 혈관 형성 중 온전한 미세혈관 네트워크의 타임 랩스 비교를 수행하는 쥐 장간막 배양 모델의 능력을 입증하는 것입니다.

<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 방법 배양 된 쥐 장간막 미세 혈관 네트워크의 타임 랩스 영상에 대한

이 종이 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 hemangioblastomas (HBs)와 HBs에서의 역할에 있는 포괄적인 절차를 제공 합니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 형태의 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

이 방법은 표준화된 미세 유체 플랫폼에서 40개의 교류 3D 마이크로혈관으로서 iPSC 유래 내피 세포의 배양을 기술한다. 이 플랫폼은 확장 가능하고 처리량이 높은 방식으로 혈관 신생 콩나물의 해부학 및 안정화를 포함하여 3D로 그라데이션 구동 혈관 신생 발아를 연구 할 수 있습니다.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

발아 및 질병의 기본이 되는 발아 혈관 신생은 복잡한 분자 및 기계적 과정을 포함합니다. 우리는 돼지 경동맥에서 발아하는 세포를 분석하여 강성 의존적 혈관 신생과 뚜렷한 리더-추종자 세포 역학을 밝히는 다재다능한 2.5D 생체 외 모델을 제시합니다. 이 모델은 조직 공학 전략 및 암 치료 접근 방식을 발전시키는 데 도움이 됩니다.

2.5D 모델: 생체 조직에서 발아 혈관 형성의 생체 외 기계적 특성화를 위한 모델

학습하세요 안구 미세 혈관 신생을 연구하는 코로이드 발아 분석법으로, 쥐 조직을 이용해 황반변성 치료제를 평가하고 혈관증식 경로를 분석하는 방법입니다. 이 기법은 약물 개발에 활용됩니다.

안구 미세 혈관 신생의 전 비보 코로이드 발아 분석

더 많은 동영상 탐색